Содержание к диссертации
Введение
1. Клеточный цикл 9
1.1 Универсальная теория клеточного цикла 9
1.2 Белковые регуляторы клеточного цикла 10
1.2.1 Белки семейства Rb 10
1.2.2 Комплексы Cdk/циклин в середине G1 периода 12
1.2.3 Комплексы Cdk/циклин в позднем G1 периоде 13
1.2.4 Комплексы Cdk/циклин в S и G2 фазах 14
1.2.5 Семейство Cdk ингибиторов INK4 15
1.2.6 Семейство Cdk ингибиторов CIP/KIP 16
2. Факторы роста 18
2.1. Факторы роста фибробластов 18
2.1.1. Структура, регуляция синтеза и внутриклеточная локализация FGF 19
2.1.2. Рецепторы FGF и HSPG 21
2.2. Тромбоцитарный фактор роста 23
2.2.1. Структура и регуляция биосинтеза PDGF 24
2.2.2. Семейство рецепторов PDGF 25
2.3. Сыворотка крови 26
2.4. Активация тирозинкиназных рецепторов факторами роста 29
3. Пролиферативное старение и покой 31
3.1. Пролиферативнын покой 31
3.2. Пролиферативное старение 32
4 Материалы и методы 35
4.1 Клеточные культуры и условия культивирования клеток 35
4.2 Перевод клеток в состояние пролиферативпого покоя 36
4.3 Факторы роста 36
4.4 Приготовление радиоавтографических препаратов 37
4.5Анализ препаратов, меченных Н-тимидином 37
4.6 Построение кривых роста 38
4.7 Получение белковых лизатов 38
4.8 Иммунопреципитация 38
4.9 Иммуноблоттинг 39
4.10 Определение киназиой активности комплекса Сбк2/циклші Е 39
4.11 ИммуЕіоистощениер21 ир27 40
4.12 Выделение РНК и Норзерн блот 40
4.13 Инфекция клеток Swiss ЗТЗ аденовирусом, кодирующим циклин Л или GFP 41
4.14 Получение клонов, экспрессирующих антисмысловую РНК р21 41
4.15 Иммуно флуоресцентная конфокальная микроскопия 41
4.16 Проточная цитометрия 42
4.17 Пролиферативный эффект FGF-1 и PDGF-AB на клетки Swiss ЗТЗ 43
4.18 Определение способности клеток Swiss ЗТЗ проходить более одного клеточного цикла при их стимуляции FGF-1 и PDGF-AB 44
4.19 Динамика вступления в репликацию клеток Swiss ЗТЗ, стимулированных сывороткой после длительной стимуляцшш FGF-1 48
4.20 Митогенный ответ клеток Swiss ЗТЗ на сыворотку после длительной стимуляции FGF-1 и PDGF-AB 49
5. Молекулярно-биологическое исследование пролиферативного состояния клеток, находящихся в первом и во втором клеточном циклах после их стимуляции FGF-1 и PDGF-AB 50
5.1 Уровень фосфорилирования рецепторов FGF и PDGF 50
5.2 Уровень фосфорилирования МАРК 52
5.3 Сравнение экспрессии генов раннего и задержанного ответа 52
5.4 Экспрессия цикли нов и циклинзависимых киназ 55
5.5 Экспрессия ингибиторов Cdk 57
5.6 Уровень циклииов в стареющей культуре HUVEC 58
6. Сравнение митогенного ответа на факторы роста в стареющих культурах фибробластов мышей SAMP-1 и SAMR-1 59
7. Искуственная экспрессия циклина А не вызывает вступления во второй клеточный цикл клеток Swiss ЗТЗ, стимулированных FGF-1 60
8. Внутриклеточное распределение р21 и р27 в клетках Swiss ЗТЗ, стимулированных FGF-1, PDGF-AB или сывороткой 62
9. В клетках, стимулированных FGF-1 и PDGF-AB, р21 и р27 связаны с комплексом Сс1к2/циклші Е во втором клеточном цикле 64
10. Снижение активности комплекса С(1к2/циклин Е во втором клеточном цикле после стимуляции клеток FGF-1 и PDGF-AB 66
11. Влияние экспрессии антисмысловой РНК р21 (as р21) на вхождение клеток во второй цикл после стимуляции FGF-1 67
Обсуждение результатов 69
- Белковые регуляторы клеточного цикла
- Тромбоцитарный фактор роста
- Определение киназиой активности комплекса Сбк2/циклші Е
- Сравнение экспрессии генов раннего и задержанного ответа
Введение к работе
За последние три десятилетия описано множество полипептидпых факторов роста (ПФР), а также накоплено огромное количесто данных о механизмах их действия. ПФР являются регуляторами клеточных функций, включая пролиферацию, миграцию, дифференцировку и выживание/апоптоз. Стимуляция клеток ПФР является сложным процессом, заключающимся в передаче внеклеточного сигнала внутрь клетки. Ключевое событие этого процесса - это связывание фактора роста со специфическим рецептором, находящимся на поверхности клетки, что приводит к активации сигнальных каскадов, которые достигают ядра и вызвают транскрипцию белковых факторов, управляющих пролиферацией и дифференцировкой, или напрямую влияют на функции клеточных белков, таких как ферменты и белки цитоскелета.
Большинство исследований молекулярных механизмов действия ПФР ограничивается лишь кратковременной стимуляцией клеток. Однако, изучение биохимического состояния клеток при длительной стимуляции ПФР представляет практическое значение в связи с увеличивающимся интересом к применению факторов роста в клинике, например при лечении ран и хронических язв, регенерации кровеносных сосудов и сердечной мышцы (Waltenbergcr, 1997; Kunimoto, 1999; Lirnat and French, 1999; Payne et a!., 2001; Heilmann et al., 2002).
Неисследованным остается обнаруженный более 20 лет назад парадокс: с одной стороны, ПФР способны вызывать вступление в S период клеток, находящихся в состоянии пролиферативного покоя, с другой стороны, они обычно не способны поддерживать постоянную пролиферацию клеток в культуре, когда применяются индивидуально.
Таким образом, несмотря па накопленные впечатляющие знания о ростовых факторах, множество аспектов механизмов их действия все еще остаются не исследованными.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение длительного воздействия ПФР, в частности FGF-1 и PDGF-AB, на пролиферацию клеток. В качестве модели нормальных ^трансформированных клеток были выбраны фибробласты линии Swiss ЗТЗ.
В ходе работы предстояло решить две основные задачи:
1, определить на каком этапе происходит остановка пролиферации клеток при
длительной стимуляции FGF-1 и PDGF-AB;
2. охарактеризовать состояние клеток при длительной стимуляции FGF-1 и PDGF-
AB, а именно:
2.1. определить фосфорилированис рецепторов FGF и PDGF;
исследовать активацию МАР киназ;
исследовать индукцию генов раннего и задержанного ответов;
проверить уровень циклинзависимых кипаз (Cdk) и циклинов;
определить уровень ингибиторов Cdk и их внутриклеточную локализацию.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе было исследовано влияние продолжительной стимуляции FGF-1 и PDGF-AB на пролиферацию клеток Swiss ЗТЗ. Впервые было показано, что блок пролиферации при стимуляции клеток Swiss ЗТЗ FGF-1 и PDGF-AB происходит в G1 периоде второго клеточного цикла.
В работе биохимически охарактеризовано состояние клеток после блока пролиферации во втором цикле при их стимуляции FGF-1 и PDGF-AB. Показано, что рецепторы FGF (FGFR1) и PDGF-AB (PDGFRP) остаются фосфорилированными во втором цикле, так же как и MAP киназы Erkl и Егк2, проводящие пролиферативпый сигнал в клеточные ядра. Во втором цикле при стимуляции клеток FGF-1 наблюдается экспрессия м-РНК генов раннего (c-jun, c-myc) и задержанного (ODC) ответов.
Показано, что в клетках, блокированных во втором клеточном цикле при их стимуляции FGF-1 и PDGF-AB, выражена экспрессия циклинов D1 и Е, но отсутствует экспрессия циклина А. Искусственная экспрессия циклина А не приводит к увеличению доли клеток, вступающих во второй цикл при стимуляции FGF-1.
В работе также показано, что в клетках, стимулированных FGF-1, значительно повышена экспрессия ингибитора Cdk, р21, в то время как при стимуляции PDGF-AB в клетках наблюдается аккумуляция р27. р21 и р27 находятся в комплексе Сйк2/циклин Е при стимуляции клеток соответственно FGF-1 или PDGF-AB и ингибируют активность этого комплекса во втором цикле. Используя антисмысловую м-РНК р21, показано, что повышенная экспрессия р21 является одной из причин, блокирующих пролиферацию клеток Swiss ЗТЗ при стимуляции FGF-1.
Научно-практическое значение работы состоит в том, что в ней получены новые данные, демонстрирующие ограниченность пролиферативного эффекта индивидуальных ПФР одним клеточным циклом и проливающие свет на биохимические механизмы, определяющие эту ограниченность. На основе полученных в данной работе результатов можно предположить, что большинство клеток при стимуляции индивидуальными ПФР задерживается во втором клеточном цикле. Дальнейшее исследование механизмов задержки во втором цикле должно способствовать разработке новых подходов к предотвращению гиперплазии и опухолсобразования, а также усовершенствованию методов применения ростовых факторов в клинике.
Белковые регуляторы клеточного цикла
Семейство Rb (retinoblastoma proteins) состоит из трех регуляторных белков: Rb, р107 и р130. Изучение нокаутных мышей показало, что отсутствие Rb приводит к гибели в процессе эмбриогенеза (Clarke et al., 1992; Jacks et al., 1992; Lee et al., 1992) в то время как мыши с нокаутами по р107 (Lee et al., 1996; Hurford et al., 1997) или рІЗО (Cobrinik et al., 1996; Hurford et al., 1997) белкам не обнаруживают заметных аномалии. Rb является ядерным фосфобелком с молекулярной массой 105-110 kDa, который может быть фосфорилирован комплексами Cdk/циклин по ряду сериновых и трсониновых остатков (обзор Тауа, 1997) и действует как супрессор пролиферации, когда находится в гипофосфорилированном состоянии (Nevins et al., 1997). Гипофосфорилировапный Rb связывает транскрипционные факторы семейства E2F, активность которых требуется для начала и продолжения S периода. После связывания с E2F Rb также связывается с корепрессорами, что ведет к подавлению транскрипции с Е2Р-зависимых промоторов. Одним из корепрессороа является гистондеацетилаза (HDAC, histone deacetylase) (Brehm et al., 1998; DePinho, 1998; Luo et al., 1998), которая деацетилирует гистоны в нуклеосомах, что ведет к более компактной упаковке хроматина и к потере способности транскрипционных комплексов связываться с промоторами генов. Rb также связывается с адснозинфосфатазами BRM (Brahma) и BRG1 (Brahma related gene 1) (Dunaief et al„ 1994; Strober et al., 1996), являющимися основными компонентами комплекса организации хроматина SWI/SNF, который отвечает за расположение нуклеосом на промоторах индивидуальных генов (Phelan et al., 1999). Было показано, что в клетках, находящихся в состоянии покоя, образуется комплекс HDAC-Rb-BRGl (Strobeck et al., 2000; Zhang et al,, 2000).
Фосфорилнроваиие Rb комплексом С 1к4/циклин Dl разрушает связь Rb с HDAC, но не влияет на связь Rb с BRGl (Zhang et al., 2000). Дополнительное фосфоршшрование Rb комплексом Сс1к2/циклин Е требуется для разрушения репрессоріюго комплекса Rb-BRGl (Zhang et al., 2000). Таким образом, HDAC-Rb-BRGl подавляет прохождение клетками G1 периода, в то время как Rb- BRGl иигибирует вступление клеток в S период. Для активации транскрипции E2F должны образовать гетеродимерный комплекс с белками DP-1 или DP-2 (La Thangue, 1994). Было показано, что комплексы E2F/DP активируют транскрипцию нескольких генов, продукты которых важны для регуляции вхождения клеток в S-фазу и для репликации ДНК, таких как: Rb, р107, B-myb, PCNA, топоизомераза 1, дигидрофолатредуктаза, с-Мус, ДНК полимераза а, тимидипкииаза, циклии D1, циклин А, циклин Е, p21Cipl, Cdk2, Cdc2, Cdc25C и сами E2F и DP-1 белки (DcGregori ct al., 1995; Shimizu et al., 1995; Geng et al., 1996; Gopalkrishnan et al., 1996; Hiyama ct al., 1997; Sears et al., 1997; Soucek et al., 1997; Leone et al., 1998). Степень фосфорилирования Rb определяет активность E2F. В клетках, находящихся в G0 фазе, Rb гипофосфорилирован и в результате этого активен (Buchkovich et al., 1989; Mihara et al., 1989). С середины и до конца G1 фазы Cdk фосфорилиругаг Rb и он остается в фосфорилировапном неактивном состоянии до конца митоза, когда фосфатазы типа РР1 дефосфорилируют его (Ludlow et al., 1993). рІЗО, другой член семейства Rb, в основном экспрессируется в покоящихся клетках и в отличие от Rb почти полностью отсутствует в пролиферирующих клетках. После стимуляции клеток митогенами р130 фосфорилируется, что ведет к его экспорту из ядра в цитоплазму (Verona et al., 1997), где он претерпевает деградацию с участием протсазосом 26S (Smith et al., 1998). Экспрессия pi07, третьего члена семейства Rb, положительно регулируется E2F, в результате чего р107 отсутствует в покоящихся клетках и начинает экспрессироваться только в G1 и S периоде (Smith et al., 1998). В отличие от Rb, который связывается со всеми известными членами семейства E2F, р107 и рІЗО связываются только с E2F4 и E2F5 (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994; Hijmans et al., 1995; Vairo et al., 1995). Как pl07, так и рІЗО содержат специфическую аминокислотную последовательность для связывания Cdk2/uniaiHH А и С к2/циклин Е, которая отсутствует в Rb (Ewen et al., 1992; Faha ct al., 1992; Lees et al., 1992; Hannon et al., 1993; Li et al, 1993). В результате этого pl07 и рІЗО способны образовывать стабильные комплексы с Cdk2AwioiHH (Ewen et al., 1992) и подавлять активность Cdk2 (De Luca et al., 1997; Woo ct al., 1997; Castano et al., 1998). 1.2.2 Комплексы Cdk/циклин в средней части G1 периода Cdk являются серин/треониновыми киназами, которые могут фосфорилировать ряд субстратов, таких как члены семейства Rb, р53, E2F, B-myb, другие Cdk, фосфатазу Cdc25A, p27bpl, что в свою очередь может активировать или инактивировать эти белки (Dynlacht, 1997). Каталитическая активность Cdk контролируется четырьмя высоко консервативными механизмами, включая 1) активацию посредством связывания регуляторных субъединиц, называемых циклипами, которые синтезируются и деградируют в определенные периоды клеточного цикла (Morgan, 1996); 2) активацию посредством фосфорилирования по треониновому остатку (Morgan et al., 1998); 3) инактивацию посредством фосфорилирования по треониновым и тирозиновым остаткам (Morgan et al., 1998); 4) инактивацию посредством связывания с ингибиторными субъединицами, называемыми ингибиторами циклиновых киназ (CKI, cyclin kinase inhibitor), которые подавляют киназную активность, когда присутствуют в избыточном количестве в комплексах Cdk/циклин (Harper, 1997) Различные комплексы Cdk/циклин фосфорилируют Rb в разные периоды клеточного цикла (Схема 1).
Так циклнны типа D в комплексе с Cdk4 или Cdk6 отвечают за фосфорилирование Rb в середине G1 периода. Известны три циклина тина D (Dl, D2 и D3), которые в комплексе с cdk способны фосфорилировать Rb и инактивировать его (Dowdy et al,, 1993; Ewen et al., 1993). Циклипы D являются короткоживущими белками (время полураспада 30 мин), экспрессия которых вызывается факторами роста (Matsushimc ct al., 1991). Синтез циклинов D начинается при переходе от GO фазы в G1. Внутриклеточная концентрация циклинов D достигает максимального уровеня в поздней G1 фазе (Matsushime et al., 1991; Matsushime et al., 1994). После снятия митогепного стимула циюшны D очень быстро деградируют. Если их деградация происходит в G1 фазе, то клетки не входят в S фазу (Matsushime et al., 1991). Если же это происходит позже, то клеточный цикл продолжается. Cdk 4 активируется фосфорилированием по треониновому остатку (Thr 161), за что отвечает Cdk активирующая киназа (САК, Cdk activating kinase). САК состоит из субъединицы Cdk7 и циклина Н (Makela et al., 1994). С другой стороны, фосфорилирование по Туг 15 ипактивирует Cdk4 (Terada et al., 1995). Киназа, отвечающая за иигибиторное фосфорилирование, неизвестна, однако по аналогии с другими Cdk можно предположить, что она принадлежит к семейству Weel/Mytl (Parker and Piwnica-Worms, 1992; McGowan and Russell, 1993; Mueller et al,, 1995). Помимо этого киназная активность Cdk4 и Cdk6 регулируется негативными регуляторами (СК1). Данные Cdk могут ингибироваться всеми в настоящее время известными CKI, которые подразделяются на два семейства : INK4 и Kip/Cip. 1.2.3 Комплексы Cdk/циклин в позднем G1 периоде В то время как Cdk4 и Cdk6 в комплексе с циклипами D отвечают за прохождение через G1 период, Cdk2 в комплексе с циклином Е (Reed, 1996) и циклином А действуют при переходе от G1 к S периоду (Reed, 1997). Активность Cdk2 быстро возрастает от середины к концу G1 периода и достигает максимального значения па границе G1 и S периодов (Hengstschlager et al., 1999). Cdk2 образуют комплексы с циклипами А и Е, а также с открытыми позже циклинами Al (Yang et al., 1997) и Е2 (Laupcr ct al., 1998). Кроме этого, Cdk2 способна взаимодействовать с p21Cipl и р27ир1 (Braun et al., 1998). Было показано, что конститутивно экспрессирующиеся циклины А и Е могут преодолеть супрессию пролиферации, вызванную Rb (Hinds ct al., 1992). В клетках с искусственно повышенной экспрессией циклина А или Е Rb становится фосфорилированным значительно раньше, чем обычно. Так же как и повышенная экспрессия циклина D, гиперэкспрессия циклина Е ускоряет вхождение клеток в S фазу (Resnitzky et al., 1994). Киназная активность, связанная с циклином Е, достигает максимума на границе G1 и S фаз. Как только клетки входят в S фазу, циклин Е деградирует. Циклин А взаимодействует с Cdk2 и активирует ее как па границе G1 и S фаз, так и в S фазе. Он также активирует Cdc2 в G2 фазе и митозе (Pagano ct al., 1992). Циклин А и связанная с ним киназная активность не обнаруживаются в середине G1 фазы. Циклин А впервые появляется в конце G1 фазы, накапливается в S и G2 фазах и исчезает в митозе. Экспрессия циклина А регулируется на уровне транскрипции (Henglein et al., 1994).
Тромбоцитарный фактор роста
Тромбоцитарный фактор роста (PDGF, platelet-derived growth factor) был впервые выделен в 1974 году из человеческой сыворотки (Scher et al., 1974; Antoniades et al., 1975). Он отвечает за значительную часть митогенной активности сыворотки. PDGF синтезируется в мегакариоцитах, макрофагах, фибробластах, эндотелиальных клетках сосудов и клетках гладкой мускулатуры (Kohler and Lipton, 1974; DiCorleto et al., 1983; Seifert et al., 1984). Высвобождение его из тромбоцитов в сыворотку происходит в основном при реакциях свертывания крови (Witte et al., 1978), что, возможно, является ответом на повреждение тканей. PDGF является важным регулятором эмбрионального развития, клеточной пролиферации, миграции и жизнеспособности клеток (Heldin and Westermark, 1990; Raines et al., 1990). Было показано, что он является мито геном для мезенхимальных клеток, таких как фибробласты и клетки гладкой сосудистой мускулатуры, а также для клеток глии (Kohler and Lipton, 1974; Ross et al., 1974; Westermark and Wasteson, 1976). Его значение для пролиферации была показано открытием v-sis онкогена, чей продукт идентичен PDGF-B цепи (Doolittle et al., 1983; Waterfield et al., 1983). Рецепторы PDGF (PDGFR), которые принадлежат к семейству тирозин-киназных рецепторов, были найдены в разных типах клеток эпдотелиалыюго, эпителиального и нервного происхождения (Mcrcola et al., 1990; Morrison-Graham et al., 1992; Orr-Urtreger and Lonai, 1992; Schatteman et al., 1992). В дополнение к важности PDGF в развитии, он также играет значительную роль в физиологических процессах, таких как заживление ран, и в патологии пролиферативпых расстройств, включая канцерогенез, атеросклероз, фиброз и воспалительные процессы (Heldin and Westermark, 1996; Campochiaro, 1997). 2.2.1 Структура и регуляция биосинтеза PDGF Гены, кодирующие PDGF, были изолированы из разных видов животных, включая млекопитающих, птиц, рыб, амфибий и насекомых (Betsholtz et al., 1986; Mercola et al., 1988; Mercola et al., 1990; Herren and Pech, 1993; Horiuchi et al., 2002). PDGF является гомо- или гетеро-димериым 30 kDa белком, состоящим из двух гомологичных цепей А и В, связанных между собой дисульфидными связями (Haniu et al,, 1993; Наши et al., 1994).
Все возможные изоформы (АА, АВ, ВВ) существуют в природе и биологически активны (Hammacher et al., 1988; Hammacher et al., 1988). Как А, так и В цепь процессируются во время синтеза (Betsholtz, 1993). Зрелая форма В-цепи содержит гидрофобный участок, который задерживает фактор роста на поверхности клетки-продуцента (LaRochelle et al., 1991; Kelly et al., 1993). А-цепь PDGF существует в двух формах, длинной и короткой, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга 6-го экзона. Длинная форма, содержащая последовательность, кодируемую 6-м экзоном, остается ассоциированной с клеточной поверхностью, в то время как короткая форма свободно диффундирует (Kelly et al., 1993). Последовательность, кодируемая 6-м экзоном PDGF-A и PDGF-B, позволяет им взаимодействовать с компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллагены (Somasundaram and Schuppan, 1996), тромбоспондин (Hogg et al., 1997), остеопонтин (Raines et al., 1992) и гепарансульфаты (Lustig et al., 1996). PDGF экспрессируется во многих клеточных линиях, включая фибробласты (Paulsson et al., 1987), миобласты (Sejerscn et al., 1986), клетки гладкой мускулатуры (Nilsson et al., 1985) (Sejerscn et al., 1986), эндотелия (DiCorleto et al., 1983) и эпителия (Campochiaro et al., 1989), нейроны (Sasahara et al., 1991; Yeh et al., 1991), макрофаги (Shimokaclo et al., 1985) и тромбоциты (Kaplan et al., 1979). Синтез PDGF в клетках может вызываться гипоксией (Kourembanas et al., 1997), обработкой клеток тромбином (Daniel et al., 1986; Harlan et al., 1986) и стимуляцией факторами роста и цитокипами, такими как FGF-2, EGF, TNFcc (tumor necrosis factor alpha), TGFoc, интерлейкин l[i (ILip, interleukin 1(3) и шітерлейкин 6 (IL6) (Raines et al, 1989; Silver et al., 1989; Roth et al., 1995). Недавно были найдены и охарактеризованы два новых члена семейства PDGF, PDGF-С и PDGF-D (Li et al., 2000; Bergsten et al., 2001; LaRochelle et al., 2001). У PDGF-C и PDGF-D имеется домен CUB на N-конце. Было показано, что PDGF-C и PDGF-D секретируются в неактивной форме, и отщепление CUB домена необходимо для связывания и активации рецептора (Li et al., 2000; Bergsten et al., 2001; LaRochelle et al., 2001). 2.2.2 Семейство рецепторов PDGF Передача сигнала от PDGF осуществляется посредством двух высокоаффинных рецепторов: PDGFR аир, которые являются трансмембранными белками с тирозин-киназной активностью. PDGFRp мыши синтезируется как 160 kDa бслок-предшествеиник, который в процессе созревания превращается в 180 kDa гликопротеин (Keating and Williams, 1987). PDGFRa имеет до 40% гомологии с р формой рецептора и синтезируется как 140 Ша предшественник, превращающийся в 170 kDa зрелую форму (Claesson-Welsh et al., 1989). Оба рецептора состоят из внеклеточного домена, отвечающего за связывание с лигандом, трансмембранного домена, примембранного участка, двух киназных доменов и С-конца (Yarden et al, 1986; Claesson-Welsh et al., 1989; Matsui et al., 1989). Внеклеточная часть PDGFR состоит из пяти Ig-подобных доменов (Claesson-Welsh et al., 1989). Связывание с лигандом приводит к димеризации PDGFR, каждая субъединица которого взаимодействует только с одной цепью димерпого лиганда (Bishayee et al., 1989; Heldin et al, 1989). Изоформа PDGF определяет состав дим ера рецепторов (Seifert et al., 1989).
В то время как а субъединица может взаимодействовать с А и В цепями PDGF, р субъединица взаимодействует с высокой аффинностью только с В цепью. Таким образом, PDGF-AA собирает только aa гомодимер, PDGF-AB может собрать act или ар димеры, a PDGF-BB вызывает образование всех возможных димеров рецептора (Claesson-Welsh, 1994; Kazlauskas, 1994). В последнее время накапливаются данные, указывающие на разные биологические функции двух субъединиц PDGFR (Soriano, 1994; Soriano, 1997). PDGF-C преимущественно связывается с PDGFRa, в то время как PDGF-D имеет большую аффинность к PDGFRp рецептору (Li et al., 2000; Bergsten el al., 2001; LaRochelle et al., 2001). 2.3. Сыворотка крови Исторически сложилось так, что наибольшее распространение среди биологических добавок, используемых для культивирования клеток, получила сыворотка крови, которая обеспечивает рост практически всех типов клеток. Сыворотка является сложной смесью множества биологических молекул с разными физиологическими активностями. К основным компонентам сыворотки, необходимым для выживания и роста клеток млекопитающих в культуре относятся: белки плазмы (альбумины, фибронектип, а.2-макроглобулин, фетуин, трансферрин); полипептидиые факторы роста и гормоны (инсулин, IGF I и П, PDGF, EGF); непептидные гормоны (эстрогены, кортизол, андрогены, тироидные гормоны (ТЗ, Т4)); липиды (линолевая кислота, холестерин, лизофосфатидная кислота, простагландины); метаболиты (аминокислоты, а-кетокислоты (пируват), полиамины); минеральные вещества и микроэлементы (Fe2+, Zn +, Си +, Мп +, Se032 , Со2\ VOj", М07О246") (Maurer, 1986). ПФР присутствуют в сыворотке в очень малых концентрациях (порядка 10"10 М). В некоторых случаях присутствие факторов роста необходимо не для самой пролиферации, а для выживания клеток, так как их отсутствие инициирует апоптоз (Shah, 1999). PDGF отвечает за значительную часть митогенной активности сыворотки (Stiles et al., 1979). Плазма крови, из которой удалены тромбоциты, обладает очень низкой митогенной активностью по причине отсутствия PDGF, который высвобождается из тромбоцитов в процессе сворачивания крови (Ross et al., 1978; Vogcl ct al., 1978). Другие факторы роста, такие как EGF, TGFcc и IGF, также присутствуют в сыворотке (Green et al., 1979; Kurtz et al., 1985). EGF является митогеном для эпителиальных и эпдотелиальпых клеток (Gospodarowicz et al., 1977; Taketani and Oka, 1983). Мутации рецептора EGF очень часто обнаруживаются при раке молочной железы {Lorimer, 2002). IGF I и II преимущественно экспрессируются в печени, откуда попадают в кровоток, но могут секретироваться и клетками других тканей.
Определение киназиой активности комплекса Сбк2/циклші Е
После разделения на SDS-полиакриламидпом геле белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond С 0,45 мкм (Amersham, США). Мембрану блокировали в TBS буфере (25 мМ Tris- НС1 (рН 7,4), 150 мМ Nad, 2.7 мМ КС1), содержащем 0,1% Tween 20 и 5% обезжиренного сухого молока или 5% бычьего сывороточного альбумина, в течение 1 ч при 42С, после чего инкубировали с первыми антителами в течение 2-3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4С. В работе использовали анти-фосфотирозшювые мышиные антитела (Upstate Biotechnology, США), кроличьи антитела против циклииа A (Santa Cruz Biotechnology, США), кроличьи антитела против циклииа Е (Upstate Biotechnology, США), мышиные антитела против циклииа Dl (Sigma, США), кроличьи антитела против активированных МАРК (Promcga, США), кроличьи антитела против Erk-1/2 (Santa Cruz Biotechnology, США), кроличьи антитела против cdk2 (Santa Cruz Bioteclinology, США), кроличьи антитела против cdk4 (Santa Cruz Biotechnology, США), кроличьи антитела против p21/CIPl (Pharmingen, США), мышиные антитела против p27/KIPl (Transduction Laboratories, США). После трехкратной промывки в TBS, содержащем 0,1% Tween 20, мембрану инкубировали 1 ч с козьими антителами к мышиным или кроличьим IgG, коныогироваными с пероксидазой хрена (BioRad, США) и промывали три раза с TBS, содержащим 0,1% Tween 20.
Белки выявляли с помощью набора ECL (Amersham, США) согласно инструкции производителя с последующей детекцией хемилюмисценции на рентгеновской пленке (Kodak). Определение киназпой активности комплекса С 1к2/циклин Е Для определения киназиой активности комплекса С(ік2/циклин Е сначала проводили иммунопреципитацию, используя антитела кролика против циклина Е (Santa Cruz, США) как описано выше. После трехкратной промывки осажденного на белок А-сефарозном геле комплекса буфером Е и последующей двухкратной промывки киназпым буфером F (50 mM Tris-HCl (рН 7.5), 10 тМ MgCb, 1 тМ дитиотриэтола (ДТТ)), проводили киназную реакцию. Для этого к комплексу добавляли 50 мкл буфера F, содержащего 5 мкг гистона HI и 10 мкКи у-32Р-АТФ, и инкубировали 30 мип при комнатной температуре. Реакцию останавливали 75 мкл 2х буфера для нанесения с последующим кипячением в течение 10 мип. Образцы наносили на 10% SDS-полиакриламидный гель. По окончании электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Киназную активность определяли по фосфорилированию гистона III после экспозиции мембраны с накопительным экраном и обработки результатов на фосфоимеджере Typhoon 8600. Количество осажденного Cdk2 определяли с помощью иммуноблоттинга и пересчитывали киназную активность комплекса на количество осажденного Cdk2, используя компьютерную программу ImageQuant Version 5.1. Иммуноистищсние р21 и р27 Для иммуноистощения р21 получали клеточные лизаты вышеописанным образом, после чего проводили иммунопреципитацию либо антителами кролика против р21 (Pharmingen), либо, в контрольном варианте, нормальными IgG кролика (Sigma) с последующим добавлением белок А-сефарозы. После осаждения образовавшегося иммунного комплекса, супернатанты смешивали с равным объемом 2х буфера для нанесения и наносили на 10% SDS-полиакриламидпый гель. Иммупоблоттинг проводили вышеописанным образом. Аналогично проводили иммуноистощепие р27, используя либо моноклональиые антитела против р27 (Transduction Laboratories), либо нормальные IgG мыши (Sigma).
Выделение РНК и Норзерн блот Swiss ЗТЗ, находящиеся в монослое, переводили в покой на 48 часов, после чего стимулировали сывороткой (10%) или ПФР. По окончании стимуляции клетки промывали один раз PBS и лизировали в 3 мл TriReagent (Sigma). Дальнейшее выделение ДНК проводили в соответствии с инструкцией к TriReagent. Вкратце, проводили экстракцию лизатов хлороформом, после чего РНК осаждали изопропанолом из водной фазы. После центрифугирования полученный осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в воде. Концентрацию РНК определяли і - ЛГ.ОТЕКА спектрофотометрически. РНК разделяли с помощью электрофореза в 0,8% агарозпом геле, содержащем 2,2 М формальдегида, после чего переносили на нейлоновый фильтр (Nytran, Schleicher & Schuell) капиллярным методом, блокировали в буфере для гибридизации (0,5 М фосфата натрия (рН 7,2), 1% бычьего сывороточного альбумина, 7% SDS, 20% формамида, 10 мкг/мл ДНК из спермы лосося) 1 ч при 65 С, после чего в її буфер для гибридизации вносили пробу ДНК, меченную , и продолжали инкубацию в течение 18 ч при 65 С. Фильтр промывали 2 раза в буфере G (0,5% BSA, 1мМ ЭДТА, 40 мМ NaHP04 (рН 7,0), 5% SDS) и 2 раза в буфере Н (1мМ ЭДТА, 40 мМ NaHP04 (рН 7,0), 5% SDS), после чего проводили экспозицию мембраны с рентгеновской пленкой. Проба иа ODC являлась 0,72 kb фрагментом мышиной к-ДНК (АТСС), вырезанным Pst I, проба иа с-тус - 1,4 kb фрагментом к-ДНК человека (АТСС), вырезанным EcoR I, проба на с-fos - фрагментом к-ДНК (АТСС), вырезанным EcoR I и Sal I, проба на c-jun - 0,65 kb фрагментом мышиной к-ДНК (подарок Dr. Kenneth Soprano, Temple University), вырезанным Ava I, и проба к GAPDH - 0,8 kb фрагмент к-ДНК (АТСС). Инфекция клеток Swiss ЗТЗ аденовирусом, кодирующим циклин А или GFP. После достижения клетками монослоя, их переводили в покой как описано выше. По окончании покоя клетки инфицировали аденовирусами, кодирующими человеческий циклии A (AdcycA) или GFP (AdGFP) (оба вируса получены нз лаборатории С. Vaziri, Boston University). Для этого брали аденовирус из расчета 104 вирусных частиц на клетку и инкубировали с поли лизином (ПЛ) в количестве 2500 молекул ПЛ на одну вирусную частицу в 500 мкл DMEM в течение 15 минут для образования комплекса. После этого образовавшийся комплекс ресуспендировали в необходимом количестве среды DMEM и на 2 ч наносили на клетки, предварительно культивированные в DMEM с 0,25% сыворотки в течение 48 ч.
По окончании инфекции среду заменяли на свежую и клетки стимулировали мнтогенами для получения белковых лизатов или радноавтографических препаратов, как это описано выше. Получение клонов, экспрессирующих антисмысловую РНК р21 Плазмида pCEP4asp21, кодирующая антисмысловую последовательность мРНК р21 человека, была получена от В. Vogelstein (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore). Клетки трансфицировали плазмидой pCEP4asp21 или контрольной плазмидой рСЕР4 с помощью катионного агента Fugene 6 (Roche), после чего проводили селекцию на среде с 200 мкг/мл гигромицина В (Roche) и отбирали устойчивые колонии. Полученные клоны использовали для получения белковых лизатов и в радиоавтографических опытах по определению способности клеток входить во второй S период. Иммунофлуоресцентпая конфокальная микроскопия Для экспериментов по иммунофлуоресценции клетки Swiss ЗТЗ высаживали на покровные стекла. Клетки фиксировали раствором 4% формальдегида в PBS через различные временные интервалы после стимуляции покоящихся клеток сывороткой, FGF-1 или PDGF-AB. Препараты блокировали 1 ч в буфере Е (5% BSA, 0.1% Triton XI00, 0.1% Tween 20 в PBS), инкубировали в течение 1 ч с первыми антителами, разведенными в буфере Е, промывали PBS, инкубировали в буфере Е, содержащем вторые антитела, коныогированные с флуоресцеином (Sigma), и специфический для ДНК краситель TO-PR03 {Molecular Probes) в течение 30 мин и, промыв PBS, заключали в 50% раствор глицерина. В работе использовали антитела кролика против р21 (Pharmingen) и моноклональные антитела против р27 (Transduction Laboratories). Анализ флуоресцентных препаратов проводили с помощью конфокального микроскопа TCS-SP (Leica). Проточная цитомстрин Для определения распределения клеток по клеточному циклу, клетки Swiss ЗТЗ, находящиеся в монослое, переводили в покой на 48 часов, после чего их стимулировали FGF-1 или PDGF-AB. За 6 ч до окончания стимуляции в культуральную среду добавляли нокодазол (0,4 мкг/мл, Sigma), после чего клетки снимали с подложки раствором трипсина-ЭДТА, центрифугировали, промывали PBS и фиксировали этанолом. После дополнительной промывки с помощью PBS клетки инкубировали в PBS, содержащем 50 мкМ йодистого пропидия и 5 мкг/мл РНКазы А в течение 30 мин при 37 С. Содержание ДНК определяли с помощью проточной цитометрии на FACS Vantage SE.
Сравнение экспрессии генов раннего и задержанного ответа
Известно, что сигнал от тирозинкиназных рецепторов передается посредством каскада Ras-Raf-Mek, что приводит к активации МАРК, необходимых для митогепного клеточного отпета. Для активации МАРК необходимо их фосфорилирование по определенным сершговым и трео ни новым аминокислотным остаткам. Чтобы оцепить активацию МАРК после стимуляции покоящихся клеток FGF-1, PDGF-AB или сывороткой, проводили иммуноблоттинг, используя антитела, распознающие только фосфорилированные формы МАРК, а также антитела, распознающие как активную, так и неактивную форму МАРК. Результаты эксперимента показали, что МАРК оставались фосфорилированными и таким образом активными, как в первом, так и во втором цикле во всех вариантах стимуляции (рис. 9). При этом следует заметить, что фосфорилирование МАРК при действии FGF-1 было значительно выше, чем после стимуляции PDGF-AB или сывороткой. Таким образом, сигнальные пути от FGFR и PDGFR остаются активными как в первом, так и во втором цикле после стимуляции клеток FGF-1 или PDGF-AB. 5.3. Сравнение экспрессии генов раннего и задержанного ответа Экспрессия генов раннего ответа после стимуляции покоящихся клеток необходима для прохождения ими G1 фазы. К генам раннего ответа относятся прежде всего с-тус, с-jun и c-fos. Белки c-Jun и c-Fos образуют димерный транскрипционный фактор АР-1, последовательность связывания для которого находится в промоторах многих генов, экспрессируемых в G1 периоде (Shaulian and Karin, 2002).
Другой транскрипционный фактор, с-Мус, участвует в регуляции многих физиологических процессов, включая пролиферацию, выживание и апоптоз. Мус активирует транскрипцию генов, кодирующих циклины Е и А, а также ODC (Jansen-Durr et al., 1993; Wagner et al., 1993; Daksis et al., 1994; Hanson et al., 1994), и в тоже время подавляет транскрипцию гена gasl, который может блокировать пролиферацию клеток, (Lee et al., 1997). Уровень циклина Е увеличивался в ответ на стимуляцию FGF-1, PDGF-AB или сывороткой, достигал максимума через 24 ч после начала стимуляции и затем слегка снижался во всех вариантах стимуляции (рис. 11), Индукция циклина А наблюдалась через 24 ч после начала стимуляции во всех трех вариантах. Интересно, что во втором цикле происходило резкое снижение уровня циклина А в случае стимуляции FGF-1 и PDGF-AB, но не сывороткой. Это , возможно, связано с тем, что клетки после стимуляции FGF-1 и PDGF-AB неспособны войти в S фазу во втором клеточном цикле. В случае стимуляции FGF-1 уже через 24 ч наблюдалась низкомолекулярная форма циклина А, которая может являться продуктом протеолитического расщепления (Bastians ct al., 1998). Смена PDGF-AB на сыворотку во втором цикле возвращала экспрессию циклина А. В случае смены FGF-1 на сыворотку через 6 ч после замены одного митогенного стимула на другой обнаруживались обе формы циклина А, но через 18 ч после замены наблюдалась лишь низкомолекулярная форма циклина А. Так как после замены FGF-1 на сыворотку не менее 50% клеток способно войти во второй клеточный цикл, можно предположить, что низкомолекулярная форма циклина А является функционально активной. Также был проверен уровень циклинзависимых киназ Cdk4 и Cdk2, которые находятся в комплексе с циклинами, регулирующими их активность. Из рисунка 12 видно, что уровень Cdk4 и Cdk2 был высок в покое и мало изменялся при всех видах митогенной стимуляции, оставаясь постоянным на протяжении обоих клеточных циклов. 5.5. Экспрессия ингибиторов Cdk Активность комплексов Cdk/циклин регулируется CKI, обеспечивающими остановку клеточного цикла в ответ на различные внеклеточные и внутриклеточные сигналы. р21 и р27 принадлежат к C1P/KIP семейству CKI и способны ипгибировать все известные комплексы Cdk2. Уровень р21 и р27 после стимуляции клеток Swiss ЗТЗ FGF-1, PDGF-AB и сывороткой был определен посредством иммуноблоттинга с использованием специфических антител, распознающих р21 или р27. Из рисунка 13 видно, что уровень р27 повышен в покое и несколько снижается после стимуляции сывороткой, В случае стимуляции клеток FGF-1 уровень р27 практически не изменялся как в первом, так и во втором циклах. В то же время уровень р27 повышался до уровня покоя в клетках, стимулированных PDGF-AB в течение 24 ч и 42 ч. Уровень р21 был низок в покоящихся клетках и возрастал после стимуляции всемя тремя митогепами. Экспрессия р21 была особенно высока после стимуляции клеток FGF-1 как в первом, так и во втором цикле (рис. 13). Смена FGF-1 на сыворотку во втором цикле приводила к снижению содержания р21, в то время как замена сыворотки на FGF-1 вызывала повышение его уровня. Таким образом, остановка клеток во втором клеточном цикле коррелирует с повышением уровня р27 в клетках, стимулированных PDGF-AB, и с повышением уровня р21 в клетках, стимулированных FGF-1.
Как было показано выше, клетки, блокированные во втором клеточном цикле после стимуляции индивидуальными факторами роста, по ряду биохимических параметров отличаются от клеток, находящихся в покое. В частности, в клетках, стимулированных FGF-1 или PDGF-AB, в отличие от покоящихся клеток, наблюдалась экспрессия циклинов D1 и Е, а также активация МАРК. Состояние клеточного старения по ряду аспектов схоже с состоянием пролиферативного покоя. В частности, стареющие клетки теряют способность к пролиферации, но сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность (Kaftory et al., 1978; Matsumura et al., 1979). Интересно, что в стареющих клетках наблюдается активация Ras-Raf-MEK-MAPK пути, несмотря на отсутствие синтеза ДНК после стимуляции (Garfinkel et al., 1996). Чтобы сравнить биохимические параметры стареющих клеток и клеток, стимулированных индивидуальными факторами роста, был определен уровень циклинов в молодых и стареющих клетках в трех независимо полученных культурах эндотелиальных клеток человека, HUVEC (human umbilical vascular endothelial cells). Интересно, что для постоянного культивирования HUVEC наряду с сывороткой требуется и присутствие FGF-1 в культуральной среде. В то время как уровень циклинов D1 и Е оставался практически неизменным при старении HUVEC, циклин А не обнаруживался во всех трех линиях HUVEC на поздних пассажах (рис. 14). Таким образом, по уровню циклинов клетки, стимулированные в течение длительного времени FGF-1 или PDGF-AB, напоминают стареющие клетки. 6. Сравнение пролиферативного ответа на факторы роста в стареющих культурах фибробластов мышей SAMP-1 и SAMR-1 Ускоренно стареющие японские мыши (SAM) представляют собой группу линий мышей, обладающих низкой продолжительностью жизни, и являются удобной моделью изучения процессов старения (Takeda et al., 1997). Фибробласты самой короткоживущей линии (SAMP1) обладают значительно сниженным пролиферативным потенциалом (в среднем 8,7 удвоения популяции (УП)), в то время как фибробласты, относительно долгоживущей линии SAMR1 имеют средний пролиферативный потенциал 12,3 УП. В данной работе была исследована способность фибробластов мышей SAMP-1 и SAMR-1 отвечать на различные факторы роста по мере старения в культуре. Для этого клетки переводили в состояние покоя и стимулировали их добавлением FGF-1, PDGF-BB, либо 10% сыворотки в течение 24 ч. За 1 ч до фиксации в среду вносили Н -dTd в концентрации 5 мкКи/мл. На ранних пассажах клетки SAMP-1 и SAMR.-1 дают одинаковый пролиферативный ответ па факторы роста, но к пятому удвоению популяции ответ SAMP-1 на стимуляцию FGF-1, PDGF-BB и сыворотку значительно снижен по сравнению с SAMR-1 (рис. 15). На поздних пассажах как SAMP-1, так и SAMR-1 не отвечают на факторы роста и слабо отвечают на продолжительную стимуляцию сывороткой. Таким образом, в отличие от клеток Swiss ЗТЗ и подобно другим типам стареющих клеток (HUVEC, диплоидные фибробласты человека), эмбриональные фибробласты мыши теряют способность вступать в клеточный цикл в ответ на стимуляцию сывороткой. Необратимость блокировки пролиферации клеток при старении делает аналогию между стареющими клетками и клетками, стимулированными индивидуальными ростовыми факторами, весьма ограниченной.
