Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор
1.1 Распространенность рака предстательной железы 14
1.2 Классификации рака предстательной железы 17
1.3 Методы диагностики рака предстательной железы 20
1.4Ангногенез при раке предстательной железы 34
1.5 Фактор роста эндотелии сосудов и его рецепторы FLT-1 и KDR. 39
1.6 Воздействие VEGF на клетки иммунной системы 44
Глава II. Материал и методы исследования
2.1.Характеристики больных, включенных в исследование 50
2.2 Морфологическая верификация . 51
2.3 Иммуногистохимичсское исследование 54
2.3.1 Анализ уровней экспрессии мРНК (3-актина, VEGF,
FLT-1 и KDR методом совмещенной ОТ/ПЦР.
2.3.2 Выделение тотальной клеточной РНК. 55
2.3.3. Проведение ОТ/ПЦР.
2.3.3.1 Проведение ОТ. 55
2.3.3.2 Проведение ПЦР. 56
2.4 Культивирование клеток. 58
Глава III. Значение традиционных методов исследования в дифференциальной диагностики рака предстательной железы
3.1. Клиническая характеристика больных с патологией предстательной железы 60
3.2 Биопсия предстательной железы 64
ГЛАВА IV. Результаты исследования факторов неоангиогенеза
4.1 Характеристика пациентов, в биоптатах которых исследованы уровень экпрессии мРНК VEGF и рецепторов к нему (KDR, FLT-1) 81
4.2 Анализ и оценка уровней экспрессии VEGF и рецепторов FLT-1 и KDR 83
4.3 Обработка результатов исследования с целью нахождения математической модели исследуемого объекта 95
Заключение 105
Выводы 115
Практические рекомендации 116
Список использованной литературы
- Классификации рака предстательной железы
- Морфологическая верификация
- Клиническая характеристика больных с патологией предстательной железы
- Анализ и оценка уровней экспрессии VEGF и рецепторов FLT-1 и KDR
Введение к работе
Заболевания предстательной железы являются самыми распространенными среди урологической патологии пациентов пожилого возраста, что вызвано развитием хронического простатита (ХП), доброкачественной гиперплазии (ДГПЖ) и рака предстательной железы (РПЖ), негативно влияющими на состояние мужского здоровья и продолжительности жизни. Гистологические признаки ДГПЖ отмечаются у 50% мужчин в возрасте 60 лет и в 90% случаев к 80 годам [6]. По данным М.А. Devies (1999), клинически неопределяемые очаги злокачественного перерождения предстательной железы выявляются у 15-30% мужчин старше 50 и у 80% мужчин старше 80 лет [196]. В настоящее время проблеме РПЖ уделяется большое внимание. В странах Западной Европы и США РПЖ составляет третью часть от всех злокачественных новообразований у мужчин. В 2004 году в США диагностировано 231 тыс. новых случаев заболевания и около 30 тыс. человек умерли от РПЖ [42, 138]. В России в 2003 г. в структуре онкологической заболеваемости мужчин РПЖ находился на 4-м месте после рака легкого, желудка и кожи. Число вновь выявленных случаев достигло 13,9 тыс [1]. В России более 60% таких больных при первичном обращении к врачу уже имеют отдаленные метастазы, у большинства пациентов изначально диагностируют местно-распространенные (38,5%) и метастатические (23,2%) опухоли [15, 25]. Запущенность болезни, а также состояние онкоурологической помощи в стране более точно отражаются в показателе смертности на первом году с момента установления диагноза, которая составляет около 30% [22]. Как правило, симптомы рака предстательной железы появляются уже на поздних стадиях, для которых характерно прорастание капсулы и распространение опухоли в окружающие ткани; на этой стадии рак уже неизлечим. В связи с этим, одним из важных клинических вопросов остается ранняя диагностика этого заболевания, так как до сих пор высок процент его позднего выявления (в стадии распространенных метастазов) [117, 204]. Основная трудность ранней диагностики: дифференциальная диагностика рака предстательной железы с доброкачественной гиперплазией, простатитом и др. заболеваниями, сопровождающимися расстройствами мочеиспускания. Велик удельный вес сочетания рака простаты с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) и хроническим простатитом, что снижает чувствительность, специфичность и точность таких известных методов обследования, как ПСА, пальцевое ректальное обследование простаты (ПРИ), УЗИ и/или ТРУЗИ, биопсии предстательной железы.
В настоящее время общепринятые методы диагностики РПЖ дополняются новыми параметрами, находящимися в состоянии изучения: плоидность ДНК, маркеры клеточной пролиферации, апоптоза, ядерные антигены пролиферирующих клеток, плотность микрососудов, округлость и размер ядер, состояние хроматина, топография зон в ядре окрашиваемых серебром и др. Широко обсуждаются факторы, основанные на результатах трансректалыюй мультифокальной биопсии предстательной железы. Продолжается поиск клинически значимых молекулярных маркеров при РПЖ с целью уменьшения количества биопсий простаты, и уменьшению частоты осложнений после них. По данным A.V. Bono (2000) около 40% больных с отрицательной первой биопсией имеют показания для повторной биопсии однако на третью биопсию соглашается только 33% пациентов, которым это исследование предлагается и то только в случаях появления клинических признаков заболевания простаты [43]. В настоящее время идёт накопление данных, подтверждающих участие факторов роста в развитии и прогрессировании рака предстательной железы.
Рост и развитие ткани здоровой и поражённой раком предстательной железы тесно связаны с наличием кровеносных сосудов в ткани [47]. Адекватное кровоснабжение является решающим моментом при обеспечении тканей питательными веществами, и сосудистый эндотелий выделяет несколько активных веществ, которые ведут себя как паракринные непромедиаторы роста клеток предстательной железы и в случае РПЖ способствуют прогрессированию рака [237].
В отсутствие кровоснабжения опухоли получают кислород и питательные вещества путем диффузии и обычно не достигают размеров более 1-2 мм в диаметре. В бессосудистых опухолях темпы клеточного роста равны темпам их гибели, поэтому опухоль остается в «спящем» состоянии до тех пор, пока в ней не начнется рост кровеносных сосудов из близлежащих капилляров - процесс, известный как ангиогенез [35, 142, 164]. Начало ангиогенеза ведет к формированию нового кровоснабжения и облегчает быстрый рост и метастазирование опухоли, ставшей благодаря этому активной. Хотя в опухолевом ангиогенезс участвует несколько ростовых факторов, установлено, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является самым мощным и доминирующим медиатором этого процесса [35, 164]. После секреции опухолью VEGF связывается с рецепторами на близлежащих сосудистых эндотелиальных клетках, непосредственно стимулируя рост новых сосудов. Существует два разных, но структурно близких, рецептора VEGF, расположенных на поверхности эндотелиальных клеток сосудов. Эти рецепторы, известные как рецептор Flt-1 (VEGFR 1 типа) и рецептор KDR (VEGFR 2 типа) [164]. Рецептор KDR отвечает за пролиферацию клеток эндотелия сосудов, a FLT-1 за дифференцировку и формирование капилляра [51, 155, 164]. VEGF также играет ключевую роль в поддержании функционирования недавно сформировавшихся кровеносных сосудов опухоли, которые сохраняют черты незрелости даже по мере своего роста [164]. По мере прогрессирования опухолевого ангиогенеза, новые капилляры прорастают в опухоль, поддерживая ее рост и развитие [106, 107]. VEGF увеличивает проницаемость сосудов и оказывает митогенное действие на клетки сосудистого эндотелия. Показано, что увеличение количества VEGF в крови человека со статистически достоверной вероятностью указывает на развитие опухолевого процесса, в том числе новообразований предстательной железы [141, 153, 214].Важно отметить, что лабораторные исследования вышеуказанных маркеров и использование их в клинической практике в нашей стране находятся на начальной стадии. Напротив, за рубежом изучению этой научной проблемы уделяется много внимания. В связи с этим проведение исследования, посвященного изучению уровней экспрессии мРНК фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и рецепторов к нему (KDR, FLT-1) клетками новообразования при раке, доброкачественной гиперплазии предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазии, является актуальной научно-практической задачей.
Классификации рака предстательной железы
Предстательная железа представляет собой сложный экзо- и отчасти эндокринный орган. Основные клетки протоков и ацинусов всех зон -секреторные клетки. Они вырабатывают большое количество компонентов семенной жидкости: лимонную кислоту, фибролизин, простатический специфический антиген, кислую фосфатазу. Клетки железистого секреторного эпителия экспрессируют цитокератины 8, 18, 19, эпителиальный мембранный антиген, а также простатический специфический антиген и простатическую кислую фосфатазу. Внутренние взаимодействия между стромой железы и железистым эпителием чрезвычайно сложны и до конца не изучены. Нарушение баланса между различными ауто- и паракринными факторами приводит к развитию в предстательной железе различных патологических процессов: воспалительных, паранеопластических и неопластических. Многообразие клеток, в норме составляющих ткань предстательной железы, приводит к большому количеству вариантов злокачественных опухолей [29].
Морфологически злокачественные опухоли предстательной железы подразделяются на эпителиальные и не эпителиальные. В свою очередь эпителиальные опухоли делятся на железистые новообразования аденокарцинома, карцинома с веретеноклеточной дифференцировкой; простатическая интраэпителиальная неоплазия (PIN), протоковая аденокарцинома), уротелиальные опухоли, плоскоклеточные опухоли, базально-клеточные опухоли, недифференцированную карциному [98, 99].
Все виды атипической гиперплазии предстательной железы -факультативный предрак. Для описания атипичных изменений в периферической зоне используют термин - простатическая интраэпителиальная неоплазия (PIN), в центральной зоне - атипическая аденоматозная гиперплазия [19].
Простатическая интраэпителиальная неоплазия — клеточная пролиферация выстилающего эпителия простатических протоков и ацинусов, ограниченного эпителиальным слоем и прогрессирующей утратой маркеров секреторной дифференцировки и патологическими изменениями ядер и ядрышек, плотностью микрососудов, генетической нестабильностью и содержанием ДНК. В настоящее время выявляется несколько видов ПИН: плоская, пучковая, микропапиллярная, криброзная [19].
Ввиду редкой встречаемости неэпителиальных опухолей предстательной железы и различных вариантов рака гистологические свойства этих опухолей при определении стадии заболевания (по системе TNM) не учитываются. В то же время, степень дифференцировки типичной аденокарциномы учитывается при выставлении диагноза, определения стадии и прогноза течения заболевания.
В настоящее время наиболее широко применяется гистологическая классификация Глисона, так как она во многом отвечает требованиям, необходимым при выборе тактики лечения и прогноза заболевания [134].
По классификации Глисона степень дифференцировки опухоли разделяется на пять градаций. Классификация Глисона основана на степени дифференцировки железистых структур опухоли. Опухоль по показателю Глисона 1 образуют практически нормальные железы, структура которых по мере увеличения показателя Глисона утрачивается, и при показателе 5 опухоль характеризуется недифференцированными клетками. Чем больше утрачена дифференцировка тканей, тем хуже прогноз у данного больного.
За редким исключением, рак предстательной железы имеет неоднородную структуру. Поэтому для того, чтобы подсчитать показатель Глисона, суммируют две наиболее часто встречающиеся градации.
Анализ исходов выжидательной тактики в лечении рака предстательной железы показал, что у больных с показателем Глисона менее 4 опухоль метастазировала в 2.1% случаев в год, у больных с показателем Глисона от 5 до 7 - в 5.4% случаев и у больных с показателем Глисона более 7 - в 13.5% случаев [148, 205].
Чтобы быть подсчитанным, тип структуры (дифференцировка) должен занимать более 5% материала биопсии. Для системы подсчёта необходим материал биопсии (материалы прицельной биопсии или операционный материал); цитологические препараты использовать нельзя. При сопоставлении классификации, предлагаемой Глисоном, с применяемой в основном в Европе, системой Всемирной организации здравоохранения, которая предусматривает 3-х градационное деление клеток (G1 - G2 - G3) на высоко-, средне- и низкодифференцированные, и заключение дается по наиболее низкой дифференцировке клеток.
При сравнении этих двух классификаций выступает их неполная совместимость. Например, показатели Глисона от 2 до 4 могут быть отнесены к высокодифференцированной опухоли, а показатель Глисона от 8 до 10 к низкодифференцированной опухоли, но нельзя сравнить показатель Глисона от 5 до 7 с опухолью средней дифференцировки. Было выявлено, что опухоли с показателем Глисона 7 значительно более агрессивны, чем раки с показателем Глисона от 5 до 6.
Смертность, в зависимости от степени дифференцировки опухоли, составляет 40% при высокодифференцированной, 54% при умеренно дифференцированной и 72% при низкодифференцированной аденокарциноме [148, 205]. Принимая во внимание то, что большинство локальных являются умеренно дифференцированными, можно предположить, что более 50% больных, не подвергшихся радикальному лечению, погибнут от этого заболевания в течение 15 лет.
Морфологическая верификация
Как показывают представленные данные, количество пациентов в возрасте от 60 до 69 лет составило 47 (44%) мужчин, в возрасте от 70 до 79 лет - 39 (37%) мужчин, в возрасте от 51 до 59 лет - 18 (17%) мужчин, в возрасте старше 80 лет - 2 (2%) мужчин, соответственно.
Всем пациентам было проведено комплексное обследование, включающее клиническое исследование, пальцевое ректальное исследование предстательной железы (п=212), трансректальное ультразвуковое исследование (п=106), трансабдоминальное УЗИ исследование печени, почек, мочевого пузыря и забрюшинных лимфатических узлов (п=106),4 уровень общего простат специфического антигена в сыворотке крови (п=106), рентгенографию костей скелета (п=106), обзорную рентгенографию органов грудной клетки (п=106). Всем пациентам с целью верификации диагноза и определения дальнейшей тактики лечения произведена мультифокальная биопсия предстательной железы трансректальным доступом с последующим патоморфологическим исследованием образцов (п=106).
Клиническое исследование было традиционным и включало изучение жалоб, анамнеза жизни, анамнеза заболевания, данных объективного исследования, общепринятых в урологии.
Пальцевое ректальное исследование проводилось всем больным. При этом уделялось внимание таким параметрам как размер, консистенция, состояние поверхности, наличие узловых образований, симметрии, границам железы, сохранение срединной бороздки, наличие смещаемости предстательной железы относительно окружающих органов и тканей.
Рентгенологический метод - рентген органов грудной клетки и костей скелета проводились на аппарате GE Hispeed СТ. УЗИ - исследование почек, печени, забрюшинных лимфатических узлов, мочевого пузыря проводилось на аппарате «Алока - 1700» методом трансабдоминалыюго сканирования. Предстательная железа исследовалась трансабдоминальным и трансректальным методами.
При трансректалыюм методе использовались высокочастотные датчики 5- 7 мегагерц, с высокой разрешающей способностью.
Для получения биоптатов проводилась мультифокальная биопсия под контролем сонографии на аппарате «Алока-1700», оснащенным трансректальным датчиком с частотой 5-7 мегагерц. После введения ректального датчика в прямую кишку проводилось контрольное ультразвуковое исследование предстательной железы, семенных пузырьков, парапростатической клетчатки, передней стенки прямой кишки, простатического отдела мочеиспускательного канала и шейки мочевого пузыря. В пункционный канал ректального датчика вводился адаптер, соответствующий калибру пункционной иглы, по нему непосредственно к зоне биопсии подводили пункционное устройство (полуавтоматический биопсийный пистолет фирмы «Magnum - Bard» (США)) с биопсийной иглой. Длина биопсийной иглы - 20 см, диаметр - 1,5 мм. Использовались иглы для аспирационно-режущей биопсии типа True-cut G16. При проведении биопсии получали столбики ткани длиной 18-20 мм, толщиной 1,4 мм. Используя трансректальную методику пункционной биопсии, прицельно получали материал из подозрительных зон периферической и переходной областей предстательной железы. При отсутствии эхографических признаков опухолевого поражения предстательной железы выполняли стандартную сектантную биопсию. При этом забирался материал из 6 точек предстательной железы: по 3 биоптата из периферических зон, верхушки и основания каждой доли. У пациентов, включенных в исследование показаниями к биопсии простаты являлись: изменения, выявляемые в предстательной железе при ПРИ; повышение уровня ПСА выше порогового значения или возрастной нормы.
В настоящем исследовании клиническую стадию РПЖ определяли по Международной классификации TNM (2002) [215]. Гистопатологическая диффереіщировка железистых структур опухоли осуществлялась с учетом классификация по градации Глисона (по G. David, D.G. Bostwick, 1997).
Гистологический материал для патоморфологического исследования был получен путем пункционной биопсии (п=106), либо после проведения операции чрезпузырной аденомэктомии тем пациентам, у которых после патоморфологического исследования верифицирована доброкачественная гиперплазия предстательной железы (п=8).
Полученные путем биопсии простаты столбики ткани длиной 18-20 мм, толщиной 1,5 мм, после извлечения с иглы промывались в течении 4-5 с в 0,9% растворе NaCl, при помощи полоски фильтрованной бумаги переносились на стерильное предметное стекло и скальпелем разделялись на 2 равноценные части, одна из которых помещалась до исследования в морозильную камеру при - 70 - 80С, а оставшаяся часть переносилась в маркированный контейнер с 10% раствором формалина (рН = 7,4) для патоморфологического исследования. В сопроводительном направлении указывалась клиническая информация о больном (в т.ч. и уровень ПСАобщ) и подробная расшифровка маркировки препарата. Если в качестве исследуемого препарата использовался материал после аденомэктомии, то из каждой доли аденомы предстательной железы выделялись по кусочки 0,5 х 0,5 см3, которые также промывались в течении 4-5 с в 0,9%) растворе NaCl и помещались до исследования в морозильную камеру при -70 - 80С.
Обработка полученных образцов осуществлялась по стандартной гистологической методике в патологоанатомическом отделении Городской клинической больницы № 29 г. Москвы. Иммуногистохимические исследования проводились в лаборатории научно-исследовательского института экологии человека г. Москвы.
Клиническая характеристика больных с патологией предстательной железы
Материалы диссертации составили результаты клинических, лабораторных, патоморфологических и иммуногистохимических исследований 106 пациентов с подозрением на РПЖ находившихся на обследовании и лечении в I и II урологических отделениях Городской клинической больницы № 29 г. Москвы. В результате изучения анамнеза и клинического обследования данных пациентов нами выявлены следующие особенности.
Возраст большинства исследуемых пациентов составлял от 60 до 80 лет. Поскольку распространенность РПЖ тесно коррелирует с возрастом, представляющим собой основной фактор риска развития злокачественных новообразований предстательной железы, поэтому мужчины старше 50 лет составляют основу группы для популяционного скрининга по поводу данной патологии.
При поступлении в стационар пациенты предъявляли жалобы на дизурические явления, такие как никтурия, поллакиурия, странгурия, ишурия, а также некоторые из них отмечали гематурию и боли в пояснично-крестцовом отделе позвоночника и костях таза. Характеристика основных жалоб, предъявляемых пациентами представлена в табл. 4.
Как видно из приведенных данных, 5 пациентов (5%) отмечали боли в пояснично-крестцовом отделе позвоночника и костях таза. У 12 пациентов (11%) наблюдались явления макрогематурии. По данным литературы известно, что макрогематурия чаще является осложнением ДГПЖ и встречается в 15-18% случаев [6]. Источником гематурии наиболее часто становятся расширенные и варикозно измененные вены шейки мочевого пузыря. Значительно реже гематурия наблюдается при РПЖ [14]. В то же время появление болей в позвоночном столбе и костях таза связано с метастазированием РПЖ и не встречается при ДГПЖ и ХП. В связи с этим, у пациентов, предъявляющих жалобы, на боли в костях можно заподозрить наличие метастатического РПЖ. Однако, на основании жалоб заподозрить рак предстательной железы, особенно на ранних стадиях, не представляется возможным.
Пальцевое ректальное исследование является начальным этапом диагностики РПЖ и определения клинической стадии процесса. При проведении ПРИ обращают внимание на контуры железы, её консистенцию, подвижность, наличие узловых образований, выраженность междолевой бороздки, смещаемость слизистой прямой кишки. Характеристика данных ПРИ пациентов, с подозрением на РПЖ, представлена в табл.5.
Как показывают результаты исследования, у 91 (85%) пациента прослеживалось увеличение размеров предстательной железы, причем у 45 (42%) мужчин при исследовании наблюдалась ассиметрия железы и у 81 (76%) пациента наблюдалась сглаженность срединной бороздки. Изменения предстательной железы, которые позволили заподозрить ее злокачественное перерождение, такие как бугристая поверхность, нечеткие контуры железы и наличие изолированных узлов наблюдалось у 57 (53%) пациентов.
Наиболее информативным из современных инструментальных методов диагностики заболеваний простаты является трансректальное ультразвуковое исследование предстательной железы. ТРУЗИ позволяет не только визуализировать опухолевый узел в ПЖ, но и оценить его размер, а также отношение к капсуле железы и семенным пузырькам (табл.6). Как показывают результаты обследования пациентов посредством ТРУЗИ, у 89 пациентов (84%) объем предстательной железы составлял более 30 см3. У 81 пациента (77%) контуры предстательной железы были четкие, ровные. У 71 мужчины форма предстательной железы визуализировалась симметричной, гипоэхогенные участки в предстательной железе выявились у 46 пациентов (43%). В ходе проведения ТРУЗИ обращалось внимание на искаженность контуров предстательной железы, неоднородность паренхиматозных сигналов, наличие пенетрации капсулы железы. Такие изменения выявлены у 87 (81%) пациентов. Таким образом, трансректальное ультразвуковое исследование оказалось более чувствительным по сравнению с пальцевым ректальным исследованием.
В настоящее время наиболее ценным опухолевым маркером, исследование которого в сыворотке крови необходимо для диагностики и наблюдения за течением гиперплазии и рака предстательной железы является простат специфический антиген.
Анализ и оценка уровней экспрессии VEGF и рецепторов FLT-1 и KDR
Для оценки уровней экспрессии исследуемых факторов были выбраны соотношения VEGF/p-актин, FLT-1/р-актин, KDR/p-актин, FLT-1/VEGF, KDR/FLT-1, KDR/VEGF и KDR+FLT-1/VEGF. Этот выбор был сделан по двум причинам. Во-первых, были определены отношения уровней экспрессии мРНК вышеуказанных факторов к уровню экспрессии мРНК гена, кодирующего р-актин. Ген, кодирующий р-актин, является конститутивным и его экспрессия в клетках имеет постоянный характер. Таким образом, определение отношений уровней экспрессии VEGF, KDR, FLT-1 к р-актину позволило понять, при каких исследуемых заболеваниях простаты и насколько изменяется уровень экспрессии исследуемых факторов относительно стандартного уровня экспрессии конститутивного гена.
Во-вторых, необходимо было определить не только уровень экспрессии отдельных факторов, но и сравнить их между собой, поскольку важным для полноценной передачи сигнала и его физиологическим проявлением является определенное отношение между уровнями экспрессии лиганда (VEGF) и рецепторов к нему (KDR, FLT-1).
Для каждой группы были определены средние значения всех семи исследуемых отношений уровней экспрессии (табл. 16).
Как показывают результаты исследования, в гормонорезистентной линии РПЖ, DU 145, в отличие от гормоночувствительной, LNCaP, определяется, незначительная экспрессия мРНК рецептора KDR, ответственного за пролиферацию клеток эндотелия сосудов. В то же время, уровень экспрессии мРНК VEGF/p-актин в линии DU 145 в 2 раза меньше, чем в линии LNCaP. Принимая во внимание то, что уже через 18-25 месяцев после начала антиандрогенной терапии у большинства больных развивается гормонорезистентность опухоли, а также прогрессирование и метастазирование [16], следовательно, возникновение гормонорезистентности сопровождается уменьшением экспрессии VEGF, и одновременным увеличением экспрессии рецептора пролиферации KDR. Однако, по данным литературы, возникновение гормонорезистентности связано с утратой андрогеновых рецепторов и пролиферативной активности [16]. В связи с этим можно предположить, что на фоне снижения уровня пролиферации клеток при гормонрефрактерном раке происходит увеличение экспрессия рецептора, ответственного за пролиферацию эндотелиоцитов. В то же время причина уменьшения экспрессии фактора роста эндотелия сосудов при этой форме рака не вполне ясна. В настоящее время проводятся исследования по эффективности анти-VEGF терапии [35, 142]. В связи с этим можно предположить, что применение препаратов, механизмом действия которых является блокирование VEGF и рецепторов к нему, будут более эффективным на этапе гормонозависимой опухоли.
Для обработки полученных данных использовались несколько современных статистических методов. При статистической обработке данных выяснилось, что во многих группах отсутствует нормальное распределение выборки. Учитывая, также, небольшой размер исследуемых выборок, для анализа результатов были использованы непараметрический t-критерий Манна-Уитни и метод наименьших квадратов [2, 5]. На рис. 4 показан пример электрофоретического разделения ПЦР-продуктов фрагментов генов, кодирующих VEGF (A), FLT-1 (Б), KDR (В) и Р-актин (Г).
Анализ экспрессии генов KDR (A), FLT-1 (Б), VEGF (В) и (3-актина (Г) методом ОТ/ПЦР в двух исследуемых образцах биоптатов предстательной железы. Стрелками указаны размеры специфических ОТ/ПЦР - продуктов агарозного геля, окрашенного "SYBRGreenI".
В результате проведенных исследований между группами ХП, ДГПЖ, ПИНЗ и РПЖ статистически достоверными были признаны различия в средних значениях отношения уровней экспрессии мРНК KDR/FLT-1 (t-критерий Манна-Уитни, р 0,05). На рис. 5 показано последовательное увеличение значений отношения уровней экспрессии KDR/FLT-1 от группы ХП к группе РПЖ. У больных раком предстательной железы среднее значение отношения уровней экспрессии мРНК KDR/FLT-1
больше в 23 раза, чем у больных хроническим простатитом, в 7 раз больше, чем у больных ДГПЖ и в 2 раза больше, чем у больных с выявленной ПИН высокой степени.
Отношение уровней экспрессии мРНК KDR/FLT-1 Среднее значение отношения уровней экспрессии KDR/p-актин (относительного уровня экспрессии KDR) у больных с выявленной ПИН высокой степени превышало таковое в 2,5 раза, чем у больных ДГПЖ, и было меньше в 2 раза, чем у пациентов, страдающих РПЖ. Однако, все эти соотношения были признаны статистически не достоверными (р 0,05, рис.6).
