Эффективность жпиретинального метода введения ферментного препарата коллализина при пролиферативной диабетической витреоретинопатии [Электронный ресурс] Назаренко Ксения Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Современные аспекты патогенеза и лечения ферментами пролиферативной диабетической витреоретинопатии .11

1.1. Общие сведения о сахарном диабете и пролиферативной диабетической витреоретинопатии 11

1.2. Современные аспекты патогенеза пролиферативной диабетической витреоретинопатии .12

1.2.1. Пролиферативные процессы в заднем отрезке глаза. 13

1.2.2. Механизм биосинтеза и катаболизма коллагена в развитии пролиферативной ткани ...21

1.3. Фармакокинетическое обоснование и различные способы проведения протеолитической офтальмоэнзимотерапии при пролиферативной диабетической витреоретинопатии ..24

1.3.1. Общие принципы, методы и способы протеолитической ферментотерапии в лечении заболеваний глаз 24

1.3.2. Характер лечебного протеолитического воздействия ферментов на биосубстраты воспаления при патологии глаз...: 30

1.3.3. Интраокулярные методы введения ферментных препаратов и хирургические способы проведения протеолиза. 37

1.3.4. Местное протеолитическое действие ферментов на пограничные ткани глаза. 43

1.4. Ферментный препарат коллализин и его применение в офтальмологической практике 48

Глава 2. Материал и методы исследования .53

2.1. Характеристика экспериментальных исследований 53

2.2. Характеристика гистологических исследований , .56

2.2.1. Подготовка материала для световой микроскопии .57

2.2.2 Методы окрашивания препаратов 58

2.2.3. Подготовка материала для электронной микроскопии. 59

2.3. Характеристика клинических исследований . 61

2.4. Техника,выполнения предлагаемых методов лечения : 65

2.4.1. Методика (техника) эпиретинального введения коллализина 66

2.4.2: Техника закрытой трансцилиарной витрэктомии 67

Глава 3. Результаты собственных исследований . .70

3.1. Результаты экспериментальных исследований 70

3.2. Результаты гистологических исследований.. 76

3.3. Результаты клинических исследований .81

Глава 4. Обсуждение результатов... 99

4.1. Обсуждение результатов экспериментального исследования 99

4.2. Обсуждение результатов гистологического исследовани 101

4.3. Обсуждение результатов клинического исследования 102

Заключение... ...108

Выводы... 111

Практические рекомендации... 112

Указатель литературы ...113

• Общие сведения о сахарном диабете и пролиферативной диабетической витреоретинопатии
• Характеристика экспериментальных исследований
• Результаты экспериментальных исследований
• Обсуждение результатов экспериментального исследования

Введение к работе

Сахарный диабет (СД), которым страдает 3-5% населения, стал в современной медицине одной из социально-значимых проблем [4]. Ежегодно число больных СД увеличивается на 5-7%, а каждые 12-15 лет удваивается [62]. По данным ВОЗ, в странах мира зафиксировано более 100 млн. больных СД и примерно столько же не выявлено [4,37,44]. Поздние осложнения диабета, такие, как ретинопатия, нефропатия, синдром диабетической стопы, ишемическая болезнь сердца, полинейропатия, являются главными причинами инвалидизации больных сахарным диабетом [9,32,33,100].

Особое место при СД занимает поражение глаз, так как оно существенно влияет на качество жизни больных. Причём, из всех клинических проявлений наибольшую опасность представляет диабетическая ретинопатия (ДР), являясь причиной прогрессирующего и безвозвратного снижения зрения вплоть до слепоты, которая у больных сахарным диабетом наступает в 25 раз чаще, чем в общей популяции [37,64,74,76,89,101].

Наиболее тяжёлой формой ДР, существенно влияющей на качество жизни больных СД и приводящей к слепоте в 66,9% случаев, является пролиферативная диабетическая витреоретинопатия (ПДВР) [3,66,74,76]. Встречается она у 37-42% больных СД. Как правило, данная стадия процесса развивается у больных СД I типа спустя 5-7 лет от начала заболевания, а у больных СД II типа- 10-12 лет [84,109,116,186,290,291].

Многочисленными исследованиями [3,4,32,33,37,69,74,76,100,112,449] установлено, что ПДВР сопровождается развитием тяжёлых осложнений: гемофтальм (18% - 78%), тракционная отслойка сетчатки (ОС) (35% - 62%), неоваскулярная глаукома (2,7% - 12,2%). При отсутствии своевременного лечения эти осложнения приводят не только к слепоте, но и гибели глаза.

Наиболее частыми и тяжелыми проявлениями ПДВР являются грубые фиброзные изменения сетчатки и стекловидного тела (СТ) [1,3,18,47,51,52,66]. Распространенным методом лечения в таких случаях

' 1

является витрэктомия - удаление стекловидного тела, витреоретинальных тяжей и эпиретинальных мембран. Однако витреоретинальная хирургия сопряжена с риском возникновения интра- и послеоперационных осложнений, требующих повторных хирургических вмешательств [1,13,16,18]. Поэтому недостаток простых и эффективных методов лечения фиброзных изменений у больных СД делает актуальным поиск новых подходов к лечению этой патологии.

Перспективным направлением решения данной проблемы является ферментотерапия. В настоящее время наиболее эффективным считают использование протеолитических ферментов [23,35,52,56,65,68,103], одним из которых является коллализнн. Известно, что этот фермент обладает особой специфичностью к коллагену — основному субстрату фиброзной ткани [23,59,85,86]. Сейчас многие авторы стали применять коллализнн для интравитреального введения с целью лизирования кровоизлияний и фиброзных изменений СТ и сетчатки [23,35,52,54,56,58,65,68,103].

Особенностью современного этапа лечения ПДВР является дальнейшее развитие витреоретиналыюй хирургии [35,52,54,56,58,65,68,103], в том числе разработка различных модификаций ферментного витреолиза, который был предложен в 1973 г. на кафедре офтальмологии Военно-медицинской академии г. Санкт-Петербурга [Даниличев В.Ф.,2002].

Несмотря на успехи, достигнутые в лечении этого заболевания, проблема далека от окончательного решения. Неудовлетворённость результатами традиционной витрэктомии при лечении ПДВР привела офтальмологов к необходимости комбинирования этого метода лечения с другими. Всё это обусловило необходимость разработки новых методов лечения ПДВР, и побудило нас к исследованию этой темы.

Цель исследования

Повысить эффективность лечения пролиферативной диабетической витреоретинопатии с помощью применения эпиретинального метода введения ферментного препарата коллализина.

8 Задачи исследования

1. Предложить эпиретинальный метод введения коллализина у больных
пролиферативной диабетической витреоретинопатией.

2. Изучить комбинированный метод лечения ПДВР, включающий
эпиретинальное введение коллализина и проведение закрытой
трансцилиарной витрэктомии.

3. Подтвердить специфичность действия ферментного препарата коллализина на фиброзную ткань, определить терапевтически оптимальную дозировку и временные сроки воздействия коллализина на фиброзную ткань при предлагаемом методе введения в эксперименте.

4. Дать клинико-функциональную оценку результатов эпиретинального и комбинированного методов лечения больных ПДВР в сравнении с традиционным оперативным методом лечения ПДВР, включающего проведение закрытой трансцилиарной витрэктомии.

5. Провести сравнительный анализ характера и частоты возникновения послеоперационных осложнений эпиретинального метода введения коллализина и традиционного хирургического вмешательства при ПДВР.

Научная новизна

1. Впервые предложен эпиретинальный метод введения ферментного
препарата коллализина при ПДВР, который отличается от существующих
интраокулярных методов введения коллализина возможностью
непосредственного контакта данного препарата с фиброзными изменениями,
локализованными в эпиретинальном пространстве, что повышает
эффективность действия коллализина на фиброзную пролиферативную
ткань. .

2. Впервые изучен комбинированный метод лечения ПДВР,
включающий , эпиретинальное введение коллализина с последующим
проведением закрытой трансцилиарной витрэктомии.

9 Практическая значимость

1. Эпиретинальный метод введения ферментного препарата
коллализина является простым и доступным способом лечения больных с
ПДВР и по результатам нашего исследования может быть рекомендован для
применения в клинической практике.

2. Применение эпиретинального метода лечения позволило улучшить
результаты лечения больных пролиферативной диабетической ретинопатией,
повысить клинико-анатомо-функциональные исходы консервативного и
оперативного лечения, снизить риск возникновения послеоперационных
осложнений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сравнении с традиционным хирургическим лечением,
эпиретинальный метод лечения при ПДВР, а также его сочетание с закрытой
трансцилиарной витрэктомией позволяют улучшить функциональные,
электрофизиологические результаты и стабилизировать пролиферативный
процесс.

2. Эпиретинальный метод введения коллализина у больных ПДВР
отмечается простотой техничного исполнения, непосредственным локальным
контактом вводимого препарата с фиброзной эпиретинальной тканью,
возможностью одновременного отделения эпиретинальных мембран и
проведение швартотомии при наличии грубых фиброзных изменений.

3. Ферментный препарат коллализин действительно обладает
специфичным действием на фиброзную ткань, терапевтически оптимальной
его дозировкой при эпиретинальном введении является доза в 10 КЕ;
оптимальное время воздействия коллализина составляет 1 час, что
обуславливает отсутствие лизирующего действия на нормальные
пограничные структуры глаза в эксперименте и при гистологическом
исследовании.

10 4. Частота осложнений при эпиретиналыюм методе лечения ПДВР

составила в 1,8 раза меньше в сравнении с традиционным хирургическим

лечением ив 1,6 раза меньше, чем при комбинированном лечении.

Внедрение результатов работы в практику

Предложенный метод, эпиретиналыюго введения ферментного препарата коллализина внедрён в лечебную практику Западно-Сибирского офтальмологического центра профессора И.В. Запускалова (ЗСОЦ) и в офтальмологической клинике Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) (г. Томск). Проведённая научно-практическая работа нашла отражение в Учебно-методическом пособии Министерства образования РФ «Актуальные вопросы диагностики и лечения в офтальмологии».

Результаты работы используются в программах лекционных курсов, , практических занятий на кафедре офтальмологии СибГМУ.

Апробация работы состоялась 15.06.2006 г. на заседании экспертной комиссии Диссертационного совета Д 208.037.02 при Красноярской государственной медицинской академии. Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Томского областного общества офтальмологов (2003 г.,2004 г.,2005 г.); Томской областной конференции офтальмологов (2003 г.,2004 г.,2005 г.); V Международном конгрессе молодых учёных "Науки о человеке" (Томск, 2004 г.); кафедре офтальмолопіи Сибирского государственного медицинского университета (2006 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 1 - в издании, рекомендованном ВАК Минобразования РФ, 2 - в международной печати. Получена 1 приоритетная справка на изобретение РФ (№ 2006104794 от 15.02.2006 г. «Способ проведения энзимотерапии»). Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых российских учёных (№ МД-6837.2006.7 от 10.02.2006 г.).

Структура и объём диссертации

Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 297 источников информации, в том числе 135 отечественных и 162 зарубежных публикаций.

Общие сведения о сахарном диабете и пролиферативной диабетической витреоретинопатии

По классификации ВОЗ (1979) основными формами СД были признаны инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), или СД 1 типа, и инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНЗСД), или СД 2 типа. В последующий период (1985) в классификацию сахарного диабета ВОЗ были внесены дополнения. Был выделен новый тип СД, связанный с недостаточностью питания (СДНП), а также другие типы СД, связанные с определёнными состояниями и синдромами [69]. ИНЗСД встречается чаще, чем ИЗСД (80-90% против 10-20%).

Особое место при СД занимает поражение глаз, так как оно существенно влияет на качество жизни больных. Причём, из всех клинических проявлений наибольшую опасность представляет диабетическая ретинопатия (ДР), являясь причиной прогрессирующего и безвозвратного снижения зрения вплоть до слепоты, которая у больных сахарным диабетом наступает в 25 раз чаще, чем в общей популяции [37,64,74,76,89,101]. Наиболее тяжёлой формой ДР, существенно влияющей на качество жизни больных СД и приводящей к слепоте в 66,9% случаев, является пролиферативная диабетическая витреоретинопатия (ПДВР) [3,66,74,76]. ПДВР встречается у 37-42% больных С Д. Как правило, данная стадия процесса развивается у больных СД I типа спустя 5-7 лет от начала заболевания, а у больных СД II типа - спустя 10-12 лет [84,109,116,186,290,291].

Некоторые учёные отмечают, что особенностью ПДВР в настоящее время является более частое выявление заболевания у лиц молодого, трудоспособного возраста (20-40 лет), неуклонно прогрессирующий и рецидивирующий характер течения, приводящий к быстрому снижению зрительных функций [3,64,66,74,76,290]. Частота встречаемости ПДВР по данным разных авторов варьирует от 8% до 80% [37,64,74,76,101].

Многочисленные исследования [3,4,32,33,37,69,74,76,100,112,449] показывают, что ПДВР сопровождается развитием таких тяжёлых осложнений как гемофтальм (18% - 78%), тракционная отслойка сетчатки (ОС) (35% — 62%), неоваскулярная глаукома (2,7% - 12,2%). Эти осложнения приводят не только к слепоте, но и гибели глаза при отсутствии своевременного лечения.

Одной из актуальных проблем современной офтальмологии является изучение патогенетических механизмов развития ПДВР. Для данной патологии характерен широкий спектр необратимых изменений, ухудшающих прогностические результаты лечения и значительно затрудняющих проведение хирургических вмешательств [2,19,28,48,131].

Патогенетические механизмы ПДВР многообразны и изучены далеко не полностью, исследованием и разработкой которых занимаются многие как зарубежные, так и отечественные авторы [46,74,101,138,157,164,166, 169,171,172,187,207,210,211,218,223,226,228,238,248, 260,261,274,276,277,296].

В настоящее время нет единой теории, объясняющей причины возникновения и закономерности развития пролиферативных процессов при ПДВР. Имеются лишь данные отдельных исследований, касающиеся некоторых сторон этиологии и. патогенеза этого процесса [5,54,115,118,153,249].

В основе ПДВР лежит новообразование капилляров и формирование клеточно-волокнистых мембран, состоящих из макрофагальных, фибробластических и глиальных клеток [179,206,282]. Важную роль, по общепризнанному мнению, играют "вазопролиферативные" или "ангиогенные" факторы, стимулирующие процессы миграции и пролиферации клеток и способствующие развитию неоваскуляризации [182,219,284].

Новообразование сосудов, согласно теории ангиогенеза, происходит за счёт митоза эндотелиоцитов предсуществующих сосудов с формированием "почек роста" [21,54,60]. Основу же формирования фиброзных мембран составляют те же репаративные процессы, что наблюдаются при заживлении раны: клеточный хемотаксис и митоз, синтез экстрацеллюлярного матрикса, процессы ремодернирования и контракции в новообразованной рубцовой ткани [117,119,147].

ПДВР характеризуется двумя видами пролиферации - сосудистой и фиброзной. Пролиферация, как правило, формируется в области диска зрительного нерва (ДЗН) или по ходу сосудистых аркад, но может располагаться в любых других участках глазного дна. Новообразованные сосуды растут по задней поверхности стекловидного тела (СТ). Несостоятельность стенки новообразованных сосудов и их тракция ведёт к частым геморрагиям, как преретинальным, так и к кровоизлияниям в СТ. Рецидивирующие кровоизлияния, происходящие вследствие прогрессировать задней отслойки СТ, и пролиферация глиальных клеток ведут к образованию витреоретинальных (ВР) тракций, которые могут вызвать отслойку сетчатки [3].

Пролиферативный процесс разделяется на несколько этапов. Первый этап этого процесса - фиброваскулярная пролиферация. Второй этап -клеточная пролиферация с формированием патологических мембран на поверхности сетчатки, цилиарного тела и структур СТ. При этом основное участие принимают фибробласты, клетки пигментного эпителия (КПЭ) и нервной глии. Третий этап процесса - сокращение вновь сформированных мембран [54,93].

Характеристика экспериментальных исследований

Для осуществления 1-го эксперимента использовались сухожилия крупного рогатого скота. Связано это с тем, что состоят они из коллагеновых волокон [23,40,45,50]. Поэтому нам показалось возможным на предоставленном материале выяснить воздействие коллализина на фиброзную ткань, в состав которой также входит коллаген [40,45,64,57,75,78,79].

Эксперимент проводился на плоской поверхности стола в течение 14 часов, частота эксперимента - 10 раз (рис.1). Для этого из каждого сухожилия выкраивались 2 одинаковые продольные полоски (шириной 5 мм, высотой 3 мм, длиной 100 мм), которые с помощью лески, одинаковой длины, прикреплялись за один свой край к ванночке, а за другой — через катушечный блок к подвешенному грузу (массой 0,5 кг). Первая ванночка заполнялась 20 мл изотонического р-ра натрия хлорида, а вторая — 20 мл ферментного р-ра коллализина, в дозировке 10 КЕ (рис.1). Такая дозировка, по данным литературы, является максимальной при разовом интраокулярном введении коллализина [18,19,21]. Затем через каждый час фиксировалась длина каждой сухожильной полоски в течение 14 часов, измерение длины производилось с помощью миллиметровой линейки. Все полученные данные отображались графически (рис. 5). Материалом для осуществления 2-го эксперимента служили 14 свежих энуклеированных глаз половозрелых свиней, целью которого было определить оптимальную терапевтическую дозировку коллализина, из используемых в литературе для интравитреального введения: от 2-х до 10 КЕ [17,18,19,20,21,22,27,35,43,54]; частота эксперимента - 4раза. Глаза фиксировались иглами к пенопластовой основе за остатки глазодвигательных мышц. Предварительно разводился коллализин в дозе от 1 до 14 КЕ в 0,1 мл изотонического р-ра натрия хлорида. Затем, поочерёдно, в СТ каждого свиного глаза (14 шт.) вводился ферментный р-р коллализина в разной дозировке (1-14 КЕ) (рис. 2). Введение препарата осуществлялось инсулиновым шприцом с инсулиновой иглой. Фермент вводился непосредственно в центр СТ (рис. 2). По истечении 1 часа, каждый глаз вскрывался по экватору, из него извлекалось с помощью ложки СТ, которое сразу пропускалось через одинаковое жестяное сито в ёмкость с градуированной миллилитровой шкалой (рис.3). Причём время прохождения СТ через сито засекалось с помощью секундомера (рис.3). Все полученные данные отображались графически (рис. 6).

В литературе имеются данные о раздражающем действии протеолитических ферментов и лизировании пограничных структур с патологически изменёнными тканями [17,18,19,20,21,22,35,43,53,54,60,63]. В связи с этим некоторые авторы предлагают внутривенно вводить ингибиторы ферментов. Сроки введения ингибиторов приводятся разные: от 24 до 72-х часов [17,18,19,20,21,22,43,63]. Несмотря на то, что ферментный препарат коллализин расщепляет только коллагеновую ткань [26,40,45,57,64,75,78,79], и теоретически не должен лизировать никакую другую, нами были проведены гистологические исследования совместно с лабораторией кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии СибГМУ. Материалом для исследований послужили 56 энуклеированных свиных глаз, которые использовались с целью определения пропускной способности СТ, в зависимости от концентрации коллализина (эксперимент 2-ой). После эксперимента отделяли сетчатку в изотоническом растворе натрия хлорида, а затем производили специальную подготовку данного материала для световой микроскопии.

В качестве фиксирующей смеси использовалась жидкость Карнуа, которая готовилась непосредственно перед применением. В ее состав входят: спирт 96% - 6 частей, хлороформ - 3 части, ледяная уксусная кислота - 1 часть. Кусочки материала помещались в жидкость Карнуа и фиксировались в течение 2 часов на холоде. Далее материал обезвоживался в спиртах увеличивающейся концентрации: сначала 3 смены в 96% спирте по 2 часа каждая, затем 2 часа в абсолютном спирте. Обезвоженные и уплотненные кусочки материала перекладывались из абсолютного спирта в смесь спирта с толуолом (1:1) на 2-3 часа, а потом в чистый толуол - по 2 смены на протяжении 2-4 часов до просветления материала. Затем объекты помещались в смесь из равных частей толуола и мягкого парафина, где находились при 37 С в течение 2-3 суток. После этого материал переносился в расплавленный чистый парафин и помещался в термостат, где находился при температуре 56 С в течение 2 часов. Далее материал помещался в парафин-воск на 2 часа в термостат при 56 С. По прошествии 2 часов проводили ориентирование препаратов в парафине с помощью подогретого металлического шпателя, а затем помещали в холод на ночь.

На следующий день из затвердевшего парафина скальпелем вырезались четырехугольные блоки, таким образом, чтобы каждый объект со всех сторон был окружен слоем парафина толщиной 1-3 мм. Полученные парафиновые блоки наклеивались на деревянные кубики.

Для приготовления парафиновых срезов использовался санный микротом. Толщина срезов - 5-6 мкм. Парафиновые срезы наклеивались в расправленном положении на предварительно подготовленные предметные стекла. На тщательно очищенную поверхность предметного стекла стеклянной палочкой помещалась капля раствора белка с глицерином (1:1) и растиралась до получения равномерного слоя. Расправление и наклеивание парафиновых срезов на предметные стекла осуществлялось влажным способом. На стекло с помощью пипетки наносили несколько капель дистиллированной воды и получали плавающие срезы. Затем стекло осторожно подогревали над спиртовкой, что обеспечивало полное расправление срезов. После этого удаляли излишнюю воду, предметные стекла со срезами перекладывали в термостат при 37 С на 1-2 суток.

Окрашивание гематоксилин-эозином: предварительная обработка парафиновых срезов заключалась в депарафинизации, для чего использовался толуол - промывание в течение 10 мин. Затем срезы обрабатывали 96% спиртом - 3-5 капель, после чего предметные стекла с наклеенными срезами промывали в дистиллированной воде.

Далее, после удаления излишков влаги вокруг срезов, на них с помощью пипетки наносили раствор гематоксилина до полного покрытия препаратов. Через 5-7 мин. красящий раствор с предметных стекол сливали и помещали их в дистиллированную воду на 30 мин. с целью диффереицировки. После промывки удаляли излишнюю влагу с предметных стекол и наносили раствор эозина - экспозиция 1-2 мин. Затем краситель сливали и срезы вновь обрабатывали 96% спиртом.

Результаты экспериментальных исследований

Для осуществления 1-го эксперимента использовались сухожилия крупного рогатого скота. Связано это с тем, что состоят они из коллагеновых волокон [23,40,45,50]. Поэтому показать воздействие коллализина на фиброзную эпиретинальную ткань, в состав которой также входит коллаген [40,45,64,57,75,78,79], показалось возможным на предоставленном материале.

Эксперимент проводился на плоской поверхности стола в течение 14 часов, частота эксперимента - 10 раз (рис.1). Для этого из каждого сухожилия выкраивались 2 одинаковые продольные полоски (шириной 5 мм, высотой 3 мм, длинной 100 мм), которые с помощью лески, одинаковой длины, прикреплялись за один свой край к ванночке, а за другой - через катушечный блок к подвешенному грузу (массой 0,5 кг). Первая ванночка заполнялась 20 мл изотонического р-ра натрия хлорида, а вторая - 20 мл ферментного р-ра коллализина, в дозировке 10 КЕ. Такая дозировка, по данным литературы, является максимальной при разовом интраокулярном введении коллализина [18,19,21]. Затем через каждый час фиксировалась длина каждой сухожильной полоски в течение 14 часов, измерение длины производилось с помощью миллиметровой линейки. Все полученные данные отображались графически (рис. 5).

В результате, с каждым часом длина сухожилия, которое находилось в ванночке с р-ром коллализина, увеличивалась в среднем на 2,1 мм во всех экспериментальных случаях. Причём, самое максимальное увеличение приходилось на 1-ый час пребывания сухожилия в ферментном р-ре и составило в среднем 6 мм (рис. 5). Что касается контрольного сухожилия, которое находилось в ванночке с изотоническим р-ром натрия хлорида, то оно под воздействием механических сил тоже растягивалось, но не так значительно как первое. С каждым часом его длина увеличивалась в среднем на 0,3 мм. В течение 1-го часа его прирост составил в среднем 1 мм (рис. 5).

Если сравнить общий средний прирост (за 14 часов) двух сухожилий, то прирост того, что находилось в р-ре коллализина, составил 29,5 мм; а контрольного - 4,25 мм (рис. 5).

Отмечено, что в 3-х экспериментальных случаях, после 10-ти часов пребывания в ферментном р-ре, длина сухожилий больше не изменялась. В одном случае длина сухожилий была постоянной уже после 9 часов пребывания в тех же условиях (рис. 5).

Сухожилия, находившиеся в изотоническом р-ре натрия хлорида, растягивались под действием механических сил, только в течение 3-х часов. После чего их длина больше не изменялась (рис. 5).

На графике (рис. 5) наглядно представлены все вышеперечисленные данные, где по оси абсцисс (х) отмечено время за которое изменялась длина сухожилия (час), а по оси ординат (у) - длина на которую данное сухожилие растянулось (мм).

Кривая 1 показывает экспериментальные данные зависимости длины сухожилия, находящегося в р-ре коллализина, от времени его нахождения там. Кривая 2 показывает ту же зависимость, но в других условиях пребывания сухожилия: в изотоническом р-ре натрия хлорида (рис. 5).

Кривая 1 резко растёт вверх в течение 10-ти часов, а затем принимает линейное положение. Кривая 2 растёт незначительно, лишь в первые 3 часа, а затем принимает линейное положение. В результате, кривая 1 во всех экспериментальных случаях располагается выше, чем кривая 2 (рис. 5).

Все полученные в этом эксперименте результаты подтверждают субстратную специфичность коллализина. Этот фермент избирательно действует на ткань, состоящую из коллагена.

Коллализин начинает лизировать коллагеновую ткань сразу после его введения (через 1 мин), максимального своего действия он достигает через 1 час и действует в течение 10-ти часов, после чего действие его, видимо, прекращается.

Материалом для осуществления 2-го эксперимента служили свежие энуклеированные глаза половозрелых свиней, целью которого было определить оптимальную терапевтическую дозировку коллализина, из используемых в литературе для интравитреального введения: от 2-х до 10 КЕ [17,18,19,20,21,22,27,35,43,54]; частота эксперимента - 4 раза.

Глаза фиксировались иглами к пенопластовой основе за остатки глазодвигательных мышц. Предварительно разводился коллализин в дозе от 1 до 14 КЕ в 0,1 мл изотонического р-ра натрия хлорида. Затем, поочерёдно, в СТ каждого свиного глаза (14 шт.) вводился ферментный р-р коллализина в разной дозировке (1-14 КЕ) (рис. 2). Введение препарата осуществлялось инсулиновым шприцом с инсулиновой иглой. Фермент вводился непосредственно в центр СТ (рис. 2). По истечению 1 часа, каждый глаз вскрывался по экватору, из него извлекалось с помощью ложки СТ, которое сразу пропускалось через одинаковое жестяное сито в ёмкость с градуированной миллилитровой шкалой (рис.3). Причём время прохождения СТ через сито засекалось с помощью секундомера (рис.3) - это, так называемая, вязкость СТ. Все полученные данные отображались графически (рис. 6).

Обсуждение результатов экспериментального исследования

В результате проведённого эксперимента выяснилось, что уже через 1 минуту сухожилие, которое находилось в р-ре коллализина, стало растягиваться на 0,5 мм. Причём, с каждым часом длина сухожилия увеличивалась в среднем на 2,1 мм во всех экспериментальных случаях, а самое максимальное увеличение приходилось на 1-ый час пребывания сухожилия в ферментном р-ре и составило в среднем 6 мм.

Что касается контрольного сухожилия, которое находилось в изотоническим р-ре натрия хлорида (контрольное), то оно под воздействием механических сил тоже растягивалось, но не так значительно как первое. Первый прирост его длины был отмечен только через 1 час, который составил 1 мм. и с каждым часом его длина увеличивалась в среднем на 0,3 мм.

Если сравнить общий средний прирост (за 14 часов) двух сухожилий, то прирост того, что находилось в р-ре коллализина, составил 29,5 мм; а контрольного - 4,25 мм. Отмечено, что в 3-х экспериментальных случаях, после 10-ти часов пребывания в ферментном р-ре, длина сухожилий больше не изменялась. В одном случае длина сухожилий была постоянной уже после 9 часов пребывания в тех же условиях. Сухожилия, находившиеся в изотоническом р-ре натрия хлорида, растягивались под действием механических сил, только в течение 3-х часов. После чего их длина больше не изменялась.

Полученные результаты подтверждают данные литературы о субстратной специфичности коллализина. Этот фермент действительно избирательно действует на ткань, состоящую из коллагена. Кроме этого, коллализин начинает лизировать коллагеновую ткань сразу после его введения (через 1 мин), максимального своего действия он достигает через 1 час после введения и действует в течение 10-ти часов, после чего действие его, видимо, прекращается.

В результате, объёмная пропускная способность стекловидного тела (ОПС СТ), без введения коллализина, в среднем составила 1,5 мл/сек во всех экспериментальных случаях.

При введении в СТ уже 2-х КЕ препарата (самой минимальной дозы коллализина, которая встречается при интравитреальном его введении в литературе) ОПС СТ в среднем увеличился на 0,4 мл/сек. При введении в СТ 10-ти КЕ (самой максимальной дозы коллализина, которая встречается при интравитреальном его введении в литературе) тот же показатель повысился на 4,7 мл /сек.

В среднем, с ведением каждой дополнительной клостридиальной единицы препарата от 1 до 10-ти КЕ, показатель ОПС СТ увеличивался на 3,73 мл/сек. После введения каждой дополнительной клостридиальной единицы препарата от 10-ти до 14-ти КЕ, тот же средний показатель повышался на 13,3 мл/сек.

Получается что: за период повышения дозировки с 1 до 10-ти КЕ повышение витреолиза было в два раза меньше, чем за период повышения дозы коллализина с 10-ти до 14-ти КЕ. Всё это говорит о том, что при дозировке коллализина выше 10-ти КЕ, процесс лизирования СТ может выйти за его пределы, в связи с чем возможен лизис пограничных со СТ нормальных структур и тканей. Поэтому самой терапевтически оптимальной дозировкой коллализина является доза в 10 КЕ. Результаты проведённых экспериментальных исследований позволили нам сделать вывод о том, что объективным показателем витреолиза (растворения белкового остова СТ) может служить объёмная пропускная способность (ОПС) СТ [135]. Причём, чем больше доза вводимого коллализина, тем больше данный показатель, и тем в большей степени происходит лизирование СТ. Но при дозировке коллализина выше 10-ти КЕ, процесс лизирования СТ может выйти за его пределы, в связи с чем возможен лизис пограничных со СТ нормальных структур и тканей. Поэтому самой терапевтически оптимальной дозировкой коллализина является доза в 10 КЕ.

В ходе гистологических исследований выявлены следующие изменения: в тех случаях, где ферментный препарат не вводился оказалось нормальное строение сетчатки; в глазах после интравитреальной инъекции коллализина от 1 до 10-ти КЕ также обнаруживалось типичное строение внутренних слоев сетчатки.

После введения в СТ коллализина в дозе 11 КЕ, в одном случае наблюдалось незначительное очаговое истончение внутреннего ядерного слоя сетчатки. Во всех других случаях - сетчатка имела нормальное строени.

В глазах после интравитреальной инъекции 12-ти КЕ ферментного препарата, в трёх случаях отмечалось выраженное очаговое истончение внутреннего ядерного слоя сетчатки, в одном случае - сетчатка имела обычное строение.

В тех случаях, где в СТ вводилось 13 КЕ коллализина, обнаруживалось резкое истончение внутреннего ядерного слоя сетчатки в трёх случаях и очаговое истончение того же слоя сетчатки в одном случае. В глазах после интравитреалыюй инъекции фермента в дозировке 14 КЕ, наблюдалась полная деструкция нейросенсорного слоя сетчатки в одном случае, в двух - полная деструкция и выпадение внутреннего ядерного слоя сетчатки. В одном случае оказалось очаговое выпадение внутреннего ядерного слоя сетчатой оболочки.

Таким образом, нормальное строение сетчатки отмечается во всех случаях без- и с введением коллализина от 1 до 10-ти КЕ. При введении коллализина в дозировке от 11-ти до 14-ти КЕ наблюдается нарушение в строении внутренних слоев сетчатки, в виде истончения, деструкции и даже выпадения внутреннего ядерного и нейросенсорного слоев сетчатой оболочки. Эти изменения в строении сетчатки возможно вызваны лизирующим действием ферментного препарата коллализина, о котором упоминали некоторые авторы [17,18,21]. В связи с чем, наиболее терапевтически эффективной и в то же время безопасной для окружающих тканей дозировкой коллализина, является доза - 10 КЕ. Получается, что полученные нами результаты гистологического исследования подтверждают экспериментальные.

Похожие диссертации на Эффективность жпиретинального метода введения ферментного препарата коллализина при пролиферативной диабетической витреоретинопатии [Электронный ресурс]

«Эффективность лечения возрастной макулярной дегенерации сухой формы методом эндоназального электрофореза препарата Ретиналамин»Флоренцева Светлана Сергеевна

Современные аспекты эффективности препарата класса простагландина F2 альфа-латанопроста в лечении больных первичной открытоугольной глаукомойШляпужникова Алина Вадимовна

Эффективность гиполипидемических препаратов лескола и липантила 200М в коррекции дислипидемий у больных гипертонической болезньюВолчкова, Татьяна Михайловна

Нейропротекторное действие, эффективность и безопасность препарата рексод в консервативном лечении открытоугольной глаукомы (экспериментально-клиническое исследование) [Электронный ресурс]Валид Набих Мохаммед Абдел Наби Абу Зайед

Изучение эффективности комплексного использования специфического иммуноглобулина, противовирусных и противовоспалительных препаратов при офтальмогерпесе : (эксперим.-клин. исслед. )Чекина, Анна Юрьевна

Эффективность лечения больных первичной открытоугольной глаукомой с гипертонической болезнью общими и местными гипотензивными препаратамиПриставка Владимир Александрович

Исследование эффективности метода комбинированного хирургического лечения открытоугольной глаукомы и осложненной катаракты с использованием модифицированной техники имплантации металлического мини-шунтаБессонов Игорь Леонидович

Сравнительная эффективность методов восстановления поврежденных слезных канальцевВыходцев Александр Витальевич

Эффективность методов стабилизации прогрессирующей близорукостиМакаров Сергей Игоревич

Эффективность методов стабилизации прогрессирующей близорукостиМакаров Сергей Иванович