Введение к работе
Актуальность проблемы. Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) медузы Aequorea victoria в 1992 году открыло широкие возможности для прижизненной визуализации объектов и положило начало ряду исследований, связанных с GFP и другими GFP-подобными флуоресцентными белками (ФБ), обнаруженными позднее Сегодня одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений в области применения GFP-подобных белков - это создание генетически кодируемых сенсоров (ГКС) Такие сенсоры позволяют визуализировать активность интересующих исследователя белков, а также изменения концентраций определенных молекул
По сравнению с химически синтезируемыми флуоресцентными красителями, ГКС имеют ряд преимуществ Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции, использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить ГКС в различные органеллы живой клетки, также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие ГКС в определенных тканях в определенный период времени Так как белки живой клетки принимают участие в абсолютном большинстве происходящих в ней событий, с использованием соответствующих белковых доменов потенциально может быть разработан ГКС практически для любой сигнальной молекулы или ферментативной активности
Достаточно широкое распространение получило создание ГКС на основе принципа FRET (Forster Resonance Energy Transfer) - безызлучательного переноса энергии возбужденного состояния флуорофора одного флуоресцентного белка (донорного) на другой (акцепторный) Альтернативный подход основан на использовании пермутированных вариантов ФБ - cpFP (circularly permuted Fluorescent Protein), т e таких вариантов, в которых нативные N- и С- концы белка соединены с помощью пептидного линкера, а новые концы образованы в другой части белка, чаще всего вблизи хромофора
Однако, несмотря на значительный потенциал ГКС в качестве инструментов для изучения различных процессов в живых клетках и тканях, разработанные ранее ГКС обладают рядом недостатков, затрудняющих их практическое применение Одной из основных проблем является низкий контраст флуоресцентного ответа ГКС на детектируемый аналит Для FRET-индикаторов контраст (выраженный в долях или %) отражает изменение отношения флуоресценции акцептора к донору после «срабатывания» сенсора Аналогичным образом проводят оценку контраста так называемых «ратиометрических» индикаторов, характеризующихся аналит-зависимым «перетеканием» пиков возбуждения флуоресценции Применительно к cpFP-содержащим сенсорам с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст соответствует степени изменения
интенсивности флуоресцентного сигнала после взаимодействия с аналитом Помимо недостаточного контраста, подавляющее большинство cpFP-ГКС обладает также недостаточной яркостью флуоресценции Никий контраст и яркость делают большинство описанных ранее сенсоров малопригодными для высокопроизводительных скринингов лекарственных препаратов и ограничивают их чувствительность во внутриклеточных экспериментах Таким образом, создание ГКС с высокой яркостью флуоресценции и высоким контрастом, как на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков, так и на основе FRET, является сегодня актуальной задачей
Цель работы Цель данной работы - разработка высококонтрастных генетически кодируемых сенсоров на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP
Структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка литературы Работа изложена на ^страницах и содержит wC иллюстрации, J таблиц и ДТссылок на литературные источники
