Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство способных к пролиферации клеток многоклеточных организмов может вступать в S-фазу в ответ на целый ряд факторов роста благодаря наличию на поверхности рецепторов для каждого из них. Хотя основной результат действия этих факторов, то есть репликация ДНК, одинаков, однако до сих пор не вполне ясно, эквивалентны ли промежуточные внутриклеточные события, вызываемые разными факторами роста. Недавние исследования показывают возможность отмыва от факторов роста клеток, находящихся в процессе перехода от состояния покоя к пролиферации (в так называемом пререпликативном периоде), с почти полным снятием стимуляции синтеза ДНК (Zhan et al., 1993). Это обстоятельство делает осуществимой замену факторов роста в пререпликативном периоде и выяснение того, способен ли один ростовой фактор передавать пролиферативную эстафету другому. Остаются малоисследованными и другие аспекты действия факторов роста на клетки. Практически все исследования влияния ростовых факторов на клетки проведены на покоящихся культурах, подвергавшихся стимуляции этими факторами и переходившими из состояния GO в клеточный цикл. В то же время, мало изучено влияние различных факторов роста на прохождение G1-периода постоянно циклирующими клетками. Не проведено систематических сравнительных исследований зависимости клеточной чувствительности к различным митогенам от такого важнейшего фактора микроокружения, как плотность культуры. Еще один важный параметр состояния клеток, влияние которого на их способность к митогенной стимуляции остается недостаточно изученным, — это их "пролиферативный возраст". _ Подавляющее большинство исследований чувствительности стареющих клеток к митогенам проведено на диплоидных фибробластах человека. Эти клетки характеризуются большой гетерогенностью и к тому же отличаются очень низким содержанием рецепторов для некоторых ростовых факторов, таких, например, как факторы роста фибробластов (FGF). Стандартной и наиболее удобной моделью для изучения регуляции пролиферации являются мышиные клетки линий ЗТЗ, однако, эти клетки иммортализованы и не стареют в культуре. Тем не менее, в свете современных представлений о роли фермента теломеразы в поддержании иммортализованного фенотипа клеток представилось возможным попытаться вызвать искусственное старение клеток ЗТЗ, подавляя активность теломеразы химическими агентами, такими как ингибиторы обратных транскриптаз, поскольку теломераза относится именно к этому классу полимераз. Таким образом, представляется целесообразным изучение в рамках одной работы таких актуальных проблем молекулярной и клеточной биологии, как зависимость действия факторов роста на пролиферацию фибробластоподобных клеток от положения клеток в цикле, а также от плотности и пролиферативного возраста культуры.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование влияния нескольких ростовых факторов на пролиферацию фибробластоподобных клеток . В качестве основного объекта была использована культура мышиных клеток ЗТЗ Swiss.
Сравнивали такие факторы роста, как FGF-1, PDGF-BB, EGF, а также такой сложный стимулятор роста, как сыворотка крови.
В работе решались следующие непосредственные задачи:
1. Определить, сколь длительно необходимо стимулировать покоящиеся
клетки различными факторами роста для эффективного вхождения в S-
период.
2. Выяснить, можно ли заменить один фактор роста на другой на раннем и
позднем этапах перехода от состояния покоя к репликативной фазе без
ущерба для последующего вступления в S-период и таким образом узнать,
эквивалентны ли события, вызываемые разными факторами роста в
раннем и позднем пререпликативном периоде.
3. Сравнить способность различных факторов роста стимулировать
прохождение Gl-периода клетками логарифмически растущей культуры.
4. Определить, как зависит эффективность пролиферативной стимуляции
клеток различными факторами роста от плотности покоящейся культуры.
5. Исследовать возможность индукции искусственного старения
иммортализованных фибробластов мыши путем подавления функции
теломеразы ингибиторами обратных транскриптаз.
6. Определить чувствительность клеток, претерпевших искусственное
старение, к различным факторам роста.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые была продемонстрирована возможность замены одного фактора роста на другой в раннем пререпликативном периоде без потери скорости вступления клеток в S-фазу, что свидетельствует о пролиферативной эквивалентности событий, вызываемых различными факторами в этом периоде. При этом была показана необходимость постоянного присутствия факторов роста на протяжении практически всего пререпликативного периода для эффективного вступления в репликативную фазу. Вместе с тем, обнаружено, что в позднем пререпликативном периоде FGF-1 не способен принимать пролиферативную эстафету от сыворотки и PDGF-BB. Необходимость длительной стимуляции клеток FGF-1 и сывороткой для достижения максимального пролиферативного эффекта показана как для плотных, так и для редких культур ЗТЗ Swiss. Вместе с тем, обнаружено, что PDGF-BB, действуя на редкие культуры, дает максимальную стимуляцию синтеза ДНК даже при 3-х часовом действии. Впервые обнаружено, что в отличие от PDGF-BB и сыворотки, FGF-1 не только не стимулирует вступление в S-период клеток логарифмически растущей культуры, находящихся в G1 периоде, но и подавляет это вступление. Продемонстрировано, что длительное культивирование клеток ЗТЗ Swiss в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз азидотимидина и карбовира, подавляющих функцию теломеразы, вызывает процесс, напоминающий клеточное старение, который выражается в почти полном прекращении роста клеток и приобретении ими фенотипа, характерного для стареющих фибробластов. При отмыве ингибиторов клетки вновь вступают в пролиферацию, причем во многих из митотических клеток обнаруживаются полиплоидные наборы хромосом. Стимуляция предварительно переведенных в бессывороточную среду клеток, претерпевших "искусственное старение", сывороткой, FGF-1 и PDGF-BB приводит к столь же выраженному вступлению в S-период, как и при стимуляции нормальных клеток. При этом сохраняется необходимость в длительной стимуляции для достижения максимального синтеза ДНК. Полученные результаты способствуют более глубокому
пониманию механизмов экзогенной регуляции клеточной пролиферации и представляют интерес для поиска новых подходов в терапии опухолей.
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (1996, Санкт-Петербург), на 36-ой ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (1996, San Francisco) и на Первом съезде онкологов стран СНГ (1996, Москва).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
Список литературы содержит наименования, из них иностранных
