Содержание к диссертации
Введение 5
Раздел 1. Обзор литературы И
Глава 1. Характеристика основных биологических свойств иерсиний на современном этапе
1.1. Морфологические особенности 13
Культурные и биохимические свойства 14
Патогенные свойства и методы их определения 16
Факторы патогенности 16
Методы идентификации вирулентных иериний 19
Глава 2.0сновные источники и факторы передачи иерсинийчеловеку и современные методы их индикации и идентификации
Теплокровные животные как источники иерсиний 23
Значение продуктов растительного и животного происхождения в распространении иерсиний 26
2.3. Современные методы индикации и идентификации иерсиний из
внешней среды и патологического материала 27
Бактериологическая диагностика 27
Иммунологическая диагностика 35
Генетическая диагностика 37
Серологическая диагностика 39
Раздел 2. Собственные исследования
Глава 3. Материалы и методы 42
Глава 4. Характеристика заболеваемости иерсиниозами на
территории Вологодской области 53
Глава 5. Серологический скрининг иерсиниоза и псевдотуберкулеза для целей эпидемиологического надзора за инфекциями
Серологическое исследование крови мелких млекопитающих 63
Серологическое исследование крови сельскохозяйственных животных 64
5.3. Серологическое исследование крови людей различных
профессиональных групп риска 66
Глава 6. Усовершенствование микробиологической диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза
6.1. Оценка диагностической эффективности новой пептонно-
калиевой среды накопления иерсиний в модельных опытах 68
6.1.1. Характеристика интенсивности размножения иерсиний
в пептонно-калиевой среде с различным содержанием компонентов 68
6.1.2. Характеристика интенсивности размножения иерсиний
в сочетании с сопутствующей флорой в пептонно-калиевой среде 73
6.2. Оценка диагностической эффективности пептонно-калиевой
среды накопления при исследовании «полевого» материала 76
6.3. Оптимизация способа щелочной обработки проб при
исследовании материала из объектов внешней среды 77
6.4. Применение экспрессных методов индикации иерсиний 79
6.4.1. Полимеразная цепная реакция 79
6.4.2 Иммуноферментный анализ 81
Глава 7. Биологические свойства иерсиний, изолированных из источников и факторов различного происхождения
Видовые, антигенные, вирулентные свойства иерсиний 83
Оценка протективной активности антигенов Yersinia pseudotuberculosis 89
7.2.1. Микробиологическая характеристика взаимодействия высоковирулентного штамма Yersinia pseudotuberculosis с организмом
животных, иммунизированного антигеном ЛПС 89
7.2.2.Микробиологическая характеристика взаимодействия высоковирулентного штамма Yersinia pseudotuberculosis с организмом животных, иммунизированным антигенами
ЛПС и БНМ при сочетанном их применении 96
7.2.3. Определение показателей гуморального иммунитета у
иммунизированных животных 99
Глава 8. Микробиологический мониторинг в системе эпидемиологического
надзора за иерсиниозами 101
Заключение 112
Выводы '. 120
Литература 122
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БКД - буферно-казеиново-дрожжевая среда
БНМ - белок наружной мембраны
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛПС - липополисахарид
ОКЗ - острые кишечные заболевания
ОКИНЭ - острые кишечные инфекции нерасшифрованной этиологии
ПК - пептонно-калиевая среда
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - реакция агглютинации
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
СБТС - среда с бромтимоловым синим
СВИ - сыворотка к вирулентным иерсиниям
ФБР - фосфатно-буферный раствор
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания людей и животных,
возбудителями которых являются микроорганизмы распространенных видов рода Yersinia, особенно Yersinia enterocolitica (Y.enterocolitica) и Yersinia pseudotuberculosis (Y.pseudotuberculosis), зарегистрированы во многих странах мира. Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов проблемы иерсиниозов актуальность этих инфекций сохраняется [114, 100]. Стабильные показатели заболеваемости (данные официальной статистики) по Российской Федерации псевдотуберкулезом (7,1 на 100 тыс. нас.) и иерсиниозом (3,0 на 100 тыс. нас.) в последние 5 лет не отражают истинного распространения инфекций. При обеих нозоформах наблюдается неравномерное распределение заболеваемости по отдельным регионам. Наиболее часто вспышки и спорадические случаи псевдотуберкулеза регистрируются в Сибири, на Дальнем Востоке, в Северо-Западном регионе страны, включая Санкт-Петербург. Показатели заболеваемости псевдотуберкулезом в 2001г. в Кемеровской, Архангельской, Томской, Новосибирской областях составили 97,0; 51,0; 45,0 и 48,0, соответственно, на 100 тыс. нас. Заболеваемость иерсиниозом заметно ниже, что в значительной степени обусловлено отсутствием унифицированных методов лабораторной диагностики и принадлежностью Y.enterocolitica к 4-ой группе условно-патогенных бактерий. Последнее обстоятельство снижает объем исследований и показаний к ним.
Важной особенностью возбудителей указанных заболеваний является изменение их биологических свойств, а также пейзажа циркулирующих Y. enterocolitica, снижение доли ранее доминировавших серотипов и выявление новых серо-биотипов, ранее считавшихся непатогенными [107].
В этиологии иерсиниозов людей на территории Северо-Западного округа, в том числе Вологодской области, ведущее значение принадлежит Y.enterocolitica. Многие теоретические и практические аспекты лабораторного обеспечения системы эпидемиологического надзора за
иерсиниозными инфекциями, равно как и организационно-методические составляющие системы микробиологического мониторинга, остаются неразработанными. С этим связано отсутствие информации об истинной распространенности иерсиний среди людей, животных, объектов внешней среды и их этиологической значимости.
Ухудшение эпидемической и эпизоотической обстановки по пищевым зоонозам в ряде регионов России в последние годы [108, 110], угроза их распространения в ранее благополучные территории требуют совершенствования системы эпидемиологического надзора и, в первую очередь, обеспечения его эффективными методами и средствами контроля за циркуляцией иерсиний.
Все вышеизложенное определило цель настоящего исследования:
определение и характеристика этиологически значимых иерсиний,
циркулирующих в условиях сельскохозяйственного региона и
усовершенствование методов лабораторного обеспечения
эпидемиологического надзора за иерсиниозами.
Задачи исследования:
Повысить диагностическую эффективность бактериологического метода в результате разработки и применения новой питательной среды для накопления иерсиний в сочетании с новыми условиями обработки исследуемых проб щелочением. Определить оптимальную тактику применения экспрессных методов для мониторинга за иерсиниями.
Изучить серо-биотипную структуру иерсиний, циркулирующих среди людей, мелких млекопитающих, сельскохозяйственных животных, во внешней среде; определить варианты, имеющие этиологическое значение.
Оценить информативность показателей серологического скрининга у людей и животных при проведении микробиологического мониторинга за иерсиниями.
4. Определить биологические характеристики иерсиний,
циркулирующих на территории с развитым сельскохозяйственным производством, разработать оптимальную тактику лабораторного контроля за их распространением и включить ее в качестве дополнения в систему эпидемиологического мониторинга за иерсиниозами.
Научная новизна работы. Предложена новая жидкая питательная пептонно-калиевая среда (ПК) для накопления бактерий рода Yersinia» Ее применение позволяет сократить продолжительность бактериологического исследования и с наибольшей частотой установить распространенность иерсиний среди людей и животных, выявить объекты различной степени микробиологической опасности. Разработаны условия применения среды для мониторинга за иерсиниями при контроле материала различного происхождения.
Объекты животного и растительного происхождения на территории изучения в подавляющем большинстве инфицированы Y.enterocolitica биотипа 1, подтипа 1А серотипов 0:3; 0:4,33; 0:5,27; 0:6,30. Впервые установлена вирулентность иерсиний указанных серотипов и доказано их этиологическое значение в развитии иерсиниозов у людей и животных.
Научно обоснована тактика унифицированного микробиологического мониторинга за иерсиниями в условиях крупного сельскохозяйственного региона и использование серологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за иерсиниозами. Предложены организационно-методические рекомендации по проведению микробиологического мониторинга на территории с развитым сельскохозяйственным производством.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана и внедрена в практику жидкая пептонно-калиевая среда (ПК) накопления для выделения бактерий рода Yersinia. Предложена среда позволяет сократить срок подращивания исследуемого материала на 2-3 дня. При испытаниях в полевых условиях показано, что она на 18 % эффективнее буферно-казеиново-
дрожжевой среды (БКД), широко используемой в практике. Среда ПК внедрена в практических лабораториях городов Москвы, Санкт-Петербурга, Архангельска, Вологды. Получена приоритетная справка на заявку о выдаче патента на состав среды Российского агентства по патентам и торговым знакам Российской Федерации от 21.06.2003г. №2003119471/13(020596).
Для повышения эффективности бактериологического метода при массовых исследованиях, рекомендовано однократное щелочение исследуемого материала животного и растительного происхождения на этапе первичного посева на жидкую питательную среду, позволившее увеличить количество изолятов и сократить продолжительность бактериологического исследования на 3 суток.
Предложена унифицированная тактика эпидемиологического мониторинга за иерсиниями для территорий с развитым сельскохозяйственным производством, включающая дифференцированный подход к обследованию на инфицированность иерсиниями объектов, пищевых продуктов по степени эпидемиологической опасности и определенных контингентов людей, сроков проведения обследований, использования эффективных методов и средств. Содержание микробиологического мониторинга изложено в аналитическом обзоре (2002), подготовленном совместно с сотрудниками лаборатории бактериальных инфекций Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и одобренном Департаментом Госсанэпиднадзора Минздрава России.
В результате многолетних микробиолого-эпидемиологических исследований, проведенных в условиях крупного сельскохозяйственного региона, получены данные о формировании хозяйственных очагов распространения иерсиний, инфицированности людей в группах «риска» и животных, факторов распространения иерсиний и усовершенствована система лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за иерсиниозами. Опыт использования научно обоснованной системы микробиологического мониторинга за иерсиниями включен в программу обучения врачей-интернов
кафедры организации санэпидслужбы, эпидемиологии и гигиены Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова на базе ЦГСЭН в Вологодской области и специалистов санитарно-эпидемиологической службы области. В целях подготовки студентов факультета ветеринарной медицины Вологодской государственной молочнохозяйственной академии им. Н.В. Верещагина и внедрения микробиологического мониторинга за иерсиниями разработаны методические рекомендации "Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз (этиология, эпизоотология, лабораторная диагностика у сельскохозяйственных животных)", Вологда, 2003.
Положения выносимые на защиту:
1.Новая жидкая питательная среда для диагностики иерсиниозов
(пептонно-калиевая) существенно повышает эффективность
бактериологического исследования. Её использование в сочетании с однократным щелочением исследуемых проб (материала) обеспечивает более полное и раннее выявление иерсиний.
2.0бъекты животного и растительного происхождения на территории изучения в подавляющем большинстве инфицированы Y.enterocolitica биотипа 1, подтипа 1А серотипов 0:3; 0:4,33; 0:5,27; 0:6,30. Установлена вирулентность иерсиний указанных серотипов и их этиологическое значение в развитии иерсиниозов у людей и животных.
3.Многолетний микробиологический мониторинг за иерсиниями с применением новых средств и методов экспрессной диагностики на территории с развитым сельскохозяйственным производством определил дифференцированный подход к выбору обследуемых объектов, сельскохозяйственной продукции с учетом частоты, периода года и длительности их инфицирования.
Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании Ученого
Совета Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера 5 ноября 2003 г.
Материалы работы представлены на международной научно-технической конференции «Проблемы экологии на пути к устойчивому развитию регионов» (Вологда, 2001); на заседаниях Санкт-Петербургского и Вологодского отделений Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2002); на 8-м международном симпозиуме по Yersinia (Turku, Финляндия, 2002); на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003); на региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и профилактики распространенных инфекций» в НИИЭМ им. Пастера (2003); По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе в иностранных изданиях - 1, аналитический обзор «Микробиологический мониторинг за иерсиниозами» (Санкт-Петербург, 2002).
Структура и объем диссертации. Диссертация написана по обычному плану и состоит из введения, обзора литературы и 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 221 источник, в том числе 122 отечественных и 99 зарубежных авторов. Работа изложена на 146 страницах компьютерного текста и иллюстрирована 23 рисунками, 27 таблицами.
