Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления об особенностях приживления сквозного трансплантата роговицы при кератопластике высокого риска и методах профилактики развития реакции отторжения(обзор литературы)
1.1. Проблема кератопластики высокого риска на современном этапе
1.2. Синдром лимбальной недостаточности как фактор риска развития реакции отторжения трансплантата роговицы при кератопластике высокого риска
1.3. Учение о гематоофтальмическом барьере и привилегированности роговицы в свете приживления сквозного трансплантата роговицы
1.4. Роль цитокинов в формировании реакции отторжения сквозного трансплантата роговицы
1.5. Достоинства и недостатки медикаментозной иммуносупрессивной терапии
1.6. Клеточная терапия как альтернатива фармакологической иммуносупрессии.
1.7. ММСК-подобные клетки лимба
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований
2.1. Характеристика материалов и методов исследования на доклиническом этапе
2.1.1. Общая характеристика материала на доклиническом этапе исследований
2.1.2. Разработка технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
2.1.3. Разработка технологии кригенной консервации аллогенных фрагментов лимба
2.1.4. Разработка технологии вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации
2.1.5. Характеристика методов исследования на доклиническом этапе
2.2. Характеристика материалов и методов исследования на клиническом этапе
2.3. Методы статистической обработки результатов исследований
ГЛАВА 3. Результаты экспериментальных исследований предоперационной подготовки аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
3.1. Результаты разработки техники выделения фрагментов лимба из трупных донорских глаз
3.2. Результаты разработки технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
3.3. Разработка технологии криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
3.4. Разработка технологии вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации
3.5 Резюме
ГЛАВА 4. Результаты клинических исследований сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами у реципиентов при кератопластике высокого риска
4.1. Особенности формирования групп пациентов с кератопластикой высокого риска на основе результатов клинико-цитохимического прогнозирования
4.2. Техника сотрансплантации донорской роговицы и аллогенных фрагментов лимба, прошедших предоперационную подготовку по разработанной технологии
4.3. Результаты клинических исследований функциональной активности аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами у реципиентов при кератопластике высокого риска
4.4. Результаты клинических исследований эффективности сотрансплантации аллогенных лимбальных фрагментов в профилактике отторжения донорских роговиц при кератопластике высокого риска
4.5. Резюме
Заключение и обсуждение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Учение о гематоофтальмическом барьере и привилегированности роговицы в свете приживления сквозного трансплантата роговицы
- Разработка технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
- Разработка технологии криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
- Техника сотрансплантации донорской роговицы и аллогенных фрагментов лимба, прошедших предоперационную подготовку по разработанной технологии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Реакция тканевой несовместимости после кератопластики является одной из главных причин стойкого помутнения трансплантата роговицы и развивается у 5-70% пациентов в зависимости от исходной патологии и сроков послеоперационного наблюдения (Борзенок С.А., 1995, 2008; Комах Ю.А., 1995; Ченцова Е.В., 1996; Балаян Т.Г., 2008; Dua H.S., Azuara-Blanco A., 1999; Hill J.C., 2002).
Операции по пересадке трупных донорских роговиц пациентам с осложненными ожоговыми бельмами, васкуляризированными бельмами инфекционно-воспалительного генеза, помутнением трансплантата роговицы принято относить к кератопластике высокого риска (Копаева В.Г., 2002; Макаров П.В. и др., 2007; Балаян Т.Г., 2008; Rumelt S. et al., 2002; Kaminska A. et al., 2005; de Freitas A.M. et al., 2006).
В настоящее время профилактика возникновения реакции отторжения трансплантата донорской роговицы осуществляется исключительно посредством проведения локальной и системной иммуносупрессивной фармакотерапи. Однако локальное применение препаратов-иммуносупрессантов (глюкокортикоидов и цитостатиков) ограничено их недостаточным терапевтическим действием, а при системном и длительном применении – возникновением гепатопатий, нефропатий, вторичного иммунодефицита, активацией латентных вирусных инфекций (Каспаров А.А. и др., 2002; Кугушева А.Э., 2013; Robert P.Y. et al., 2001; Pleyer U., 2003; Tabbara K.F., 2008). Также известно, что 46% реципиентов с пересадкой донорской роговицы проявляют резистентность к иммуносупрессивной терапии (Балаян Т.Г., 2008). В этой связи проблема поиска инновационных методов профилактики отторжения донорских роговиц представляется актуальной.
В последние годы значительный интерес трансплантологов проявляется к малой иммуносупрессивной терапии посредством использования клеточно-тканевых сотрансплантатов с заданными функциональными свойствами (Шумаков В.И. и др., 2009; Готье С.В., 2011; Starzl T.E., 2004; Girlanda R. et al., 2007). Изучение свойств мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга позволило установить, что они способны индуцировать иммунную толерантность при аллотрансплантации органов и тканей. Индукция иммунной толерантности происходит за счет блокировки активности эффекторных Т-клеток при аллогенной пересадке клеточно-тканевых сотрансплантатов (Majumdar M.K. et al., 2003), активации пролиферации Т-регуляторных клеток с супрессивными свойствами, стимуляции синтеза противовоспалительных пептидов и цитокинов (Aggarwal S., 2005), активации механизмов клеточной репарации и пролиферации в донорских тканях и органах (Шумаков В.И., 2009).
Особую роль в формировании иммунной толерантности играют неклассические молекулы HLA класса I (Rouas-Freiss N. et al. 1997; Hviid T.V., 2006). Так, экспрессия HLA-G создает условия толерантности, при которых аллогенные клетки, ткани и органы избегают иммунного надзора (Lila N. et al., 2001, 2002; Rieger L. et al., 2002; Hviid T.V. et al., 2005). В литературе представлены единичные работы, описывающие результаты исследования экспрессии молекул HLA-G при аллогенной трансплантации почки (Jin H.L. et al., 2012), легкого (Brugiere O. et al., 2009), кожи (Carosella E.D. et al., 2008), а также при других патологических состояниях (Gonzalez A. et al., 2012). Феномен экспрессии молекул HLA-G также описан и для различных клеточных популяций роговицы как в норме, так и при патологии (Le Discorde М. et al. 2003; Higa K. et al. 2006). Недавно обнаружены мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) в глубоких слоях лимба глазного яблока (Du Y. et al. 2005; Polisetty N. et al., 2008; Li G.G. et al., 2010; Lim M.N. et al., 2012), реализующие эффект физиологической и репаративной регенерации роговицы (Du Y. et al. 2005; Dravida S. et al., 2005; Choong P.F. et al., 2007; Blazejewska E.A. et al., 2009). В этой связи при ряде патологических состояний некоторые офтальмологи производят трансплантацию аллогенных лимбальных фрагментов (Tsubota K. et al., 1999; James E.S. et al., 2001) и аутологичных лимбальных фрагментов, выделенных с парного глаза реципиента (Grueterich M. et al., 2002).
Однако операции по трансплантации фрагментов лимба до настоящего времени не получили широкого распространения в связи с неоднозначностью представленных в литературе результатов их биологического действия, техническими сложностями их выделения, угрозой развития синдрома лимбальной недостаточности у реципиентов на парном глазу, риском отторжения аллогенных лимбальных трансплантатов и необходимостью длительного проведения иммуносупрессивной фармакотерапии.
В этой связи представляется актуальной разработка поэтапной технологии хирургического выделения, консервации и сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба при кератопластике высокого риска, направленной на медико-социальную реабилитацию тяжелой категории пациентов.
Цель исследования
Разработка технологии предоперационной подготовки и сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами для профилактики отторжения донорских роговиц при кератопластике высокого риска.
Задачи исследования
1.Разработать технику микрохирургического выделения аллогенных фрагментов лимба из глаза донора-трупа с учетом топографо-анатомических особенностей расположения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток.
2.Разработать технологию органопипической и криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами.
3.Изучить в эксперименте морфологическую характеристику и функциональную активность аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами, подготовленных по предложенной технологии.
4.Изучить в клинике функциональную активность аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами, подготовленных по предложенной технологии, у реципиентов при кератопластике высокого риска.
5.Изучить в клинике эффективность сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба, подготовленных по предложенной технологии, в профилактике отторжения донорских роговиц при кератопластике высокого риска.
Научная новизна результатов исследования
Определены топографо-анатомические зоны лимба, имеющие наибольшее скопление ММСК, на основе которых разработаны оптимальные подходы к технике микрохирургического выделения АФЛ из глаза донора-трупа для сотрансплантации при СКП высокого риска.
Установлен оптимальный период первичной органотипической консервации АФЛ равный 21-28 суткам, в процессе которого происходит экспрессия растворимой молекулы HLA-G5 (маркера иммунной толерантности клеток) на ММСК и максимальное накопление противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGF) в консервационной среде.
Установлено, что оптимальный период вторичной органотипической консервации дефростированных АФЛ после криогенного хранения в Глазном тканевом банке равен 7-14-ти суткам и характеризуется восстановлением активности растворимой молекулы HLA-G5 (маркера иммунной толерантности клеток) на ММСК и максимальным накоплением противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGF) в консервационной среде.
Установлено, что сотрансплантация АФЛ, прошедших предоперационную подготовку по предложенной технологии, при СКП высокого риска способствует повышению доли прозрачных приживлений донорских роговиц на 16,4% и снижению потери эндотелиальных клеток трансплантата роговицы на 9,7% в течение 1-го года после операции.
Установлена высокая информативность метода мониторинга провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в СЖ для прогнозирования прозрачного приживления трансплантатов роговицы и кризов отторжения после СКП высокого риска.
Практическая значимость результатов исследования
Разработанная технология предоперационной подготовки АФЛ включает два этапа: микрохирургическое выделение и консервацию клеточно-тканевого трансплантата. Первый этап – микрохирургическое выделение АФЛ из глаза донора-трупа, – должен проводиться в сроки до 18-ти часов после смерти донора с целью сохранения максимального резерва жизнеспособных клеток лимба. Техника микрохирургического выделения АФЛ позволяет сохранять герметичность глазного яблока для одномоментного выкраивания сквозного трансплантата роговицы из одного глаза донора-трупа. Второй этап – первичная органотипическая консервация, криоконсервация и дефростация, вторичная органотипическая консервация АФЛ, – необходим для активации функциональных (иммуносупрессивных, толерогенных и пролиферативных) свойств ММСК АФЛ с оптимальными сроками достижения этого эффекта на 21-28-е сутки консервации в жидких средах.
Среда Борзенка-Мороз (Раствор для хранения роговицы), разрешенная в Российской Федерации для клинического применения в офтальмологии, пригодна для органотипической консервации ММСК АФЛ, выделенных по предложенной технологии.
Предложенная технология криогенной консервации АФЛ, предварительно прошедших стадию первичной органотипической консервации, позволяет длительно сохранять ММСК АФЛ в жизнеспособном состоянии; включает обязательный этап вторичной (предоперационной) органотипической консервации в течение 7-14-ти суток перед клиническим применением для восстановления функциональной активности ММСК АФЛ.
Одновременная сотрансплантация донорской роговицы и АФЛ с иммуносупрессивными свойствами, прошедших предоперационную подготовку по предложенной технологии, позволяет повысить количество прозрачных приживлений донорских роговиц при кератопластике высокого риска на 16,4% и снизить потерю эндотелиальных клеток трансплантата роговицы на 9,7% в течение 1-го года после операции.
Методика мониторинга локальной иммуносупрессии, включающая определение концентрации провоспалительных, противовоспалительных цитокинов, растворимой молекулы HLA-G5 в СЖ, у реципиентов после СКП высокого риска позволяет прогнозировать развитие кризов отторжения трансплантата роговицы.
Основные положения, выносимые на защиту
1.Технология предоперационной подготовки выделенных с помощью микрохирургической техники АФЛ позволяет получать максимальное количество ММСК в минимальном объеме тканевого трансплантата и активировать их иммуносупрессивные, толерогенные и пролиферативные свойства в процессе органотипической консервации в среде Борзенка-Мороз и других жидких средах.
2.Оптимальный период первичной органотипической консервации АФЛ равен 21-28 суткам и характеризуется активацией синтеза противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGF) и растворимой молекулы HLA-G5 (маркера иммунной толерантности) ММСК; криогенная консервация АФЛ, предварительно прошедших стадию первичной органотипической консервации, длительно сохраняет ММСК в жизнеспособном состоянии в условиях криобанка (до 24 месяцев), но после размораживания АФЛ требуется проведение вторичной органотипической консервации в течение 7-14-ти суток.
3.Сотрансплантация АФЛ с иммуносупрессивными свойствами, прошедших предоперационную подготовку по предложенной технологии, позволяет повысить количество прозрачных приживлений трансплантатов донорских роговиц при кератопластике высокого риска на 16,4% и снизить потерю эндотелиальных клеток трансплантата роговицы на 9,7% в течение 1-го года после операции.
Внедрение в практику
Разработанная технология предоперационной подготовки и сотрансплантации АФЛ внедрена в практическую деятельность Глазного тканевого банка Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем, Головной клиники ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России, Глазного банка Чебоксарского и Краснодарского филиалов ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России.
Апробация работы
Диссертация апробирована в Центре фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем и на совместной конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России с кафедрой глазных болезней ГБОУ ВПО Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И.Евдокимова Минздрава России с участием ведущих специалистов (докторов медицинских наук) по трансплантологии и иммунологии ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И.Шумакова» Минздрава России (Протокол №13 от 03.12.2013 года, Москва).
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научно-практических конференциях и съездах: на 8-й и 10-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2009, 2012), IX-м Съезде офтальмологов России (Москва, 2010), V Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2010), 2-м международном ежегодном конгрессе EuCornea (Вена, Австрия, 2011), Национальных научных конференциях с международным участием «Филатовские чтения» (Одесса, Украина, 2011, 2012), на Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию З.Алиевой (Баку, Азербайджан, 2013), на VI Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2013).
Публикации
Всего по теме диссертации имеется 21 публикация, 4 из которых – в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов по теме диссертации, 3 – в иностранных изданиях. Получен 1 Патент РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 18 таблицами. Работа состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 233 источника, из них 49 отечественных и 184 иностранных работ.
Разработка технологии предоперационной подготовки АФЛ осуществлялась на базе Глазного тканевого банка и профильных лабораторий Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (зав. – д.м.н. Борзенок С.А.) и Головной клиники ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва), Лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. - д.м.н. проф. Онищенко Н.А.), определение уровня цитокинов и растворимой молекулы HLA-G5 проводилось в Лаборатории иммунодиагностики и иммунокоррекции (зав. – д.м.н. проф. Сускова В.С.) ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова Минздрава России», изучение ультраструктурной архитектоники АФЛ осуществлялось в Лаборатории анатомии микроорганизмов (зав. – д.м.н. Диденко Л.В.) ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, изучение фенотипа ММСК АФЛ проводились в Лаборатории клеточной биологии и патологии развития (зав. – д.б.н. Сабурина И.Н.) ФГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Клинические исследования выполнялись в Отделе трансплантации роговицы и реконструктивной хирургии переднего отрезка глаза (зав. – д.м.н. проф. Мороз З.И.) головной клиники ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России.
Учение о гематоофтальмическом барьере и привилегированности роговицы в свете приживления сквозного трансплантата роговицы
Понятие иммунной привилегированности впервые было предложено в 1940-ых годах Нобелевским лауреатом, P.B. Medawar с соавторами [158]. Они зафиксировали длительное выживание чужеродной ткани, помещенной в переднюю камеру глаза и в мозг. Тогда, считалось, что у глаза и мозга существует анатомический (гематоофтальмический) барьер и что низкий процент отторжения трансплантатов происходит из-за «иммунологического невежества» [158]. Однако, позже, феномен отсутствия развития реакции отторжения был объяснен J.W.Streilein и коллегами тем, что это происходит не только из-за «иммунологического невежества», а также из-за механизма активного иммунного подавления [211, 209, 164, 165]. В настоящее время, преобладают три главных теории патогенеза молекулярных механизмов иммунной привилегированности глаза: первая – в глазу есть анатомические, клеточные и молекулярные барьеры; вторая – переднекамерно-ассоциированное иммунное отклонение или переднекамерный гемато-офтальмический барьер (anterior chamber associated immune deviation - ACAID) [228, 227]; третья – иммунное подавление, которое обеспечивает микроокружение в глазу (immune suppressive microenvironment in the eye) [123].
Также показано, что клетки эпителия роговицы, кератоциты и эндотелиальные клетки не экспрессируют молекулы класса II MHC (Major Histocompability Complex – главный комплекс гистосовместимости), а экспрессируют только низкие уровни молекул класса I MHC [210, 224]. Это означает, что главной мишенью при реакции отторжения становятся не антигены MHC, а минорные H-антигены в роговичных аллотрансплантатах [202]. Кроме того, дендритные клетки II класса MHC-позитивные и макрофаги, отсутствующие в центральной зоне нормальной роговой оболочки, могут обнаруживаться только на периферии роговицы – у лимба [210]. В подтверждение третьей теории «иммунной привилегированности» роговицы было обнаружено, что профиль цитокинов с преобладанием противовоспалительных (IL-10) и иммуносупрессирующих (TGF), содержащихся во влаге передней камеры способствует снижению активности клеток Лангерганса (дендритных клеток) в тканях роговицы [84, 204, 205, 199]. Обнаруженное присутствие малого числа мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) по фенотипу сходных с костномозговыми, которые не экспрессируют HLA-антигены (Human Leukocyte Antigens – человеческие лейкоцитарные антигены) класса II в нормальной роговой оболочке, но возможно, играющих роль зрелых антигенпрезентирующих клеток (АПК) [110], способствует тому, что роль представления антигена в регионарных лимфатических узлах после трансплантации донорской роговицы выполняют, главным образом, АПК реципиента с экспрессированными молекулами класса II MHC на их поверхности, а не АПК донора [202, 203]. Таким образом, учитывая вышеперечисленное, а также то, что здоровая, неповрежденная роговица не содержит кровеносных и лимфатических сосудов, становится понятным, почему временной интервал между трансплантацией донорской роговицы, распознаванием антигена в регионарных лимфатических узлах и возникновением эффекторного ответа повреждающего трансплантат значительно удлиняется [76].
Главным механизмом эффекторного ответа в реакции отторжения трансплантата роговицы, как считают, является реакция гиперчувствительности замедленного типа, с реакцией, предназначенной для антигенов минорных Н-генов гистосовместимости, а не атаки цитостатическими T- клетками и молекул MHC донора [202, 203]. Таким образом, можно заключить, что посттрансплантационный иммунный ответ при пересадке роговицы менее выражен по сравнению с иммунной реакцией при пересадке других органов и тканей, не только благодаря анатомическим особенностям строения роговицы, но также и ее низкой антигенности при развитии вышеописанных механизмов представления антигена и эффекторного ответа.
Важнейшей генетической системой иммунологического распознавания и взаимодействия клеток организма в иммунном ответе, как уже упоминалось, является МНС, или система HLA в которую входят не только гены контролирующие трансплантационные антигены, но и структуры, определяющие силу иммунного ответа, а также синтез поверхностных клеточных молекул. Выделяют два класса антигенов HLA: к классу I относятся антигены A, B и C, к классу II – антигены DR, DP и DQ [65, 71]. МНС кодирует два набора молекул класса I HLA, которые назвали классом Ia (классические) и классом Ib (неклассические) молекулы. Класс молекулы Ia включает генетические продукты HLA-A, HLA-B и HLA-C локусов и характеризуется широкой тканевой экспрессией и высокой степенью полиморфизма, в противоположность, класс молекулы Ib включает генетические продукты HLA-E, HLA-F и HLA-G локусов и характеризуется реструктурированным тканевым распределением и ограниченным полиморфизмом. Помимо того, что эти антигены представлены на ядро-содержащих клетках, классические и неклассические молекулы класса I HLA присутствуют в сыворотке в растворимой форме (sHLA-I). Сывороточный уровень sHLA-I молекул может быть существенно увеличен при множестве физиологических и патологических состояний, таких как беременность, острые эпизоды отторжения после органных аллотрансплантаций, криза болезни «трансплантат против хозяина», после костномозговой трансплантации, при аутоиммунных заболеваниях, вирусных инфекциях и при злокачественных новообразованиях [178]. Важную роль в организме играют неклассические молекулы HLA-G, представленные четырьмя мембранными (HLA-G1-G4) и тремя растворимыми изоформами (HLA-G5 – G7), среди которых только HLA-G1 и HLA-G5 содержат все области классических молекул HLA (1,2 и 3) [187, 156, 129, 130, 128].
Разработка технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
Световая микроскопия (визуализация и фотосъемка) препаратов АФЛ на различных этапах экспериментальных исследований, а именно гистологических парафиновых срезов АФЛ, окрашенных гемотоксилин-эозином по стандартной методике, проводилась на световом микроскопе «Leica» (Германия), оснащенном цифровой камерой «Leica» (Германия).
Определение содержания цитокинов (IL-10, IL-1RA, IL-4, IL-6, IFN, TNF, TGF) и молекулы HLA-G5 в аликвотах среды и слезной жидкости методом иммуноферментного анализа
Спектр исследования определялся несколькими известными положениями: индукторной ролью IFN и IL-4 в развитии клеточных, в частности, аутоиммунных, аллергических и противоинфекционных реакций; провоспалительных и хемотаксических цитокинов – TNF, IL-1b, антагонистами которых являются IL-10, IL-1RA, TGF – обладающие выраженными противовоспалительными и иммуносупрессивными свойствами [24]. А также данными, описанными в главе 1 (обзор литературы), о присутствии ряда цитокинов и растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 во влаге передней камеры и слезной жидкости и изменении их содержания при развитии патологических процессов.
Основными проявлениями биологической активности IL-6 в организме являются: активация пролиферации Т- и В-лимфоцитов, провоспалительное действие за счет активации экспрессии молекул адгезии на эндотелии и хемотаксиса некоторых типов лейкоцитов, усиления функциональной активности фибробластов и остеокластов, активация острофазового ответа путем индукции синтеза в печени С-реактивного белка, а также пирогенное действие [140]. Однако следует отметить, что IL-6 также вырабатывается ММСК и является необходимым для поддержания их в недифференцированном состоянии [176]. Оценку уровней цитокинов (IL-10, IL-1RA, IL-4, IL-6, IFN, TNF, TGF) и растворимой молекулы HLA-G5 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург), предназначенных для количественного определения цитокинов человека в биологических образцах, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Минимальные, достоверно определяемые набором концентрации исследуемых цитокинов в образцах составили от 5 до 20 пг/мл. Измерения проводили на планшетном анализаторе «Униплан» при 450 нм.
При определении содержания исследуемых цитокинов в кондиционированных средах за исходные данные было принято содержание их в «интактных» средах. Забор слезы у реципиентов проводили автоматической пипеткой «Ленпипет» (10-100 мкл) из нижнего свода коньюнктивальной полости в количестве 50-100 мкл (50 мкл максимальное количество слезы, которое удавалось получить у некоторых реципиентов с сопутствующим синдромом сухого глаза) перед операцией, на 1, 4, 7 сутки, а также в 1 и 3 месяцы после операции.
Учитывая отсутствие нормативных данных уровня исследуемых цитокинов в слезной жидкости (СЖ), были проведены исследования относительно здоровых доноров (n=10) и определен уровень цитокинов, принятый за физиологическую норму: IL-10 (до 50 пг/мл), IL-1RA (150-260 пг/мл), IL-4 (19-28 пг/мл), IL-6 (26-32 пг/мл), IFN (до 100 пг/мл), TNF (18-24 пг/мл), TGF (до 230 пг/мл), HLA-G (36-64 пг/мл).
.Выявление фенотипа ММСК АФЛ и их толерогенного состояния проводили методом иммуногистохимического окрашивания. Для нейтрализации аутофлуоресцентного свечения ткани АФЛ предварительно депарафинизированные в спиртах по стандартной методике срезы АФЛ обрабатывали синькой Эванса в разведении 1:100 в течение 5 минут, затем трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Далее инкубировали при комнатной температуре в условиях водяной бани t 37С с первичными моноклональными антителами (табл. 5) в соответствующих разведениях в течение 1 часа:
HLA-G ab 76869, Abcam, UK 1: Далее срезы АФЛ отмывали 3-х кратно в PBS и наносили видоспецифичные вторичные антитела, меченные Alexa Fluor в разведении 1:500, инкубировали в тех же условиях в течение 1 часа. Стекла со срезами отмывали 3 раза в PBS, фиксировали в 10% растворе формальдегида и заключали в глицерин под покровное стекло. Фотосъемку препаратов проводили на микроскопе Axiovert-25 Carl Zeiss при увеличении х200 и х400 с использованием цифровой фотокамеры Axiocam color фирмы Carl Zeiss, Германия.
Метод иммунофенотипирования клеток АФЛ
Для подтверждения стабильности фенотипа в процессе консервации проводили иммунофенотипирование клеток, вышедших из ткани АФЛ и образовавших монослой. Иммунофенотипирование - это определение поверхностных маркеров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Поскольку антитело конъюгировано с флуорохромом, можно визуализировать экспрессию анализируемого маркера и оценить ее качественно и количественно – с помощью метода проточной цитофлуориметрии.
Клетки отмывали от консервационной среды раствором Версена, обрабатывали 0,25% раствором трипсина, после чего инактивировали действие фермента добавлением среды, подсчитывали количество клеток в камере Горяева и центрифугировали суспензию (7 мин, 1000об/мин, 100g). К полученному осадку добавляли 900 мкл раствора фосфатно-солевого буфера (PBS с рН=7,4) и аликвотировали по 100 мкл. К каждой пробе добавляли антитела (10 мкл антител на 1106 клеток) (табл. 6), конъюгированные с флуоресцентными метками (FITC – fluorescein isothiocyanate, PE – phycoerythrin, PC5 Phycoerythrin-Cyanin 5.1 и ECD – Phycoerythrinexas Red-X), и инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте. После этого пробы центрифугировали (400 g, 5 мин), осадок ресуспендировали в 1 мл PBS (рН=7,4) с 1% FCS и переносили в пробирки для проточного цитофлуориметра (Beckman coulter FC 500, США). Полученные результаты анализировали на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с помощью программы «CXP analysis».
Разработка технологии криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
Наличие позитивной реакции с маркерами ММСК (CD105, CD90, CD29, CD44) и негативной с маркером лейкоцитарной группы клеток – CD45, а также определение позитивной реакции с маркером HLA-G на поверхности исследуемых культур клеток подтверждает сохранение фенотипа ММСК в ткани АФЛ в процессе первичной органотипической консервации, не только в стандартной, используемой для культивирования ММСК, но и в среде Борзенка-Мороз. Показано, что использование среды Борзенка-Мороз, разрешенной для клинического применения на территории РФ, для органотипической консервации АФЛ позволяет не только сохранить жизнеспособность и сохранность имммунофенотипа клеток АФЛ в течение не менее чем 35 суток, но и поддержать их пролиферативную активность. Таким образом, разработана технология предоперационной подготовки аллогенных фрагментов лимба, включающий хирургическое выделение лимбальных фрагментов из донорских глаз в сроки до 18 часов после смерти, последующей органотипической консервацией в течение 21-28 суток с использованием равноценно как стандартной среды, применяемой для культивирования ММСК, так и среды Борзенка-Мороз.
Разработка технологии криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами
В целях возможности создания Банка криоконсервированных аллогенных фрагментов лимба лимбальные образцы, прошедшие стадию первичной органотипической консервации в течение 28 суток, были равноценно разделены на 2 группы исследования. Результаты исследования после криогенной консервации в течение 1 месяца показали, что ультраструктура лимбальных фрагментов во II-й группе без добавления в среду криопротектора характеризовалась расширением пространств между коллагеновыми волокнами, появлением зон деструктурированного коллагена, а также набуханием и разрушением клеток АФЛ (рис. 12 В, Г).
Сканирующая электронная микроскопия, х80 Таким образом, результаты демонстрируют необходимость добавления криопротекторов при криогенной консервации для длительного хранения жизнеспособных клеток и ультраструктурной сохранности лимбального трансплантата.
Полученные данные явились основанием для продолжения изучения функциональных возможностей клеток АФЛ, криоконсервированных в I-й группе и прекращения дальнейших исследований АФЛ из II-й группы. Исследования по изучению длительности хранения аллогенных фрагментов лимба при низких температурах (-80С и -196С) проводились в течение 2-х лет с момента замораживания. Фрагменты лимба, консервированные при -80С, размораживались поочередно через 1, 3, 6 и 9 месяцев, при -196С – через 6, 12, 18 и 24 месяца и подвергались последующей вторичной органотипической консервации в условиях нормотермии (при t 37C в атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности) в течение 21суток с использованием стандартной культуральной среды, состав которой изложен в разделе 2.1.2.
Результаты световой фазово-контрастной микроскопии демонстрируют постепенное восстановление пролиферации клеток после размораживания лимбальных фрагментов, ранее криоконсервированных при -80С в течение 6 месяцев (рис. 13) и 24 месяцев при -196С (рис. 14). С 7 суток органотипической консервации была отмечена активная пролиферация клеток размороженных фрагментов лимба с формированием монослоя к 14 суткам.
Край фрагмента лимба, криоконсервированного при -80С в течение 6 месяцев, с последующей вторичной органотипической консервацией после размораживания (начало):А – 1 сутки; Б – 7 суткиФазово-контрастная микроскопия, х2
Край фрагмента лимба, криоконсервированного при -80С в течение 6 месяцев, с последующей вторичной органотипической консервацией после размораживания (продолжение):В – 10 суткиГ – 14 сутки инкубированияФазово-контрастная микроскопия, х2
Край фрагмента лимба, криоконсервированного при t -196С в течение 24 месяцев, с последующей вторичной органотипической консервацией после размораживания:А – 1 суткиБ – 14 сутки инкубированияФазово-контрастная микроскопия х2 Отмечено, что при длительности хранения более 6 месяцев при -80С восстановления клеточной пролиферации не происходило, что, по-видимому, связано с полным разрушением клеточной массы в лимбальных фрагментах (рис. 15).
Край фрагмента лимба, криоконсервированного при -80С в течение 9 месяцев, с последующей вторичной органотипической консервацией после размораживания: А – 1 суткиБ – 14 сутки инкубированияФазово-контрастная микроскопия, х2 Таким образом, было установлено, что разработанная технология криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба с использованием сред содержащих 10% ДМСО и 30% фетальной сыворотки при t -80С не более 6 месяцев и -196С в течение 2-х лет и более позволяет сохранить пролиферативную активность и ультраструктуру лимбальных образцов. Это явилось основанием для создания криобанка фрагментов лимба на базе Глазного тканевого банка Головной клиники.
Разработка технологии вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации
Функциональную сохранность лимбальных фрагментов после размораживания, оценивали по динамике изменения содержания провоспалительных (IL-6, IFN, TNF) и противовоспалительных (IL-10, IL-1RA, TGF) цитокинов в инкубационной среде (рис. 16 и табл. 11) и по экспрессии маркеров ММСК и HLA-G-рецепторов при определении иммунофенотипа клеток, образовавших монослой на 21 сутки (рис.18 и табл. 12). Исследование показало (рис. 16), что в процессе органотипической инкубации в течение 21 суток идет постепенное и более выраженное увеличение содержания противоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGF) и HLA-G5 на фоне снижения уровня провоспалительных цитокинов (IL-6, IFN, TNF).
Техника сотрансплантации донорской роговицы и аллогенных фрагментов лимба, прошедших предоперационную подготовку по разработанной технологии
Установлено, что активация HLA-G-рецепторов на поверхности лимбальных клеток более существенно начинает проявляться с 14 суток органотипической консервации и сохраняется до предельно-оптимального срока консервации, равного 28-ми суткам.
Таким образом, органотипическая консервация в среде Борзенка-Мороз и стандартной, используемой для культивирования ММСК, не только сохраняет клетки в жизнеспособном и пролиферирующем состоянии, но и способствует индукции иммуносупрессивных и толерогенных свойств лимбальных трансплантатов. При этом оптимальными сроками консервации следует считать 21-28-е сутки.
Далее были проведены исследования возможности длительного хранения жизнеспособных АФЛ с иммуносупрессивными свойствами, для этого использовали АФЛ (n=64), прошедшие стадию первичной органотипической консервации по разработанной технологии в течение 28-ми суток. Были сформированы 2 группы АФЛ: АФЛ I-й группы замораживались в 60% среды Борзенка-Мороз, 30% сыворотки, 10% ДМСО; АФЛ во II-й группе (контроль) в 90% среды Борзенка-Мороз и 10% сыворотки.
Сканирующая электронная микроскопия образцов АФЛ проводилась через 6 и 9 месяцев криоконсервации при t -80С и через 12 и 24 месяца криоконсервации при t -196С. Все образцы АФЛ, криоконсервированные в обоих режимах в указанные сроки, в отличие от контрольных образцов, имели четко выраженную архитектонику коллагеновых волокон интерстициального матрикса и расположенных в нем структурно сохранных ММСК. В образцах АФЛ контрольной группы отмечалось расширение пространств между коллагеновыми волокнами, наличие зон деструкции коллагеновых фибрилл в интерстициальном матриксе, набухание с размытостью границ ММСК. В отличие от хорошей морфологической сохранности всех образцов АФЛ, функциональная сохранность ММСК определялась с помощью вторичной органотипической консервации АФЛ после дефростации.
Аллогенные фрагменты лимба, консервированные при -80С, размораживались поочередно через 1, 3, 6 и 9 месяцев, при -196С – через 6, 12, 18 и 24 месяца, и подвергались последующей вторичной органотипической консервации (при t 37C в атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности) в течение 21 суток с использованием стандартной среды, используемой для культивирования ММСК.
С помощью фазово-контрастной микроскопии было отмечено постепенное восстановление пролиферации клеток после размораживания АФЛ, ранее криоконсервированных при -80С в течение 6 месяцев и 24 месяцев при -196С. С 7 суток органотипической консервации была отмечена активная пролиферация клеток размороженных лимбальных фрагментов, с формированием монослоя к 14 суткам. Отмечено, что при размораживании АФЛ через 9 месяцев хранения при -80С, признаков клеточной пролиферации в течение 14 суток вторичной органотипической консервации не наблюдалось, что, по-видимому, связано с полным разрушением клеточной массы в АФЛ.
Таким образом, было установлено, что криоконсервация аллогенных фрагментов лимба по разработанной технологии с использованием сред, содержащих 10% ДМСО и 30% фетальной сыворотки при -80С не более 6 месяцев и -196С в течение 2-х лет и более, позволяет сохранить жизнеспособность и пролиферативную активность клеток, а также ультраструктуру АФЛ. Это явилось основанием для создания криобанка аллогенных фрагментов лимба на базе Глазного тканевого банка Головной клиники.
Функциональную сохранность клеток размороженных АФЛ оценивали по динамике изменения содержания про- (IL-6, IFN, TNF) и противовоспалительных (IL-10, IL-1RA, TGF) цитокинов, а также HLA-G5 в аликвотах среды на 21-е сутки вторичной органотипической консервации. Данные цитокинограммы показали, что начиная с 3-х суток, содержание провоспалительных цитокинов практически не увеличивается, тогда как противовоспалительные цитокины, такие как, TGF и IL-1RA нарастают, что с одной стороны подтверждает жизнеспособность клеток лимба, а с другой - сохранность их иммуносупрессивных свойств. Результаты проведенного иммунофенотипирования с использованием панели антител к ММСК клеток АФЛ, образовавших монослой к 21 суткам инкубации, подтвердили, что 98% клеток сохранили иммунофенотип ММСК после размораживания. Таким образом, впервые было показано, что разработанная технология вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации позволяет не только индуцировать пролиферативные свойства клеток лимба, но и способствует их функциональной активности, сопровождающейся выработкой противовоспалительных цитокинов и молекул толерогенности HLA-G5.
На этапе клинических исследований было отобрано 69 пациентов с помутнением трансплантата роговицы, поступивших в учреждение для повторной кератопластики. Из них в контрольную группу вошло 33 пациента; в опытную группу – 36. Группы достоверно не различались по полу, возрасту и причинам помутнения роговицы. В анамнезе у пациентов обеих групп было от 1 до 3-х сквозных кератопластик.
![Эффективность диеты в профилактике пищевой аллергии при высоком риске развития атопии у детей [Электронный ресурс]](/i/i/4276/201602.png "Эффективность диеты в профилактике пищевой аллергии при высоком риске развития атопии у детей [Электронный ресурс] Гамалеева Анжела Владимировна")
