Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Введение 12
1.2. Проблемы оценки активности и прогноза гломерулонефрита 13
1.3. Проблемы патогенетической терапии гломерулонефрита 14
1.4. Современные представления о патогенезе гломерулонефрита 17
1.5. Биологическая роль топоизомераз 21
1.6. Клиническое значение топоизомераз при патологических состояниях 26
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Больные
2.1.1. Больные, участвующие в проведении основных этапов исследования 32
2.1.2. Клиническая характеристика больных 35
2.2. Морфологические исследования
2.2.1. Биоптаты 41
2.2.2. Определение индексов активности и склероза 42
2.2.3. Иммуногистохимическое исследование 43
2.3. Статистический анализ 46
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Уровень экспрессии топоизомераз и степень моноцитарной инфильтрации в почечных биоптатах больных нефритами и в
почечной ткани без патологических изменений 48
3.2. Связь уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса 60
3.3. Влияние уровня экспрессии топоизомераз и степени моноцитарной инфильтрации на прогноз больных волчаночным и мезангиокапиллярным нефритами 70
3.3.1. Прогностическая роль уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации в ответе на лечение больных волчаночным и мезангиокапиллярным нефритами 75
3.3.2. Факторы, предсказывающие развитие почечной недостаточности у больных волчаночным и мезангиокапиллярным нефритами 84
Заключение 95
Выводы 100
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
Приложение 122
- Проблемы оценки активности и прогноза гломерулонефрита
- Современные представления о патогенезе гломерулонефрита
- Иммуногистохимическое исследование
- Связь уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гломерулонефрит (ГН) - одна из наиболее частых причин хронической почечной недостаточности. Лечение ГН остается сложной проблемой, и основу лечения, направленного на отдаление терминальной почечной недостаточности, составляет патогенетическая терапия, базирующаяся на современных представлениях об иммунных и неиммунных механизмах происхождения и прогрессирования ГН [И.Е. Тареева 1995; Т.Н. Краснова 1996]. Несмотря на достигнутый за последнее десятилетие прогресс в иммунодепрессивной терапии ГН, лечение прогрессирующих форм нефрита, в основе которых лежит иммунное воспаление с накоплением внеклеточного матрикса и развитием склероза, требует дальнейшей разработки [И.Е. Тареева с соавт. 1989; H.A. Мухин с соавт. 1989; Т.Н. Краснова 1991. 1998; Е.М. Шилов 1994; G. Banfi etal. 1991; С. Ponticelli 1992; G.G. Illei & J.H. Klippel 1998; G.M. Nassar et al. 1998; M. Klein et al. 1999; C.C. Geddes & D.C. Cattran 2000; P. Passerini & C. Ponticelli 2001]. Кроме того, большинство иммунодепрессантов вызывают ряд тяжёлых осложнений и обладают непосредственным нефротоксическим эффектом [J.L. Ader 1998; С. Ponticelli 1999; W.F. Finn 1999]. Поэтому остаётся актуальным дальнейшее углублённое изучение патогенеза ГН с целью поиска новых маркёров для оценки активности и прогноза ГН и, возможно, точек приложения действию новых классов иммунодепрессантов с принципиально другими механизмами действия, обладающих более высокой терапевтической эффективностью и меньшей токсичностью.
Известно, что иммунные реакции лежат в основе большинства ГН [W. G. Couser 1990, 1993, 1999], причём важную роль в возникновении и прогрессировании патологических процессов в почках играют иммунные комплексы и антитела (AT), а также реакции клеточного иммунитета [G.M. Nassar et al. 1998; J.Г. Ambrus et al. 1997]. Наиболее чётко это продемонстрировано при волчаночном нефрите (ВН) [С. Mohan et al. 1995; J.S. Cameron 1999; M.H. Foster et al. 1999]. Хотя антитела к ДНК и являются основным патогенетическим фактором [N. Suzuki et al. 1997; D.A. Isenberg et al. 1997; R. Suenaga et al. 1993], y пациентов с ВН были найдены другие аутоантитела [J.C. Kootstra et al. 1996], среди которых описаны AT к топоизомеразам I и На [A. Hoffmann et al. 1989; L. Stojanov et al. 1995; R. Meliconi et al. 1993; Chang et al. 1996; Kameda et al. 1997; Katsumi et al. 2000; Grigolo et al. 2000; Gussin et al. 2001].
Топоизомеразы (ТОП) - это ДНК-связанные ферменты, контролирующие топологическое состояние ДНК посредством участия в процессах транскрипции, репликации и сегрегации делящихся хромосом [J.C. Wang 1971, 1985, 1987, 1997; M. Geliert 1976, 1981; К. Drlica 1984]. Поскольку ТОП тесно связаны с ДНК [J.C. Wang 1985; W.C. Earnshaw 1985] то, следовательно, включены в процесс, ведущий к образованию AT к ДНК, на что указывает наличие антигистоновых AT при ВН [R. Suenaga 1996]. Приведенные данные свидетельствуют о возможной роли ТОП в аутоиммунном процессе.
Участвуя в процессах транскрипции и репликации, ТОГ1 могут служить индикаторами метаболической и пролиферативной активности клеток [IJ. Kellner et al. 2000], что успешно используется для оценки прогноза у пациентов со злокачественными заболеваниями [Р. Rudolph 1997, 1999; L. Nakopoulou 2001]. В клинической онкологии также широко применяют ингибиторы ТОГ1 I (топотекан, иринотекан) и Па (тгопозид, тенипозид, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон), которые при ряде злокачественных заболеваниях имеют достаточно хороший 1ераиевтический )ффект и многие из них (топотекан, иринотекан) обладают незначительным нефрогоксическим действием по сравнению с современными иммунодепрессантами [S. О Reilly et al. 1996; D. Abigerges 1995, 1996; P. Canal 1996; G.G. Chabot 1995; C. Kollmannsberger 1999.
Однако опубликованных работ по исследованию экспрессии ТОП I и На в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений к настоящему времени нет. Изучение этого аспекта является важным, так как уровень экспрессии этих ферментов может отражать клиническое течение нефритов и, таким образом, быть новым маркёром в оценке активности и прогноза нефритов. Также важно изучение патогенетических связей между экспрессией ТОП и другими маркёрами активности нефрита, в том числе моноцитарной инфильтрацией. Кроме того, доказательство экспрессии ТОП в клетках почечных клубочков и канальцев при развитии и прогрессировании нефрита может послужить обоснованием применения ингибиторов ТОП как нового метода лечения прогрессирующих форм нефрита.
Цель исследования: поиск новых маркёров активности и прогноза нефритов для повышения эффективности их терапии.
Задачи исследования
1. Оценить уровень экспрессии ТОГ1 I, На и степень моноцитарной инфильтрации в почечных биоптатах больных нефритами и в почечной ткани без патологических изменений.
2. Оценить связь уровня экспрессии ТОГ1 I, На и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса.
3. Оценить влияние уровня экспрессии ТОП I, IIa и степени моноцитарной инфильтрации на прогноз больных ВН и мезангиокапиллярным гломерулонефритом (МКГН) и их ответ на лечение.
Научная новизна
1. Впервые в мире продемонстрирована экспрессия ТОП I и IIa в почечных биоптатах больных с различными формами нефрита и в почечной ткани без патологических изменений.
2. Впервые описано наличие сильной корреляционной связи между уровнем экспрессии ТОП I, IIa и выраженностью моноцитарной инфильтрации (одним из маркёров активности почечного процесса), указывающее на патогенетическую р ль ТОП в развитии нефрита.
3. Впервые показана возможность использования уровня экспрессии ТОП I и IIa в качестве маркёра морфологической и клинической активности почечного процесса.
4. Впервые продемонстрирована роль уровня экспрессии ТОП I и IIa в качестве предиктора ответа на иммунодепрессивную терапию у больных ВН и МКГН.
5. Впервые в мире уровень экспрессии ТОГ1 I и IIa использован для оценки скорости прогрессирования почечной недостаточности у больных ВН и МКГН.
6. Впервые продемонстрировано новое звено патогенетической цепи развития Г Н, которое может стать мишенью селективного терапевтического воздействия, способного кардинально ишенить прогноз прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам.
Практическая значимость
1. Уровень экспрессии ГОН I и IIa предложен как новый молекулярно- биологический маркёр активности почечного процесса у больных различными морфологическими вариантами нефрита.
2. Определена прогностическая роль уровня жспрессии ТОП I, IIa и выраженности МОН инфильтрации в предсказании «почечной
выживаемости» больных ВН, МКГН и их ответа на иммунодепрессивную терапию.
3. Создана теоретическая основа для проведения исследований по практическому применению нового класса препаратов - ингибиторов ТОП - в лечении прогрессирующих форм нефрита, резистентных к современным иммунодепрессивным препаратам.
Внедрение результатов исследования
Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении больных Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний ММА им. И.М. Сеченова, включены в материалы лекционных курсов для курсантов кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, которые отражают изложенные результаты, положения и выводы.
Материалы работы представлены на научной конференции кафедры нефрологии и гемодиализа ФГ1ГЮ ММА им. И.М. С еченова (сентябрь, 1999 г.), на 180-м заседании Общества патологов Великобритании и Ирландии (18-21 января 2000 г., Лондон, Великобритания), на Конгрессе немецкого общества нефрологов (2-5 сентября 2000 г., Вена, Австрия), на XXXVII Конгрессе Европейской ассоциации по диализу и трансплантации (16-20 сентября 2000 г., Ницца, Франция), на Конференции молодых учёных России с международным участием (24-28 апреля 2001 г., Москва, Россия), на втором Международном Конгрессе «Иммунология в нефрологии» (24-26 мая 2001 г., Сардиния, Италия), на XXXVIII Конгрессе Европейской ассоциации по диализу и трансплантации (24-27 июня 2001 г., Вена, Австрия).
Апробация работы
Апробация работы проведена 3 сентября 2001 года на совместном заседании кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования и отдела нефрологии Научно- исследовательского центра ММА им. И.М. Сеченова.
База проведения исследования
Основной базой проведения исследования являлись кафедра нефрологии и гемодиализа ФППО и отдел нефрологии НИЦ ММА им. И.М. Сеченова (зав. - чл.-корр. РАМН, профессор! И.Е. Тареева ), нефрологическое отделение (зав. к.м.н. Н.Г. Мирошниченко) Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН, профессор Н.А. Мухин), НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова (дир. - академик РАМН и РАН, профессор М.А. Пальцев; зам. дир. - профессор А.А. Иванов), кафедра патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова (зав. - академик РАМН и РАН, профессор М.А. Пальцев), Клиника нефрологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. приват-доцент D. Proppe), Институт общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany (дир. профессор G. Kloppel).
Проблемы оценки активности и прогноза гломерулонефрита
Несомненно, обнаружение диффузной пролиферации гломерулярных клеток, массивного отложения иммунных комплексов и (или) фибрина, некротизирующего гломерулита всегда свидетельствуют о высокой активности процесса [3, 24]. Однако при всей важности этого метода диагностики отсутствие морфологических признаков не исключает высокую активность нефрита. Примерами могут служить следующие формы ГН: минимальные изменения (МИ), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) и диффузный фибропластический [5, 7, 26].
К клиническим признакам активности почечного процесса относятся: нефротический синдром (НС), остронефритический синдром, нарастание протеинурии, нарастание гематурии, резкое повышение артериального давления (АД), падение почечных функций с нарастанием азотемии ш короткое время, внутрисосудистая коагуляция - ДВС-синдром, увеличение С()г), гипер- а2-глобулинемия [14). Но до последнего времени не предложено достаточно надежных критериев активности, что, вероятно, связано, прежде всего, с недостаточной изученностью патогенеза нефропатии. Оценка степени активности нефропатии также определяет необходимость и объем терапевтических воздействий [18].
Прогноз ГН определяется совокупностью как клинических, так и морфологических факторов. В многочисленных исследованиях установлено, что ряд прогностических признаков является общим для различных морфологических форм - это наличие НС, тяжелой артериальной гипертонии (АГ) и выраженных тубуло-интерстициальных изменений при биопсии почки [47, 61, 94, 114, 139]. Однако традиционный т дход, с помощью которого были получены эти данные, определяет прогноз (среднюю тенденцию) для всей группы больных, объединенных по какому-либо признаку. В настоящее время интенсивно изучается проблема прогнозирования исхода заболевания для каждого больного. Это стало возможным в связи со значительным развитием медицинской статистики и компьютерных технологий [19, 90]. В 1992 году Э. Саигап с соавторами впервые разработали клиническую модель индивидуального риска развития ХПН при мембранозной нефропатии (МН). В 2000 году И. Ю. Худова с соавторами разработали модель для ФСГС, МН и мезангиопролиферативного гломерулонефрита (МПГН) [20]. Оценка прогноза ХГН также определяет необходимость и объем терапевтических воздействий.
Лечение ГН остается сложной проблемой. Наиболее рациональный угиологический подход с элиминацией антигенного фактора, вызвавшего иммунный ответ с формированием ффекторных механизмов, не всегда возможен [9, 16] и основная масса больных подвергается патогенетической терапии, основанной на современных представлениях об иммунных и неиммунных механизмах происхождения и прогрессирования 1Н [6, 15]. Теоретическим обоснованием иммуносупрессии, как патогенетической терапии, является признание иммунной природы I Н [ 1, 2, I 1, 23, 45, 87].
До сегодняшнего дня основу патогенетической терапии ГН составляют кортикостероиды (КС) и цитостатики (ЦС). По современным представлениям КС обладают противовоспалительным и иммунодепресивным действием. Механизмами действия КС являются [6, 18, 21, 45]: 1. Подавление экспрессии генов противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФИО альфа, интерферона альфа, гранулоцитарно- макрофагального колониестимулирующего фактора); металлопротеиназ (коллагеназы, стромедизин); активатора плазминогена; синтетаза окиси азота. 2. Усиление экспрессии генов ингибитора активатора плазминогена; липокортина; нейтральных эндопептидаз ; рецепторов для некоторых цитокинов и гормонов. 3. Подавление экспрессии и функциональной активности Ес и С рецепторов мононуклеарных фагоцитирующих клеток ретикулоэндотелиальной системы. 4. Подавление экспрессии молекул адгезии (Е-селектин и межклеточная молекула адгезии-1) на мембранах эндотелиальных клеток, стимулированных ИЛ-1, что приводит к подавлению миграции лейкоцитов. Механизмы действия цитостатических препаратов обусловлены следующими процессами [4, 6, 18, 21, 45]: 1. Ингибиция Т-хелперов; 2. Ингибиция цитотоксических и супрессорных Г-лимфоцитов; 3. Ингибиция В-лимфоцитов; 4. Торможение клеточно-опосредованных медиаторов воспаления; 5. Изменение качественного и количественного состава Л Г; 6. Ингибиция фиброгенеза (отложения внеклеточного матрикса). В настоящее время в нефрологической практике исполыуются следующие ЦС: 1. Алкилирующие агенты (циклофосфан и лейкеран/члорбу гин) 2. Антиметаболиты (азатиоприн) 3. Селективный цитосгатик (циклоспорин А или сандиммун)
Современные представления о патогенезе гломерулонефрита
К настоящему времени известны только немногие этиологические агенты, вызывающие повреждения клубочков, поэтому обширное и основательное понимание патогенетических механизмов, в основе которых лежат гломерулярные заболевания почек, до сих пор не возможно. Несмотря на то, считается, что иммунные реакции являются главной причиной большинства гломерулонефритов [31, 58, 59).
Иммунопатологические механизмы ГН могут быть разделены на две основные группы [58]. Первичные иммунные механизмы начинают повреждение клубочков, хотя сами редко вызывают значительное повреждение. Роль гуморальной иммунной системы известна столетие. Распознаны два основных механизма: локальное (in situ) взаимодействие AT с антигенами внутри клубочка [55, 116, 167] и связывание AT с расгвооимыми антигенами в циркуляции и последующим отложением иммунных комплексов внутри клубочков [152]. Эти процессы не исключают друг друга, скорее оба могут встречаться при одном и том же заболевании. Процессы образования иммунных комплексов in situ демонстрируют две хорошо исследованные модели: анти-БМК нефрит («нефротоксический нефрит») \lasugi 1933 год [97, 151] и Неутапп нефрит [43, 149]. Отложению антигенных комплексов в клубочках благоприятствуют различные факторы [159]. Прежде всего, существенную роль играют электрический заряд и величина молекулы. Сильно катионные иммуногены могут проникать в базальную мембрану клубочков (БМК) и в субэпителиальное пространство. В противоположность этому, сильно анионные комплексы не проникают в БМК и либо откладываются в субэндотелиальном пространстве либо не имеют нефритогенного эффекта. Электрохимически нейтральные молекулы откладываются в мезангии. Большие макромолекулы редко вызывают реакцию, так как они задерживаются ретикулоэндотелиальной системой. Исходя из этого, гемодинамические факторы, функция мезангия и целостность барьера в клубочках играют важную роль.
Дополнитепьно к прежде представленным факторам АТ к антигенам клеток клубочка могут привести к непосредственному повреждению, часто без отложений протеина [89, 169]. Так, АТ к мезангиальным клеткам вызывают, прежде всего, мезангиолизис, который отвечает за пролиферацию мезангиальных клеток. АТ к поверхностному протеину эндотелиальных клеток вызывают повреждение ндотелия, что может привести к внутриклубочковым кровотечениями, и А Г к определенному гликопротеину нжтелиальных клеток как в жспериментальной модели на животных, так и у человека могут привести к протеинурии и к НС.
Вторичные иммунные механизмы включают группу воспалительных медиаторов, которые активируются после первичной иммунной атаки и значительно расширяют и усиливают повреждение почечной ткани. Медиаторы обычно состоят из циркулирующих клеток крови (нейтрофилы, моноциты, тромбоциты) и активированных компонентов каскада комплимента. Собственные (резидентные) гломерулярные эндотелиальные, мезангиальные и эпителиальные клетки также могут активироваться и участвовать в воспалительном ответе.
Существуют экспериментальные доказательства того, что при иммунном нефрите моноциты вызывают повреждение клубочков [22, 25, 165]. Нейтрофилы выявляются в клубочках как при экспериментальных нефритах, так и при многих типах ГН человека - остром постстрептококковом, МКГН, экстракапиллярном и при нефритах, связанных с системными заболеваниями. Тромбоцит также является одной из центральных клеток воспалительной реакции и содержит многие медиаторы воспаления. Активированные тромбоциты присутствуют в кровотоке и в клубочках при различных гистологических типах ГН.
При некоторых формах нефрита важную роль играет активация системы комплемента, которая представляет собой цепную реакцию. Центральное место в системе комплемента занимает СЗ компонент, при активации которого в реакцию вступают все последующие компоненты. Активация СЗ происходит классическим или альтернативным путями. В результате активации образуются факторы, способствующие прилипанию нейтрофилов, обладающие хемотаксической активностью для нейтрофилов и моноцитов, вызывающие дегрануляцию базофилов и тучных клеток, а также «фактор мембранной атаки». Прототипом, вызванного таким образом шболевания является МКГН человека [32, 121] и некоторые формы МПГН. г)ти пациенты, как правило, имеют низкий уровень СЗ компонента в сыворотке крови при нормальных уровнях ( 1 и С4 [ 177].
Многие вторичные медиаторы являются продуктами циркулирующих клеток или собственных клеток почечных клубочков и содержат активные метаболиты кислорода, цитокины (IL-1, 1Г-2, 1Г-6 интерлейкины I, 2, 6; TNF - фактор некроза опухоли; TGF-l - трансформирующий фактор роста, IFN-y гамма интерферон), факторы роста (TGF- - фактор роста опухоли; PDGF - тромбоцитарный фактор роста), биоактивные липиды (фактор активации тромбоцитов, эйкозаноиды: LTB4, LTD4 -лейкотриены В4 и D4), протеазы и вазоактивные субстанции (эндотелии и эндотелиальный релаксирующий фактор), которые стимулируют пролиферацию собственных клеток почечных клубочков (мезангиальных, эндотелиальных, эпителиальных) и нарушают клубочковую проницаемость, приводя к потере зарядной селективности БМК [57, 110, 119]. Активированные клетки почечных клубочков одновременно с пролиферацией усиливают синтез внеклеточного матрикса, избыточное накопление которого - склероз - является морфологическим субстратом прогрессирующей потери почечной функции, развития ХПН.
В настоящее время благодаря внедрению достижений иммунологии, биотехнологии, морфологии и молекулярной биологии в экспериментальную и клиническую нефрологию, благодаря возможности промышленного производства поликлонапьных и моноклональных AT (моАТ) к широкому спектру антигенов и использованию их в патоморфологических исследованиях на светооптическом и ультраструктурном уровнях, полз чены новые данные о морфо- и патогенезе гломерулопатий и о механизмах, ведущих к прогрессированию Г"Н. Гак, при нефритах в рамках системной красной волчанки и склеродермии в сыворотке крови наряду с другими аутоангителами [46, 75, 104, 123, 155, 156, 157] обнаружены антитела к ДНК-топоизомеразе [83, 85, 93, 105, 106, 120, 154]. Хотя этот феномен и описывался в нескольких публикациях, не имеется до сих пор никаких объяснений о значении ггого антитела в патогенезе нефритов и о его роли в оценки активности и прогноза нефритов. С недавних пор стало возможным оценить жспрессию пого фермента непосредственно в ткани почки (как в свежем, гак и в архивном гистологическом материале), благодаря открытию специфических моноклональных антител [107].
Иммуногистохимическое исследование
В исследование включены больные, почечные биоптаты которых соответствовали критериям надежной оценки [130]. В расчёт брались только неповрежденные и сохранившиеся при общепринятом морфологическом исследовании клубочки, в то время как клубочки с выраженными изменениями, такими как явный некроз или фиброз, из анализа исключались.
Почечные биоптаты (п = 189) получены за период с 1991 г. по 2000 г. путем проведения пункционных биопсий в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева ММА им. И.М. Сеченова (п = 45), Клинике нефрологии (п = 120) и урологии (п = 16) Christian-Albrechts University, Kiel, Germany, Госпитале Tund University, Sweden (n = 8). Образцы почечной ткани, отобранные в исследование, фиксированы в формалине и залиты парафином в лабораториях кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова, Института общей патологии Christian-Alorechts University, Kiel, Germany, Института общей патологии I.und Univeisity, Sweden. Морфологическое исследование почечных биоптатов проводилось проф. В.А. Варшавским (кафедра патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова), проф. A.A. Ивановым (НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова), проф. Gnter Klppel (Институт общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany), проф. Per Alm (Институт общей патологии l.und University, Sweden). Диагноз ставился при помощи световой микроскопии парафиновых срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, иммунолюминесцентной микроскопии криостатных срезов с антисывороткой к иммуноглобулинам человека А, М, G и СЗ фракции комплемента, электронной микроскопии.
В почечных биоптатах всех больных полуколичественно оценивали признаки, характеризующие активный воспалительный процесс (в совокупности составляющие индекс активности) и необратимые склеротические изменения (индекс склероза). Полуколичественный подсчет индексов активности и склероза произведён по Austin et al. [1983] в модификации A.A. Иванова [24, 150].
Индекс активности оценивался на основании 5 показателей: пролиферация эндотелиальных клеток, пролиферация мезангиальных клеток, клеточные полулуния, инфильтрация интерстиция, инфильтрация клубочков. Индекс склероза включал в себя 8 показателей: перигломерулярный склероз, спадение капиллярных петель, синехии, склероз интерстиция, увеличение мезангиального матрикса, атрофия почечных канальцев, уголщение батльной мембраны клубочков, склероз почечных клубочков (гиалино )- Каждый из признаков оценивался по шкале от 0 до 3 баллов. Индексы рассчитывались как сумма баллов соответствующих признаков. Принцип иммуногистохимической окраски
В работе использован стандартный стрептавидин-биотин-пероксидазный метод. Антитела Для иммуногистохимического исследования использованы следующие первичные AT: - K-S4: моноклональные AT (моАТ) к ТОП На, предоставленные лабораторией кафедры общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany [107]. - С 21: моАТ к ТОП I, предоставленные Y - С. Cheng, Yale University, New Haven, CT. Кроме того, для изучения патогенетических свя ей между жспрессией ТОП и одним и i важных факторов развития нефрита моноцитарным инфильтратом [73, 95, 96, 134, 143], выраженность последнего оценивали с помощью моноклонального антитела Ki-Mlp, который является особенно чувствительным маркером моноцитов [144]. Ki-Mlp: моД I к CD68, маркер моноцигарной клеточной линии, предоставленный лабораторией кафедры общей патологии ChristianAlbrechts University, Kiel, Germany [ 144]. В качестве вторичных AI использованы биогин-евяшнные кроличьи anti- mouse IgM (фирма DAKO, Hamburg, Germany; № 1- 154), ратедённые 1:200 в TBS с 5% человеческой сыворогкой. (TBS tris buffered saline: 68,5г Trishydrochlorid, 87,8r Natriumchlorid, 9r Trisbase в Юл aqua dest.; pH 7,4). Схема 2. Методика иммуногистохимического исследования I. Ии отовление гистологических препаратов. В лаборатории кафедры общей патологии Christian-Albrechts University, Kiel, Germany из образцов почечной ткани, фиксированных в формалине и залитых парафином (блоков) с использованием микротома (фирма Leica) изготавливали срезы толщиной 3 - 5 мкм и наносили их на предметные стекла, покрытые 3- аминопропилтриэтоксисиланом. Затем срезы обезвоживали при температуре 37 С в течение 24 часов, депарафинизировали в ксилоле в течение 30 минут и регидратировали нисходящими концентрациями этанола (100% - 90 % - 70% - aqua dest.). Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% перекисью водорода (6 мл.) в метаноле (250 мл.) при комнатной температуре в течение 30 минут. Для лучшей экспозиции ядерных антигенов (топоизомераз I и IIa) срезы предварительно обрабатывали 0.01 молярной лимонной кислотой, pH 6.0, при помощи автоклавирования в течение 2 минут 30 секунд [38]. Для восстановления реакционной способности антигена быть распознанным Ki-Mlp срезы обрабатывали 0.01% протеазой при температуре 37 С в течение 10 минут. 2. Иммуногистохимическая окраска. Иммуногистохимическую окраску проводили по вышеизложенному ABC-методу. Срезы инкубировали с первичными AT (Ki-S4, С 21, Ki-Mlp) при комнатной температуре в течение 60 минут. После промывки TBS-буфером срезы инкубировали с вторичными AT (биотин-связанные кроличьи anti-mouse IgM) при комнатной температуре в течение 30 минут и затем повторно промывали I BS-буфером. Затем срезы инкубировали с стрептавидин-биотиновым комплексом с пероксидазой (фирма DAKO, Hamburg, Germany; № К 377) при комнатной температуре в течение 30 минут и снова промывали IBS-буфером. Гак как в почечной гкани высока активность эндогенной пероксидазы, Ki-Mlp иммунную окраску выявляли АРААР методом (щелочная фосфатаза антищелочная фосфатаза) [56]. Для выявления пероксидазы испольювали раствор перекиси водорода с диаминобензидином: 18 мл IBS-буфера, 1 таблетка диаминобензидина (DAB; фирма Sigma) и 20 мкл перекиси водорода. Срезы, окрашенные стрептавиди-биотин-пероксидазным методом, докрашивали гематоксилином по Mayer. Срезы, окрашенные АРААР методом, докрашивали прочным красным. Затем срезы дегидратировали восходящими концентрациями этанола (70% - 90% - 100%) и ксилолом и заключали в полистерол (Pfertex, фирма Sigma).
Связь уровня экспрессии топоизомераз и выраженности моноцитарной инфильтрации с клиническими и морфологическими параметрами активности и прогрессирования почечного процесса
Уровень экспрессии ТОП I, На и степень моноцитарной инфильтрации изучены у 81 из 132 больных нефритом 1 группы. Биопсия почки всем больным проводилась до начала иммунодепрессивной терапии.
Исходя из того, что экспрессия ТОП I отражает метаболическую (биосинтетическую) активность клеток, а экспрессия ТОП На пролиферативную активность, важно проследить связь этих параметров с важнейшими морфологическими и клиническими проявлениями активности и прогрессирования нефритов, такими как инфильтрация и пролиферация клеток почечного клубочка (оцениваемые индексом активности), нарастание склеротических изменений в почечных клубочках и интерстиции (оцениваемые индексом склероза), степень почечной недостаточности, протеинурии и гематурии, наличие артериальной гипертензии.
С этой целью в группе, включавшей 81 больного с различными морфологическими вариантами нефрита, проведен монофакторный линейный регрессионный анализ, позволяющий выявить связь уровня жспрессии ГОГ1 I, ГОП IIa и степени моноцитарной инфильтрации (независимые переменные) с величиной индекса активности, индекса склероза, сывороточного креатинина, протеинурии, гематурии и наличием артериальной i инертен зии (зависимые переменные) (таблица П).
Выявлена достоверная прямая связь уровня жспрессии ТОП I в МК почечных клубочков с величиной индекса активности (ИЛ) и индекса склероза (ИС) и обратная связь с величиной протеинурии (Г1У). Уровень жспрессии ТОП I в эпителии почечных канальцев положительно коррелировал с величиной ИА.
Уровень жспрессии TOI1 Па в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев был прямо связан с величинами ИА и ИС, помимо того уровень экспрессии ТОП IIa в эпителии почечных канальцев был прямо связан с величиной сывороточного креатинина (Кр) и артериальной гипертензии (АГ), и обратно - с выраженностью ПУ.
По сравнению с экспрессией ТОП степень моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и интерстиции коррелировала с абсолютным большинством морфологических и клинических параметров: прямо - с величиной ИА, ИС, Кр и АГ, и обратно - с уровнем ПУ. Прямая связь выраженности моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках со степенью гематурии (ГУ) имела пограничный уровень значимости (р = 0,070).
Примечание. Монофакторный линейный регрессионный анализ. Представлены достоверные связи (р 0,05) и связи, имеющие пограничный уровень значимости.
Учитывая выявленную ранее сильную корреляционную взаимосвязь между уровнем экспрессии ТОП I, ТОП IIa и степенью моноцитарной инфильтрации (см. раздел 3.1, таблица 12), для выявления наиболее сильных из этих факторов, влияющих на морфологические и клинические параметры активности и прогрессирования почечного процесса, проведён многофакторный линейный регрессионный анализ. Для этого построено несколько многофакторных моделей - отдельно для каждой зависимой переменной (ИА, ИС, Кр, ПУ, ГУ и АГ). В качестве независимых переменных в эти модели вводился один и тоже набор факторов (уровень экспрессии ТОП I, ТОП IIa в МК почечных клубочков и эпителии почечных канальцев, степень моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках и интерстиции). При построении многофакторной модели признак оставался в модели при р 0,1 и удалялся из модели при р 0, i.
В результате получено шесть окончательных моделей, в которых остались комбинации наиболее сильных прогностических факторов, наилучшим образом связанных с зависимой переменной (таблица 14). Для ИА это были выраженность экспрессии ТОП I в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в интерстиции (таблица 14 модель 1а, рисунок 7); для ИС выраженность экспрессии ТОП IIa в МК почечных клубочков и моноцитарной инфильтрации в интерстиции (таблица 14 модель 16, рисунок 8). Величина сывороточного Кр была прямо связана с уровнем экспрессии IOI1 Пи в эпителии почечных канальцев и со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции (таблица 14 модель /в, рисунок 9). В свою очередь выраженность ПУ была прямо связана с уровнем экспрессии ГОП I в эпителии почечных канальцев и обратно с уровнем экспрессии ГОП I в МК почечных клубочков и выраженностью моноцитарной инфильтрации в интерстиции (таблица 14 - модель /«% рисунки 10, II, 12, 13). Уровень гематурии коррелировал только с выраженностью моноцитарной инфильтрации в почечных клубочках (таблица 14 - модель 1д, рисунок 14), а уровень артериальной гипертензии - со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции (таблица 14 - иодепь 1е, рисунок 15).
Таким образом, в данном разделе работы подтверждена связь между молекулярными механизмами клеточной активации, метаболизма (ТОП 1) и пролиферации (ТОП Па) и их реализацией на клеточно-тканевом уровне в процессе развития иммунного воспаления в почечных клубочках, канальцах и интерстиции (НА и ИС), а также связь с клиническими проявлениями активности и прогрессирования почечного иммунопатологическою процесса (Кр сыворотки, ПУ, ГУ и АГ ).
Важно подчеркнуть, что изученные молекулярные маркёры активации и пролиферации клеток и непосредственные индукторы воспалительного процесса (клетки мононуклеарного инфильтрата) тесно коррелировали с ИА - интегральным показателем воспалительной активности в клубочках, канальцах и интерстиции, они же были связаны и с интегральными показателями выраженности склеротических процессов в почечной ткани - ИС, что косвенно (методом статистического монофакторного корреляционного анализа) подтверждает фундаментальную роль активного воспаления в последующем развитии прогрессирующих склеротических процессов в почечной ткани.
Множественная линейная регрессия позволила выделить среди всех показателей (уровня экспрессии ТОП I, На и выраженности моноцитарной инфильтрации) те, которые наиболее сильно связаны с каждым из морфологических и клинических проявлений активности нефрита. Поэтому этот набор показателей может рассматриваться в качестве причин, индуцирующих иммунное воспаление и прогрессирование почечного процесса (таблица 14).
Важно отметить, что моноцитарная инфильтрация в интерстиции была неизменно связана как с морфологическими проявлениями активности и прогрессирования нефрита, так и с их клиническими эквивалентами, что хорошо согласуется с обсуждаемой в настоящее время в литературе ролью мононуклеарных клеток в повреждении и развитии иммунного воспаления, а также в инициации и контроле за развитием склеротических процессов в почечной ткани [141] (таблица 14; рисунки 7, 8, 12, 13 и 15).
Парадоксальная отрицательная связь между уровнем жспрессии ТОП I в МК почечных клубочков и степенью ПУ объясняется характером анализируемого материала (рисунок 11). Как уже установлено, высокий уровень жспрессии ГОП I в МК почечных клубочков выявлен при пролиферативных вариантах (в среднем 1,6 баллов см. раздел «Материалы и методы», 2.2.3. «Иммуногистохимичечское исследование») и низким при непролиферативных вариантах нефрита (в среднем 0,62 балла), в то время как для уровня ПУ имелась обратная шкономерносгь: менее выраженная Г1У была при пролиферативных вариантах (в среднем 3,1 г/сут.) и высокая (в среднем 8,7 г/сут.) при непролиферативных вариантах нефрита. Ге же закономерности объясняли отрицательную связь уровня ПУ со степенью моноцитарной инфильтрации в интерстиции (рисунок 13): выраженная моноцитарная инфильтрация при пролиферативных вариантах нефрита сопровождалась менее выраженной ПУ, наоборот меньшая степень моноцнтарной инфильтрации при непролиферативных вариантах нефрита сопровождалась высокой ПУ.
