Выделение и характеристика кор-частиц хроматина из плесневого гриба NEUROSPORA CRASSA Ананьева Наталия Михайловна

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Ананьева Наталия Михайловна. Выделение и характеристика кор-частиц хроматина из плесневого гриба NEUROSPORA CRASSA : ил РГБ ОД 61:85-3/1607

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Структура нуклеосом и подходы к её изучению 9

1.1.1. Топография гистонов и ДНК в составе корчастиц . 9

1.1.2. Структурные различия и роль в поддержании структуры ДНП 19

1.1.2.1. Общие закономерности строения гистонов - наличие двух структурно различных частей молекул 19

1.1.2.2. Функциональная роль w - и С-кон-цевых доменов молекул гистонов в составе ДШ 22

1.2. Хроматин низших эукариотических организмов. 31

1.2.1. Гистоны низших эукариотических организмов 32

1.2.2. Нуклеосомная организация хроматина низших эукариотов 47

1.2.2.1. Вариабельность длины нуклеосом-ного повтора ДНК 48

1.2.2.2. Некоторые особенности структуры хроматина дрожжей 54

1.3. Краткие выводы и постановка экспериментальных задач 64

2. Материалы и методы исследования 66

2.1. Объект исследования 68

2.2. Выращивание Neurospora crassa 68

2.3. Препаративные методы 69

2.3.1. Выделение кор-частиц хроматина из Neurospora crassa 69

2.3.1.1. Получение препарата ядер 69

2.3.1.2. Контроль чистоты и целостности препарата ядер 70

2.3.1.3. Получение препарата хроматина 71

2.3.1.4. Выделение кор-частиц хроматина 71

2.3.2. Выделение кор-частиц из эритроцитов курицы 72

2.3.2.1. Получение препарата ядер из эритроцитов курицы 72

2.3.2.2. Получение препарата хроматина, лишенного гистонов НІ и Н5 73

2.3.2.3. Выделение кор-частщ 74

2.3.3. Обработка кор-частщ трипсином 75

2.3.4. Обработка кор-частщ дезоксирибонуклеазой 75

2.3.5. Получение меченных 32Р кор-частщ 76

2.3.6. Препаративный электрофорез ДНІ 76

2.3.7. Выделение суммарного препарата гистонов из Neurospora crassa

2.3.8. Фракционирование суммарных препаратов гистонов 78

2.3.9. Очистка гистонов В2В 79

2.4. Электрофоретические методы исследования 79

2.4.1. Приготовление образцов ДНК для электрофореза 79

2.4.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 80

2.4.3. Определение длины нуклеосомного повтора методом электрофореза ДНК в агарозном геле 81

2.4.4. Электрофорез ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях. 81

2.4.5. Высокоразрешащий электрофорез ДЕК в ПАЯ1 82

2.4.5.1. Проведение электрофореза 82

2.4.5.2. Авторадиографирование геля 84

2.4.6. Приготовление образцов белка для электрофореза 84

2.4.7.Диск-электрофорез гистонов в присутствии додецилсульфата натрия 85

2.4.8.Электрофорез гистонов в блоке ПААГ в присутствш мочевины 87

2.4.9.Двумерный электрофорез гистонов'в ПАЯ1 88

2.5. Аналитические методы исследования 89

2.5.1.Определение количественного с одержання ДНК в материале 89

2.5.2.Количественное определение содержания белка. 89

2.5.3.Седашентационный анализ 90

2.5.4.Определение аминокислотного состава белков и пептидов 90

2.5.5.Определение и -концевых аминокислот белков и пептидов 91

2.5.5.1. Дансилирование белков и пептидов 91

2.5.5.2. Тонкослойная хроматография дансильных производных аминокислот. 95

2.5.6. Определение С-концевых аминокислот белка 93

2.5.7.Гидролиз гистона Б2В трипсином 93

2.5.8.Метод пептидных карт в тонком слое целлюлозы 94

2.5.9.Эволюция пептидов с целлюлозы 95

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Выделение кор-частиц хроматина из плесневого гриба Neurospora crassa 96

3.1.1. Выделение препарата хроматина из Neurospora qfi crassa

3.1.2. Электросборетические исследования белков тпт хроматина из N;!crassa

3.1.3. Нуклеосомная организация хроматина N.'crassa 104

3.1.4. Получение препарата кор-частиц гриба 107

3.2. Характеристика выделенного препарата кор-частиц из Neurospora crassa 108

3.2.1. Электрофоретическое исследование белков препарата кор-частиц 111

3.2.2. Определение коэффициента седиментации препарата кор-частиц хроматина из Neurospora crassa 113

3.2.3. Чувствительность выделенного препарата корчастиц к действию ДНКазы I 115

3.3. Исследование процесса ограниченного протеолиза кор-частиц из Neurospora crassa 117

3.3.1. Электрофретическое исследование гистонов протеолизованных кор-частиц 118

3.3.2. Исследование влияния ионной силы раствора на скорость седиментации интактных и про те олизованных кор-частиц. 126

3.4. Исследование особенностей первичной структуры В2В Neurospora crassa 129

3.4.1. Выделение суммарного препарата гистонов Neurospora crassa 129

3.4.2. Фракционирование суммарного препарата гис-тонов 131

З'.4.3. Аминокислотный, N- и С-конце вой анализ препарата гис тона Н2В N. crassa 134

3.4.4. Сравнительное изучение структуры гистонов В2В N.crassa и тимуса теленка методом пептидных карт 137

3.4.4.1. Двумерное разделение продуктов триптического гидролиза гистонов Б2В в тонком слое целлюлозы 137

3.4.4.2. Изучение аминокислотного состава и N -концевых аминокислот триптических пептидов Б2В из N.!crassa и тимуса теленка 145

3.5. Изучение продуктов гидролиза нуклеосомной ДНК дезоксирибонуклеазой 1-е помощью высокоразрешающего электрофореза 151

3.6. Краткое обсуждение полученных результатов 155

Выводы 163

Хроматин низших эукариотических организмов.
Препаративные методы
Аналитические методы исследования
Исследование процесса ограниченного протеолиза кор-частиц из Neurospora crassa

Введение к работе

Открытие нуклеосомной организации хроматина эукариотов, обусловленной взаимодействием гистонов и ДНК, явилось крупным достижением в изучении структуры и функционирования клеточного ядра /112/. Минимальной единицей структуры хроматина является так называемая кор-частица - продукт его обработки микрококковой нуклеазой, которая содержит фрагмент ДНК длиной 145 п.о. и октамер кор-гистонов: Н4, НЗ, Н2А и Н2В /139/.

В последнее время субъединичная структура хроматина была установлена и для низших эукариотов /21,46,103,119,131,145,154, 168,184,193,217,240/, что послужило серьезным доказательством универсальности нуклеосомной структуры хроматина среди эукарио-тических организмов. Ряд особенностей низших эукариотов, в частности, грибов, таких как высокая транскрипционная активность генома и относительная простота его организации, а также доступность техники генетического и биохишгческого анализа делают их интересными объектами в плане исследования структуры хроматина и его активации /123,124,214/.

Имеющиеся в литературе сведения о строении хроматина грибов требуют в настоящее время более детального изучения физико-химических свойств ДНП этих организмов, начиная с изучения строения кор-частиц хроматина, которое отвечает так называемому первому уровню структурной организации хромосом /96/. Однако данные исследования сопряжены со значительными трудностями выделения хроматина из низших эукариотов. Они связаны с малыми размерами генома и, следовательно, низким содержанием ДНК, и высокой активностью клеточных протеаз, вызывающих деградацию гистонов.

К началу настоящей работы в литературе практически отсутствовали данные по характеристике нуклеосом хроматина грибов. До сих пор нуклеосомы были выделены из единственного объекта среди этой группы организмов - пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae /115/.

В связи с этим настоящая работа предпринята с целью сравнить структуру кор-частиц хроматина из другого представителя грибов - плесневого гриба Neurospora crassa - и стандартного препарата кор-частиц из эритроцитов цыпленка.

В результате проведенного исследования было установлено принципиальное сходство кор-частиц из Ni crassa и эритроцитов цыпленка. Этот вывод расширяет представления об универсальности нуклеосомной структуры хроматина среди эукариотических организмов. Наблюдаемые различия кор-частиц из сравниваемых объектов выражены, во-первых, в том, что общая скорость нуклеазной реакции при переваривании ДЖазой I примерно в 3 раза больше для кор-частиц гриба. Во-вторых, по сравнению с нуклеосомами эритроцитов цыпленка, кор-частицы гриба при обработке их трипсином теряют способность поддерживать компактную структуру на более ранней стадии протеолиза, связанной с расщеплением гистона Б2В. Выявленные различия могут быть объяснены локальными изменениями во взаимодействии ДНК и белков в хроматине изучаемого организма.

Настоящая работа является частью исследований структуры и функций хроматина у высших и низших эукариотических организмов, проводимых на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета МГУ под руководством кандидата биологических наук доцента И.А .Крашенинникова и кандидата биологических наук старшего преподавателя Т.М.Ермохиной.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

- 9 -І.І. СТРУКТУРА НУКЛЕОССМ И ПОДХОДЫ К ЕЁ ИЗУЧЕНИЮ І.І.І. Топография гистонов и ДНК в составе кор-частиц

Различные подходы при изучении структуры хроматина позволили почти одновременно в ряде лабораторий высказать гипотезу о том, что хромосомная фибрилла представляет собой цепь регулярно повторяющихся субъединщ - нуклеосом, каждая из которых содержит около 200 пар оснований ДНК и определенный набор гистонов: по 2 молекулы гистонов Н4, БЗ, Н2А и Б2В и одну молекулу гистона НІ /92,111,151,159,216/. В дальнейшем эта гипотеза получила многочисленные экспериментальные доказательства и была развита в фундаментальную теорию молекулярной биологии. В настоящее время установлено, что нуклеосомная организация хроматина является всеобщим свойством эукариотической клетки и обнаружена у млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, высших растений и низших эукариотов /1,96,111,139,144/.

Наиболее веским доказательством нуклеосомной организации хроматина эукариотических организмов явились результаты работ по его перевариванию микрококковой нуклеазой. Этот фермент преимущественно делает разрывы по обеим цепям ДНК в участках, не защищенных от действия фермента пістонами /111,151,155,196, 171/. В ходе гидролиза образуется специфический набор фрагментов ДНК, длина которых кратна, так называемому, нуклеосомному повтору ДНК. Следует подчеркнуть, что накапливающиеся в ходе гидролиза мононуклеосомы неоднородны по размеру фрагментов ~~фрагментов~~ ДНК, который отличается на 10 пар оснований /105/. Поэтому полному нуклеосомному повтору соответствует максимальная длина фрагмента ДНК в' составе мононуклеосом. Длина нуклеосомно-

~ 10 -

го повтора ДБК может варьировать от 160 до 240 пар оснований для разных видов организмов, тканей и даже разных последовательностей ДБК в составе одной клетки /1,96,131,139,145,246/.Хотя накопленные данные указывают на вариабельность нуклеос (много повтора ДНК, однозначного объяснения причины такой вариабельности пока не найдено (см. раздел 1.2.2.I).

Структурными элементами нуклеосом являются ядро нуклеосо-мы, или кор-частица, и соединительный участок межнуклеосомной (линкерной, спейсерной) ДНК. Кор-частицы нуклеосом - объект многочисленных физических и химических исследований по субъединичной структуре хроматина. Они могут быть выделены путем обработки хроматина, лишенного гистонов HI/H5, микрококковой нукле-азой. Кор-частицы гомогенны по размеру, являются структурой достаточно стабильной и имеют строго определенный состав: октшлер кор-гистонов, включающий по 2 молекулы Н4, НЗ, Н2А и Н2В, и фрагмент ДНК длиной 146 пар оснований, наиболее прочно связанный с поверхностью гистонового октамера /139/.

Структура нуклеосомных кор-частвд исследовалась различными методами.

Топографию ДНК в составе кор-частиц и хроматина изучали, используя разнообразные эндонуклеазы: микрококковую нуклеазу /96,111,139,151,155,171,196/, панкреатическую ДНКазу (ДНКазу I) /128,129,152,170,197,198/, кислую ДНКазу селезенки (ДНКазу П) /130,197,198,235/, эндонуклеазу из Aspergillus /235/ и другие ферменты. Для таких широко используемых нуклеаз, как ДЖа-за I и ДНКаза П, характерно образование набора специфичных фрагментов ДНК, размер которых кратен 10 п.о. Доступность определенных фосфодиэфирных связей в ДНК нуклеосом действию эндонук-

- II -

леаз является доказательством поверхностного расположения ДНК по отношению к гистоновому октамеру, а накопление специфических продуктов гидролиза отражает структурную периодичность в организации ДНК внутри кор-частиц. Ряд работ был посвящен выяснению того, сколько пар оснований приходится на один виток суперспирали ДНК в кор-частице. Латтер, исследуя кинетику переваривания кор-частиц, меченных по 5 -концу, ДНКазой I и ДНКазой П /128,129,130/, обнаружил, что при электрофоретическом разделении фрагментов ДНК полосы имеют разную интенсивность, отражающую различную доступность участков ДНК действию фермента. Было установлено, что существует корреляция в частоте разрывов по местам, отдаленным друг от друга на расстояние 70-90 п.о. На основании этих данных в литературе утвердилось мнение, что на один виток суперспирали ДНК в составе кор-частщы приходится 80 нуклеотидных пар /35,96,139/. Б этом случае участки, удаленные друг т друга на расстояние 80 пар оснований ДНК, окажутся близко расположенными, в одинаковом окружении и, соответственно, будут проявлять одинаковую чувствительность к ДНКазе I.

В опытах Латтера /128,129,130/ было показано, что расстояние между наиболее доступными ДНКазе I и ДНКазе П фосфодиэфир-ными связями в нуклеосомной ДНК (нуклеазный повтор) кратно не 10",0 п.о,, а 10,4 п.о. Считают, что нуклеазный повтор, по-видимому, отражает шаг двойной спирали ДНК /96/. Это предположение впервые было высказано Ноллом /152/ в 1974 году. Следует отметить, однако, что для кольцевых замкнутых ДНК, которые характеризуются топологически инвариантной величиной Lk ( linking number ), отражающей число взаимозацеплений нитей ДНК в кольце /61/, существует несоответствие между теоретически рассчитанной

(-1,7) и экспериментально полученной (-1) величиной д Lk при переходе кольцевой замкнутой ДНК в кольцевую цепь нуклеосом /148/. Одни авторы, например, Клуг и др. /108/, связывают проблему топологического инварианта с уменьшением шага двойной спирали ДНК от 10,4 п.о. до 10,0 п.о. при переходе к.з. ДЖ в кольцевую цепь нуклеосом. Эти исследователи считают, что направление атаки ДНКазы I формируется под влиянием как гистонов, так и соседних супервитков ДНК в нуклеосоме, и нуклеазный повтор (10,4 п.о.) не соответствует истинному шагу спирали ДНК в нук-леосомах (10,0 п.о.) /108/.

Однако в работе Григорьева /8/ при анализе продуктов переваривания интактных и протеолизованных кор-частиц ДНКазой I было показано, что разворачивание кор-частиц при их ограниченном протеолизе, а значит, и частичное расхождение супервитков ДНК, не приводит к уменьшению нуклеазного повтора.

Как считают авторы этой работы, полученные данные свидетельствуют о полном соответствии нуклеазного повтора шагу спирали ДНК. Григорьев /8/, Ворсел и соавторы /243/ и некоторые другие исследователи связывают проблему топологического инварианта со сложной формой оси ДНК в нуклеосоме.

Инструментом в изучении организации ДНК на уровне нуклеосом может служить и микрококковая нуклеаза. В процессе гидролиза хроматина, когда происходит накопление кор-частиц, этот фермент делает как одно-, так и двухцепочечные разрывы ДНК внутри нуклеосомы /47, 94,198/. Однако в отличие от ДНКазы I или ДНКазы П, при использовании микрококковой нуклеазы возникают ослож-нения (вторичные явления), связанные с экзонуклеотической активностью фермента, а также с превращением одноцепочечных разры-

- ІЗ -

bob в двухцепочечные /58/. Это означает, что для определения положения и частоты первоначальных разрывов требуются достаточно сложные процедуры У58/. Микрококковая нуклеаза проявляет высокую избирательность в отношеюш различных последовательностей ДНК: предпочтительно делает разрывы в АТ-богатых районах, в последовательностях С-Т-А или Т-А-Т-А /94,140/, что также следует учитывать при интерпретации результатов.

ДНКаза I и микрококковая нуклеаза широко используются в работах по изучению структуры активных участков хроматина, проявляющих повышенную чувствительность к данным ферментам /15,96, 175,234/. Следует отметить, что достигнутые в этой области успехи связаны с усовершенствованием методов гибридизации и введением процедур " blot "-гибридизации с использованием ДШ-бу-маги (диазобензилоксиметил производное целлюлозы) /20/. Согласно современным представлениям /96,175,232,234/, повышенную чувствительность к ДЖазе I проявляют не только транскрибируемые участки хроматина, но и те гены, которые транскрибировались ранее, или те, которые являются потенциально активными. ДЖаза I выявляет такую структуру хроматина, которая "предрасполагает" его к транскрипции, при условии, что и другие клеточные факторы окажутся благоприятными. ДНКаза I выявляет также гиперчувствительные места в активном хроматине /121,175 /: '. ''и домены, прилегающие к кодирующим областям, которые проявляют повышенную чувствительность к ферменту, но несколько меньшую по сравнению с активными генами /175,203/. Повышенная чувствительность к микрококковой нуклеазе, по-видимому, отражает действительные уровни транскрипции соответствующих генов и связана с тем, что нуклеосомы активных генов имеют более вытянутую или более от-

крытую конформацию /29,127,169,173,174,175/.

Итак, изучение действия различных нуклеаз на ДНК в составе кор-частиц хроматина выявило, что молекула ДНК тлеет строго определенную ориентацию по отношению к гистоновому октамеру. В то же время, результаты химических исследований, использования методов спектроскопии и парамагнитного резонанса не исключают возможности локальных движении ДНК в составе кор-частицы /139/.

Гистоновыё октамер представлен тетрамером (H3-H4)₂ и диме-рами (Н2А-Б2В). "Аргинин-богатым"! гистонам НЗ и Н4 принадлежит решающая роль в формировании характерного гистонового комплекса и стабилизации структуры нуклеосом /110,111,197/. Гистон HI отсутствует в нуклеосомном ядре /71,110,111/.

Общие закономерности расположения гистонов вдоль ДНК в ну-клеосоме были установлены в исследованиях, проведенных А.Д.Мир-забековым и сотрудниками /26,142,143,144,191/. Авторы использовали метод ковалентных "пришивок" остатков лизина в гистонах к нуклеосомной ДЖ. Преимущество метода заключается в том, что разрыв цепей ДНК происходит только по месту пришивки, что позволяет установить положение гистонов на ДНК с помощью двумерного электрофореза. Закономерности в расположении гистонов, по-видимому, являются универсальными для нуклеосом всех эукарио-тов и сводятся к следующему:

Гистоны взаимодействуют с сегментами ДНК длиной около шести нуклеотидов, чередующимися со свободными сегментами в четыре нуклеотида; участки ДНК, свободные от гистонов, удалены друг от друга на расстояние, кратное 10 нуклеотидам.
Гистоны контактируют симметрично с обеими цепями ДНК; порядок их расположения, начиная с 5 -конца, следующий: (Н2В),

(B2B), (H4), (Н4), (Н4), (НЗ+Б2А), (Н4+НЗ), (ЕЗ), (Н2В), (Н2В), (Б2А), (КЗ). 3. Гистоны расположены латерально относительно двойной спирали ДНК, оставляя свободной противоположную сторону. Взаимодействующие с сегментами ДНК участки гистонов можно представить в виде неполных "браслетов", охватывающих ДНК по большой бороздке. Разрывы в "браслетах" обращены в одну и ту же, внешнюю от гистонов, сторону. Вероятно, специфическая укладка ДНК в нуклеосоме происходит вследствие электростатического отталкивания между фосфатными группами, расположенными на одной из сторон ДНК, в то время как фосфатные группы противоположной стороны нейтрализуются при

взаимодействии с латерально контактирующими гистонами /143/.До-

Р полнительным фактом в таком сворачивании может быть контакт ДНК

с определенными участками гистонов, обогащенными основными аминокислотами /139/.

Структура нуклеосомных кор-частиц интенсивно изучалась методом рентгеноструктурного анализа. Первые кристаллы кор-частиц, которые удалось получить Финчу и др. /75/ в 1977 году, содержали частично протеолизованные гистоны. Комбинируя результаты дифракции рентгеновских лучей с результатами электронной микроскопии кристаллов, авторы данной работы воссоздали структуру кор-частиц при разрешении 25 R. Их данные были полностью подтверждены и уточнены в дальнейших исследованиях, проведенных уже на кристаллах интактных кор-частиц, при разрешении 5-7 $. /76,178/.

Согласно результатам- рентгеноструктурного анализа /75,76, 178/, кор-частицы имеют форму плоского диска, или тороида, с

размерами НО х.ПО х 57 R и характеризуются осью симметрии второго порядка. Молекула ДНК длиной 146 п.о. находится в В-фо-рме и образует приблизительно 1,75 витка левой суперспирали вокруг октамера гистонов, шаг которой равен 28 к. Поверхностное расположение ДНК относительно гистонового октамера было доказано также и методом рассеивания нейтронов под малыми углами в сочетании с контрастирующим маскированием смесью 1^0-Д^О /27/.

В 1980 году в лаборатории Клуга /107/ удалось закристаллизовать октамер кор-гистонов. Методом электронной микроскопии кристаллов было показано, что организация гистонового октамера в точности соответствует внутреннему пространству в суперспирали ДНК. Гистоновый октамер имеет спиралеобразную поверхность; она устроена в виде каркаса, в который укладывается ДНК, образуя 1,75 витка левой суперспирали вокруг октамера кор-гистонов и давая соответствующие очертания нуклеосомному кору /76/.

Недавно была опубликована работа по изучению структуры кор-частиц нуклеосом методом рассеивания нейтронов с использованием контрастирующего маскирования смесью В^О-Д^О /28/. Этот метод позволяет изучать структуру отдельно гистонового октамера и отдельно ДНК непосредственно в составе кор-частиц. Такая возможность исключена при использовании метода дифракции рентгеновских лучей, т.к. разрешение в 7 R недостаточно, чтобы отличить белки от ДНК. Авторы данной работы, во-первых, подтвердили полученные методом дифракции рентгеновских лучей данные о пространственной организации кор-частиц и, во-вторых, уточни":-ли результаты Мирзабекова /142/ и Клуга /107/ по расположению гистонов в их составе. Было показано, что гистоновый октамер слагается из 4 димеров двух типов: (НЗ-Н4) и (Н2А-В2В). Димеры

(B3-H4) являются наиболее важными в формировании компактной глобулы, они взаимодействуют как с центральным районом ДНК (положения 40-100), так и с концами молекулы. За контакты с ДНК по концам молекулы ответственен гистон НЗ. Димеры (Н2А-Н2В) располагаются по бокам тетрамера и.осуществляют тесный контакт с ДНК по положениям 10-30 и II0-I30. Поскольку метод позволяет различать гидрофобные и гидрофильные районы в гистонах, которые рассеивают нейтроны по-разному, удалось установить, что гистоны в составе димеров контактируют своими гидрофобными участками. С другой стороны, взаимодействия между димерами в составе октаме-ра осуществляются за счет аминокислотных остатков гидрофильного характера. В некоторых местах гистоны внедряются между двумя нитками суперспирали ДНК, что приводит к нарушению симметрии в структуре белкового компонента кор-частиц /28/.

Кроме гистонов, в состав нуклеосом могут входить негисто-новые белки хроматина группы hmg , тлеющие молекулярную массу менее 30000 дальтон и содержащие 2Ъ% основных и 30% кислых аминокислот /234/. Предполагают, что HMG -белки преимущественно связываются с нуклеосомами активного хроматина /51,175,187,234/. Недавно методами крутового дихроизма и тепловой денатурации было показано, что присоединение HMG-I4 и HMG-I7 к кор-частицам нуклеосом приводит к повышению их стабильности /165/.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что с одной нукле-осомой ассоциирована лишь одна молекула "лизин-богатого" гисто-на HI, который имеет поверхностное расположение в фибрилле ДНК и, по-видимому, взаимодействует с межнуклеосомной ДНК /71,110, 111,216/. В ряде случаев HI может быть заменен на другие специфические "лизин-богатые" гистоны, например, на гистон Н5 у жи-

вотных, имеющих ядерные эритроциты (птиц, рептилии, амфибий, рыб и некоторых морских беспозвоночных) /71,139/.

С помощью метода химических "пришивок" было показано, во-первых, что гистон HI должен находиться в тесном контакте с ги-стоновым октамером, особенно с гистоном КЗ /181/, и, во-вторых, что глобулярная часть этого белка "замыкает" два полных витка суперспирали ДНК вокруг гистонового октамера /18/. Соответствующая частица, хроматосома, включает 166 пар оснований ДНК /194/.

Согласно современным представлениям /18,26,155,176,225/, центральная глобулярная область молекулы гистона HI взаимодействует с "концагли" нуклеосомной ДНК. Высокоосновные ^N~ и С-кон-цевые фрагменты имеют, вероятно, вытянутую конформацию, например, типа полипролиновой спирали, и взаимодействуют с ДНК, не занятой гистонами октамера, или с межнуклеосомной ДНК. Такое расположение различных доменов молекулы гистона НІ в составе нуклеосомы должно способствовать нейтрализации отрицательного заряда ДНК на протяженных участках и вызывать изгиб линкерной ДНК, что приведет к более тесному расположению соседних нуклео-сом относительно друг друга. Последовательно расположенные и плотно упакованные нуклеосомы образуют 100-5 нить', которая далее укладывается в суперструктуры более высокого порядка /45, 96,106,139/.

1.1.2. n-и С-концевые домены гистонов. Структурные различия и роль в поддержании структуры ДЩ

I.I.2.I. Общие закономер_ности__строения гистонов__-_ наличие авух_структур_но различных частей__ молекул

Обязательным компонентом хроматина эукариотической клетки являются небольшие белки основного характера - гистоны, из которых в состав кор-частиц входят "богатые аргинином" гистоны НЗ и Н4 и "умеренно богатые лизином" гистоны Н2А и Н2В. При анализе первичных структур кор-гистонов из различных организмов (см. обзоры 139,226) обращают на себя внимание следующие отличительные черты:

(а) выявляется неравномерное распределение аминокислот по дли
не молекул гистонов. С-концевые две трети сходны по амино
кислотному составу с типичными глобулярными белками, a N-
концевая треть молекул обогащена основными аминокислотными
остатками;

(б) все гистоны, а особенно "богатые аргинином" НЗ и Н4, прояв
ляют высокую консервативность в эволюции. Для "умеренно бо
гатых лизином" гистонов Н2А и Н2В характерно наличие консе
рвативных центральной и С-концевой областей и более вариа
бельного в эволюции ^N -концевого участка молекул. Аминокис
лотные замены сосредоточиваются преимущественно в N -конце
вой трети молекул этих гистонов;

(в) все основные места ацетилирования, фосфорилирования, метили
рования и ІЩФ-рибозилирования in vivo в гис тонах Н2А, Н2Б,
НЗ и Н4 локализованы в ^N -концевых областях.

На основании анализа первичных структур кор-гистонов было высказано предположение, что близкие к и-концам районы молекул гистонов обладают пониженной способностью образовывать структуры типа <к-спиралей и $-слоев, а обогащенные гидрофобными аминокислотами центральные и С-концевые области имеют вторичную и третичную структуру, характерную для глобулярных белков, и участвуют в образовании межгистоновых контактов /116/.

С целью экспериментально подтвердить эти предположения Брэдбери с сотрудниками было проведено изучение физико-химических свойств выделенных в свободном виде гистонов. Методами дисперсии оптического вращения (ДОВ) и ЯМР-спектроскопии было исследовано влияние изменения ионной силы и рН раствора на пространственную организацию свободных гистонов. Было показано, что существующая в условиях высокой ионной силы (IM NaCl ) компактная глобула формируется центральной и С-концевой частями гистонов, а N -концевая область остается в конформации "свободного клубка" при любых значениях ионной силы от 0 до 2,5 М NaCl /38,39,52,147/. Структурированные С-концевые 2/3 молекул кор-гистонов могут, очевидно, выполнять функцию взаимодействия с другими гистонами в нуклеосоме за счет образования гистон-ги-стоновых комплексов.

Д'Анна и Айзенберг исследовали попарные взаимодействия различных гистонов в растворе /63,100/. Изучая спектры кругового дихроизма и флуоресцентную анизотропию гистоновых комплексов, авторы установили, что при их образовании увеличивается количество cL -спиралей в гистонах. Используя этот подход для оценки прочности образующихся комплексов, они показали, что существуют сильные попарные взаимодействия между гистонами НЗ и ЇЇ4,

Б2В и Н2А, Н2В и Н4, а взаимодействия между гистонами Б2В и НЗ, а также Н2А с КЗ и ЇЇ4 являются значительно более слабыми. Такие же попарные взаимодействия были продемонстрированы для гистонов, выделенных из растений (горох) /202/ и микроорганизмов (дрожжи, тетрахимена) /82,115,133/. В дальнейшем была установлена универсальность данного явления: гистоны животных и растений (тимус теленка - горох), животных и микроорганизмов (тимус теленка -дрожжи, тимус теленка - тетрахшлена) формировали гетерологичные комплексы, которые имели такие же константы связывания, как и гомологичные /82,100,115,133,139/. Эти результаты свидетельствуют о том, что поверхности взаимодействия в гистонах практически не изменялись в ходе эволюции.

В лаборатории Брэдбери исследовалась способность к взаимному связыванию гистонов Н2А и Н2В, НЗ и Н4, а также различных пептидов этих гистонов, что позволило установить, какие участки гистонов вовлечены в формирование комплексов. За образованием комплексов следили по изменению спектров ПМР в областях, соответствующих ароматическим аминокислотным остаткам. На основании спектрального анализа был сделан вывод о том, что гистоны Н2А и Н2В взаимодействуют за счет областей, соответствующих аминокислотным остаткам 31-95 для гистона Н2А и 37-114 для Н2В /147/. Для образования комплекса НЗ-Н4 необходимы участки гистонов с 42 по 120 аминокислотный остаток в молекуле НЗ и с 38 по 102 - в молекуле Н4 /31,146/. При этом кг -концевые участки гистонов в составе комплекса имеют неупорядоченную конформацию. Другими словами, центральные и С-концевые области молекул гистонов вовлечены в образование четвертичной структуры соответствующих гистоновых комплексов, а N -концевые участки не требу-

ются для их формирования.

Итак, результаты по изучению первичной структуры гистонов и их физико-химических свойств в растворе свидетельствуют о наличии двух структурно различных частей в молекулах всех кор-ги-стонов - Н4, НЗ, Н2А и Н2В, - причем только одна из них принимает участие во взаимодействиях между гистонами. Существование этих структурных особенностей позволило выдвинуть гипотезу об определенной функциональной нагрузке на различные части гистонов в составе хроматина. Согласно этой гипотезе, близкие к ^її~ концу участки гистонов, обладающие неупорядоченной конформа-цией в растворе и имеющие большой положительный заряд, связываются преимущественно с ДЕК в составе хроматина. С-концевые и центральные участки гистонов, имеющие глобулярную структуру, в составе хроматина взаимодействуют друг с другом, образуя компактную сердцевину нуклеосомы /39,52,100,110,133,216,230/.

І.І.2.2. Фушщионазтная^о%% jjJJ-KOHseBtK йоменов молекул гистонов_в_составе_ДНП_

Одним из методов, позволяющих оценить расположение и места контактирования гистонов в составе ДНІ, является метод ковалентних химических'сшивок". Продукты сшивания гистонов между собой могут отличаться при применении различных сшивающих агентов. Однако сопоставление данных, полученных разными методами, свидетельствует о том, что наиболее прочными контактами между гистонами ЇЇ4 и Б2В, Н2А и Б2В, НЗ и Н4 в растворе являются те, что наиболее часто фиксируются при примннении различных сшивающих агентов. Это является сильным доводом в пользу того предположения, что специфические контакты между гистонами в растворе

сохраняются и в составе хроматина.

Так, группе Мартинсона при облучении клеточных ядер ультрафиолетовыми лучами удалось зафиксировать сшивки между гисто-нами Н2А и Н2В, Б2В и Н4. Сшивки образуются между остатками тирозина - 37, 40 или 42 - в молекуле Н2В и остатком пролина 26 в Б2А /70/. Гистоны Н2В и ЇЇ4 сшиваются в нескольких местах, которые локализованы в близких к С-концу фрагментах гистонов Н2В и Н4^:, полученных при их обработке CNBr /137/. Поскольку для сшивок, вызванных УФ-облучением, необходим непосредственный контакт гистонов, то эти данные подтверждают предположение об участии С-концевых и центральных участков гистонов в межгисто-новом взаимодействии. Японским исследователям /213/ при использовании диметилсуберимидата удалось обнаружить следующие сшивки: между лизином-74 в Н2А и лизином-24 или 27 в Н2В; между лизином -34 и 85 в Н2В; между лизинами 5 и 9 в Н2А; между лизи-ном-120 в Н2В и лизином-115 в НЗ или лизином-77 в ЇЇ4; между ли-зином-85 в Н2В и лизином-9І в Н4. Результаты этих и многих других исследований /37,97,219/ с использованием метода ковалентних "сшивок" не противоречат предположению об участии С-концевых и центральных доменов гистонов в образовании связей, определяющих строение компактной белковой сердцевины нуклеосомы. Эти данные свидетельствуют также о том, что ^N -концевые участки не взаимодействуютдруг с другом. Очевидно, они могут быть теми основными элементами, за счет которых осуществляется взаимодействие гистонов с ДІЖ.

Для того, чтобы установить, какие участки гистонов экспонированы на поверхность гистонового октамера, а также оценить вклад различных доменов в поддержание структуры ДШ, использу-

ются многочисленные протеолитические ферменты: трипсин /35/, химотрипсин /197/, трипсиноподобная эндогенная протеаза пыльцы растений /41/, протеаза подчелюстной железы /180/, протеаза _из Staphylococcus aureus /179/. При обработке нативного хроматина трипсином гистоны довольно быстро гидролизуются до сравнительно крупных пептидов (более 50$ по молекулярной массе от исходных гистонов), которые гораздо более устойчивы к действию фермента, чем интактные гистоны. Впервые продукты ограниченного трипсинолиза гистонов в составе хроматина охарактеризовали

Вайнтрауб и Ван Лент. Устойчивые пептиды (PI-P5) были выделены

о путем элюции из полиакриламидного геля после электрофретическо-

го разделения и методом пептидных карт было установлено, что они принадлежат к центральным и С-концевым областям молекул кор-гистонов /229/. Пептиды PI-P5, образующиеся при обработке трипсином нативных кор-частиц /117,236/, реконструированных кор-частиц /215/, хроматина /229,230/ и целых ядер /32-34,197/ имеют одинаковые электрофоретические подвижности и, следовательно, являются сходными или идентичными. Это позволяет сопоставлять некоторые результаты при исследовании кор-частиц и хроматина.

Такой же набор фрагментов накапливается при обработке.хроматина химотрипсином, ферментом другой специфичности /197/. Это свидетельствует о том, что характер образующихся пептидов определяется именно доступностью (поверхностным расположением) некоторых участков гистонов действию протеаз. Однако трипсин является более удобным инструментом протеолиза в силу большей специфичности, и именно он употребляется в большинстве работ, связанных с протеолизом хроматина.

.В литературе не существует единого мнения по поводу того, как отличаются гистоны в составе ДНП друг от друга по степени чувствительности к трипсину. В разных работах указывается разная последовательность переваривания гистонов ферментом: Н4>Н2А = Б2В (хроматин) /229/; Н2А>Б2В = Н4 (хроматин) /153/; Н2А = Б2В>-Н4 (ядра) /197/; Б2А^Б2В>Н4 (кор-частицы) /117/; Н2А^Н4^Н2В (нуклеосомы) /236/; Н2В>Н4>Н2А (кор-частицы) /180/, но все авторы подчеркивают наибольшую чувствительность к трилсинолизу гистона БЗ. В недавнем, более детальном исследовании /89/ было показано, что относительная подверженность гистонов в хроматине протеолизу зависит от ионной силы раствора и от присутствия либо отсутствия гистонов НІ/Н5.

Относительная устойчивость к трилсинолизу таких высоко основных белков, как гистоны, указывает на то, что большая их часть в составе хроматина защищена от действия фермента. Следу-ефодчеркнуть, что при обработке трипсином выделенного в 2 М NaCl гистонового октамера происходит накопление таких же фрагментов, что и при обработке кор-частщ или хроматина /117,229, 230/. На основании этих данных было высказано предположение, что только белок-белковые взаимодействия защищают гистоны от действия фермента /230/.

Сравнительно недавно пептиды PI-P5 были выделены в препаративных количествах и просеквен^ированы, что позволило точно установить места атаки трипсином в кор-гистонах (см. табл. I). Из данных, представленных в таблице I, следует, что в ходе ограниченного протеолиза гистоны теряют 20-30 аминокислотных остатков, близких к N -концу (а в случав гистона Н2А - близких к С-концу) и сохраняют свои центральные и С-концевые участки в

виде сравнительно крупных пептидов, составляющих более 50% от молекулярной массы исходных гистонов и не теряющих связи с ДНК. Доступность N -концевых доменов гистонов действию протеаз свидетельствует о наружном расположении этих участков в составе ДНИ и позволяет изучать их вклад в поддержание компактной структуры ДШ путем сравнения свойств интактных и проте олизованннх кор-частиц (или хроматина до и после обработки его трипсином).

ТАБЛИЦА I

Идентификация пептидов, образующихся при ограниченном

протеолизе нуклеосом.

Методом электронной микроскопии было показано, что обработанный трипсином хроматин сохраняет характерную "бусиничную" ультраструктуру /19/.

Распределение доступности определенных связей действию

ДНКазы I не изменяется в кор-частщах до и после протеолиза, что свидетельствует о сохранении структурной целостности ДНИ /117,236,237/. Однако общая скорость нуклеазной реакции увеличивается для протеолизованных кор-частиц в несколько раз /87, 117,236,237/, и это явление до сих пор остается непонятным.

Спектры кругового дихроизма протеолизованных кор-частиц обнаруживают большее, чем раньше, сходство с КД-спектром свободной ДЖ, при этом величина эллиптичности при 280 нм занимает промежуточное положение между величиной эллиптичности для свободной ДНК и для интактных кор-частиц /117,185,236,237/.

Температура плавления протеолизованных кор-частиц сдвигается к более низким значениям тем сильнее, чем больше степень протеолиза /78,117,185,236,237/, т.е. становится ближе к температуре плавления свободной ДНК.

Таким образом, накопленные данные доказывают, что хотя изменяются некоторые свойства нуклеосом после обработки их трипсином, они все же являются достаточно устойчивыми структурами.

В нескольких лабораториях изучалась скорость седолентации кор-частиц до и после ограниченного протеолиза, однако поставленные эксперименты дали противоречивые результаты. В ряде исследований было зафиксировано значительное уменьшение коэффициента седиментации кор-частиц после ограниченного протеолиза: от II^s до 6,5S /117,185/. Эти эксперименты проводились в растворах с низкой ионной силой - 10 мМ NaCl . Для объяснения существенного уменьшения скорости седиментации нуклеосом в ходе протеолиза исследователи предположили, что кор-частица при обработке трипсином претерпевает "разворачивание". Такое объяснение подтверждало гипотезу некоторых авторов о том, что N-

концевые домены гистонов, обладая большой протяженностью и значительным положительным зарядом, могут соединять удаленные участки ДНК, стабилизируя суперспиральный.виток в составе кор-час-тицы в диаметральном направлении /231/. В опытах с применением центрифугирования в градиенте сахарозы было зафиксировано лишь незначительное изменение коэффициента седиментации с 10,7 s для интактных кор-частиц до 9,OS - для протеолизованных /236/.Сле-дует отметить, что в данной работе использовались растворы с высокой ионной силой - 100 мМ NaCl. В этих же экспериментах было установлено, что крупные пептиды - продукты протеолиза - се-диментируют вместе с ДНК, т.е. гистоны сохраняют связь с ДНК, несмотря на потерю N -концевых участков молекул. Основываясь на этих результатах, а также на экспериментах, установивших, что распределение доступности определенных связей действию ДНКа-зы І в интактных и протеолизованных кор-частицах одинаково, авторы предположили, что протеолизованная кор-частица способна поддерживать конформацию ДНК, характерную для интактного хроматина. Оставалось, однако, неясным, сохраняются ли при этом в составе кор-частиц низкомолекулярные продукты протеолиза и участвуют ли.они в поддержании структуры нуклеосом, обработанных трипсином.

Григорьев и Крашенинников /6,7,87/ на основании результатов аминокислотного анализа белков интактных и протеолизованных кор-частиц показали, что низкомолекулярные продукты протеолиза, соответствующие N -концевым участкам молекул кор-гисто-нов, не связаны с трипсинизированными нуклеосомами. Измеряя скорость седиментации протеолизованных кор-частиц в растворах с различной ионной силой, авторы показали, что её уменьшение

при ограниченном протеолизе кор-частщ, которое наблюдали одни исследователи /117,185/, может быть полностью или частично предотвращено путем повышения концентрации солей в растворе. В растворах с высокой ионной силой протеолизованные кор-частицы се-диментируют со скоростью, близкой к скорости седиментации инта-ктных кор-частиц, что наблюдали другие исследователи /236/. Следовательно, кор-частицы, претерпевшие ограниченный протеолиз, сохраняют способность находиться в компактном состоянии, несмотря на удаление обогащенных положительно заряженными аминокислотами ^N -концевых участков гистонов, которые, вероятно, вносят лишь электростатический вклад в поддержание структуры кор-частиц /6,7,87/.

Таким образом, совокупность результатов по ограниченному протеолизу кор-частщ свидетельствует о том, что удалениеп -концевых доменов гистонов не нарушает существенным образом основные взаимодействия внутри кор-частщ и не влияет на способность оставшихся пептидов сворачивать ДНК в компактные частицы. Следует отметить, что первые кристаллы кор-частщ, которые удалось получить и которые дали основные сведения о форме и размере кор-частщ, содержали частично проте олизованные гистоны /75/. А.Д.Мирзабеков /144/ полагает, что роль n -концевых доменов гистонов в формировании структуры хроматина проявляется на более высоких уровнях его организации. Ряд авторов считает, что они .служат своеобразным "мостом" между соседними нуклеосомами /19, 35/. Так, если к хроматину, лишенному гистона HI, после обработки его трипсином, снова добавить гистон НІ, то реконструированный хроматин будет лишен только n-концевых доменов кор-гис-тонов. Было показано, что такой хроматин представляет собой до-

-ЗО -

вольно "открытую" структуру, не способную укладываться в соленоид, что свидетельствует об участии ^N -концевых областей гис-тонов в конденсации хроматина /19/. В опытах с использованием трипсина, иммобилизованного на коллагеновой мембране, Мариан и другие показали, что разворачивание хроматиновых фибрилл происходит тогда, когда ферментом удаляется и -концевой участок ги-стона КЗ /134/. Крэйн-Робинсон подчеркивает, что наиболее разумной гипотезой в настоящее время является предположение о том, что N-концевые домены кор-гистонов (и гистона НІ), чувствительные к действию трипсина, представляют собой "руки" катионов, которые выходят за пределы кор-частицы и нейтрализуют отрицательный заряд ДНК, стабилизируя и контролируя укладку нуклеосом в структуры более высокого порядка /35/.

С другой стороны, Симпсон и Бергман /195/ показали, что по некоторым характеристикам (тепловой фазовый переход, нукле-азная чувствительность и др.) обработанные трипсином нуклеосомы хроматина из спермы морского ежа являются менее устойчивыми по сравнению с нативными нуклеосомами. Было высказано предположение о том, что меньшая стабильность обработанных трипсином нуклеосом все же связана с утратой удлиненной (за счет повторяющихся пентапептидов основного характера) И -концевой области молекулы гистонов Н2В, входящих в их состав.

Поспелов и соавторы /167/ исследовали действие нуклеазыБ1 на интактный и обработанный трипсином хроматин. Электрофорети-чески были выявлены продукты гидролиза нативного хроматина', размер которых был больше 300 нуклеотидов и кратен 10. Таким образом, было показано, что гистоны предохраняют нуклеосомную и лин-керную ДНК от действия нуклеазы. 10-ти нуклеотидная периодич-

-ЗІ -

ность продуктов гидролиза сохранялась после удаления гистона НІ, но нарушалась после обработки хроматина трипсином,т.е. после удаления -концевых участков гистонов. Авторы делают вывод о том, что межнуклеосомная ДНК взаимодействует с N -концевыми областями кор-гистонов.

Таким образом, дальнейшие исследования должны дать ответ на вопрос, играет ли ^-концевая область всех гистонов октамера или некоторых из них определенную роль на уровне нуклеосом или (и) во время суперспирализации хроматина, т.е. при формировании более высоких уровней его организации.

1.2. ХРОМАТИН НИЗШИХ ЭУКАРИОШЧВСКИХ ОРГАНИЗМОВ

мембрана /84,247/, центриоли не образуются и не наблюдается ярко выраженной конденсации хромосом, свойственной высшим эукари-отам /247/.

1.2.I. Гистоны низших эукариотических организмов

Если за последние 10-15 лет были достигнуты большие успехи в изучении первичной структуры гистонов из различных организмов, относящихся к высшим эукариотам /226/, то гистоны из низших эукариотических организмов остаются гораздо менее изученными.

Наличие белков, близких к типичным гистонам по ряду биохимических свойств (экстракционные свойства, подвижность при электрофоретическом разделении, аминокислотный состав и другие), доказано для представителей всех низших эукариотов: водорослей - Euglena gracilis /182/, Olisthodiscus luteus /183/; простейших - Tetrahymena piriformis /102/, stylonychia mytilis /118/, Astasia longa /17/; миксомицетов - Physarum poly-cephalum /55,141,182/, Dictiostelium discoideum /22,56/, Polysphondylium pallidum /182/. В настоящее время присутствие 5 гистоновых фракций обнаружено у N. crassa /5,11,83,113/ несовершенного гриба Aspergillus nidulans /74/, зигомицета Phycomyces biakesleeanus (за исключением гистона, аналогичного НЗ) /59/ и аскомицетов - дрожжей Saccharomyces cerevisiae /43/ и S.^r carlsoergensis /164/. Однако вопрос о наличии НІ в дрожжах остается открытым /43,64,172,202,212,217/. Гистоноподобные белки обнаружены также в оомицете Achla bisexualis /93/ и аско-мицете Cordyceps militaris /98/, но сравнения их свойств с гистонами высших эукариотов проведено не было.

Наиболее эволюционно консервативными среди гистонов являются "богатые аргинином" гистоны Н4 и НЗ. На это указывало сходство электрофоретических подвижностей данных белков, выделенных из многих высших эукариотических организмов /161,163,201/. Предположение об идентичном строении и сходных функциях Н4 и НЗ в хроматине всех высших животных и растений полностью подтвердились результатами исследований, в ходе которых была доказана ключевая роль этих белков в формировании ядра нуклеосомы /ПО, 112,197/, а также результатами исследований первичной структуры НЗ и Н4 ряда организмов. Например, аминокислотная последовательность Н4 из тимуса теленка /66/ отличается от Н4 из проростков гороха /67/ всего двумя остатками: валин в положении 60 ти-муснчгогистона замененв гистоне гороха на изолейцин, а лизин-77 -на аргинин. Эти замены являются консервативним и не могут оказать существенного влияния на пространственную организацию его молекул. 7 гистона НЗ из проростков гороха обнаружены только 4 замены по сравнению с НЗ из тимуса теленка /68/, причем три из них консервативны /166/. Отметим, что консервативными называют аминокислотные замены, при которых не изменяется заряд, гидро-фобность и размер (объем) молекулы. Полуконсервативными - заме-

ны, когда изменяется объем, но не заряд молекулы. Неконсервативными всегда будут замены, изменявшие её гидрофобность и объем.

Первичная структура гистонов Н4 из аскомицетов - плесневого гриба N.' crassa и дрожжей S. carlsbergensis - была определена по результатам секвенирования ДНК генов соответствующих гистонов /244/. Каждый из этих белков отличается от Н4 тимуса теленка 8-ю аминокислотными заменами консервативного и полуконсервативного характера, половина из которых расположена в центральной части молекулы белка. 3 аминокислотные замены (положения 21, 83 и 84) идентичны у гистона Н4 обоих грибов (табл. 2). Установленные отличия в первичной структуре этих белков не из-

ТАБЛИЦА 2. Аминокислотная последовательность гистона Н4 из тимуса теленка и некоторых представителей

низших эукариотических организмов.

I»Ac-Ser-Gly-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly-Lys-Gly-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Hxs- -Arg-Lys-Val-Leu.-

_f Thr-Gly-Arg-Gly-Ly s-Gly-Gly-Ly s-Gly-Le u-Gly-Ьу s-Gly-Gly-Ala-Ly s-Ar g-His- -Arg-Ly s-Ile-Le u~
V Ser^-Gly-Arg-Gly-Ly a-Gly-Gly-Ly s-Gly-Leu-Gly-Ly s-Gly-Gly-Al a-Ly s-Arg-His- rArg-Ly s-Ile-Le u-. ^.M^Ala-Gly- -Gly-Lys-Gly-Gly-Lys-Gly-Met-Gly-Lys-Val-Gly-Ala-Lys-Arg-His-Ser-Arg-Lys-Ser-Asp-

30 40 .

1,Arg-Asp^sn-Ile^ln-Gly-Ile^hr-Lys-Pro-Ala-Ile-^

2 » Arg-Asp-Asn-Il e-Gln^rly-Ile-Thr-Ly s-Рг o-Ala-Il e-Arg-Arg-Le u-Al a-Arg-Ar g^ly ^ly rVal-Ly s-Ar g--Il e-3_tArg-Asp-AsnTlle-Gln4KLy-Ile-Thr~bys-Pr^

4,Lys~Ala-Ser-Ile^lu4Tly-Ile~Thr-Lys-Pro-Ala-Ile-Arg-Arg-Leu-Ala-Arg-Arg4ily^ly-Val-Lys-Arg-Ile-- ,

50 60 70 '

T,Ser-Gly-Leu-Ile-Iyr-Glu-Glu-Thr-Arg-Gly-Va^^

2^Ser-Ala-Met-Ile-Tyr-Glu4jlu-Thr-Arg-Gl^ 3,Ser-Gly-Leu-Ile-a?yr-Glu-Gla-Val-Arg-Ala-Yal-Leu-Lys-Ser-Phe-Leu^lu-Ser-Val-Ile-Arg-Asp^er-Yal- ^tf

4.Ber-Ser-Phe-Ile-Q}yr-Asp-Asp-

80 90.

1^r-^r-Ihr-Glu-His-Ala-bys-Arg-Lys-a?to^ 2^hr-Tyr-0}hr-Glu-His-Ala-Lys-Arg-Lys-Thr^ 3^0!hr-a}yr-Thr-Gla-His-Ala-Lys-Arg~Lys-Thr^^

4-.,--- -_.-- Met-Asp-Val-Val-Tyr-Ala-Leu-Lys-Arg^ln-Gly-

100. 102
1 Arg-Thr-Le u-Tyг-Gly-Phe-Gly-GlyrOH
2 Arg-Thr-Le u-Iyr_TGly-Phe-Gly-Gly-OH
3,Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
4,!Arg-0}hr-

Примечание: І ^це.ен^/66 ^.- ^_газза _/244 / ; 3.- svca,l₃ber_Sens_la /244/; С - -- 7 - последовательность неизвестна.

меняют числа содержащихся в их молекулах основных и кислых аминокислот, т.е. общего заряда молекулы, и, вероятно, не повлияют и на способность гистонов Н4 грибов образовывать комплексы с друтими гистонами - БЗ, Н2В. Действительно, Мардиан и Айзенберг /133/ показали, что димеры Н2В-ЇЇ4, образованные гистонами близкого вида дрожжей Sv cerevisiae , имеют сходные параметры кругового дихроизма и флуоресцентной анизотропии с аналогичными гистоновыми комплексами из тимуса теленка.

Гловер и Горовский изучали спектры кругового дихроизма и флуоресцентную анизотропию комплексов, образованных гистонами Tetrahymena thermophila , а также гетерологичных комплексов, образованных гистонами тетрахимены и тимуса теленка /82/. Было показано, что если Б2А, Н2В и НЗ простейшего не отличается от аналогичных гистонов позвоночного животного по способности образовывать комплексы, то взаимодействие Н4 тетрахимены с НЗ как тетрахимены, так и тимуса теленка оказалось значительно слабее, чем в комплексе Н4-ВЗ, образованном гистонами тимуса теленка.

Таким образом^ гистон Н4 из простейшего тетрахимены существеннее, чем таковой из грибов - аскомицетов отличается от типичного гистона Н4.

В таблице 3 представлены первичные структуры гистонов НЗ из K.crassa /244/ и S.carlsbergensis /44,244/. В отличие от НЗ из высших эукариотов, обнаружены 15 аминокислотных замен, в основном, консервативного и полуконсервативного характера в НЗ двух грибов по сравнению с НЗ тимуса теленка, II из них одинаковы для белков из обоих грибов. Существенное отличие состоит в том, что в положеюш НО молекула НЗ нейроспоры содержит, как и типичный гистон КЗ, остаток цистеина, а в молекуле гистона НЗ

ТАБЛИЦА 3.

Аминокислотная последовательность гистона НЗ из некоторых организмов

1 ^₂-Ala-Arg-Thr-Ly s^ln-Thr-Ala-Ar g

2+ Ala-Arg-ThrrLy s-Gln-Thr-Ala-Arg-Ly s-Ser-Thr-GlyrGly-Ly s-Ala-Pro-Arg-Ly s-Gln-Leu-Ala-Ser-3 V Al a-Arg-Thr-Ly s-Gln-Thr-Ala-Arg-Ly s-S er-Thr-Gly-Gly-Ьу s-Ala-Pro-Arg-Ly s-Gln-Ье u-Ala-Ser-

1'_tLysrAla-Ala-ArgrLys-Ser-Ala-Pro-Ala-Tha?^ly^ly-Val-Lys-Lys-Pro-His-Arg-Tyr-Arg-Pro--Gly-Thr-2^ys-Ala-Ala-Arg-Lys^er-Ala-Pro-Se2vThr^l^^ 3.bys-Ala-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Ser-Thr-Gly-Gly-Val-Lys-Lys-Pro-His-Arg-Tyr-Lys-Pro-Gly-Thr-

50 , 60 I

T^al-Ala-Leu-Arg-Glurlle-Arg-A^ со

2_fYal-Ala-Leu-Arg-Glu-Ile-ArgrArg-TyrTGln-Lys-Ser-Thr-Gln-Leu-Leu-IlerArg-Lys-Leu-Pro-Phe-Gln- "^
3V7al-Ala-Leu-Arg-Glu-Ile-Arg-Arg-Phe^ I

l;Arg-Leu-Val-Arg-Glu-Ile-Ala-Gln-Asp-PherLys-Thr-Asp-LearArgTPhe-Gln-Ser-Ser-Ala--Val-Met-Ala--2-*Arg-Le u-Val~Arg-Gl u-Ile-Ala-Gln-Asp-Phe-Ъу s-Ser-Ap-Le u-Arg-Phe-Gln-Ser-Ser-Ala-Ile-Gly-Le u-3vArg-Leu-Val-Arg-Glu-Ile-Ala-Gln^^

.100 110

1^Le u-Gln-Glu-Ala-Cy s-Glu-Al a-Ty r-Leu-Val-Gly-Le u-Phe-Gl u-Asp-Thr-Asn-Le u-Cy s-Ala-Il e-His-Ala-2^ea^ln-Glu-Ser-Val-Glu-Ser--Tyr-Leu-Val-Ser--Leu-Phe--Glu-Asp-Thr-Asn-Lea-Cys-Ala-Ile-His-Ala-3.Leu-Gln-Gla-Ser-Yal-Glu-Ala-Tyr-Leu-Val-Ser-Leu-Phe-Glu-Asp-Thr~Asn-Lea-Ala-Ala-Ile-His-Ala-

1 Діу s-Arg-Val-Thr-Il e-Me t-Рг o-Ly s-Asp-Il e-Gln-Le u-Al a-Arg-Arg-Il e-Ar g-Gly-Gl u-Arg-Ala-OH 2»Lys-Aj?g-Yal-Thr-Ile-Gln-Ser-Lys-Asp-Ile-Gln-Leu-Ma-Arg-Arg-Leu-Arg-Gly-Glu-Arg-Asn-0H 3 _#Ly s-Arg-Val-Thr-Ile-Gln-Ly s-Ly s-Asp-Il e-Ly s-Le u-Ala-Arg-Arg-Le u-Ar g-Gly-Gl u-Arg-Ser-OH

Примечание: І.-тимус теленка/68/; 2,- N.'crassa /244/t 3,- sVcarlsbergensis /44,244/

дрожжей остатков цистеина не содержится. Обнаруженные замены располагаются преимущественно в последней С-концевой трети молекулы, обогащенной неполярними аминокислотами и принимающей участие в белок-белковых взаимодействиях /38,63,73,100,139/. Мардиан и Айзенберг методом КД-спектроскопии показали, что при образовании комплекса НЗ-ЇЇ4 у близкого к s.carisbergensis вида дрожжей s.cerevisiae не наблюдается увеличение количества «^ -спиралей, как это происходит при формировании аналогичного комплекса гистонов из тимуса теленка /133/. Эту особенность авторы связывают со структурой гистона НЗ. В то же время, сравнение комплексов ВЗ-Н4, образованных гистонами тимуса теленка, гороха и дрожжей указывает на то, что содержание X -спиральных З^частков одинаково во всех трех комплексах /133/. Позднее Ли и соавторы, анализируя гистоновые комплексы, выделенные различными способами из мононуклеосом S.cerevisiae ^;, методом гель-фильтрации, показали, что при рН 5,0 и ионной силе 0,1 когшлекс НЗ-Н4 из гистонов дрожжей является гораздо более стабильным, чем такие же комплексы, образованные гистонами тимуса теленка или эритроцитов цыпленка. Авторы этой работы считают, что, по-видимому, у дрожжей когшлекс гистонов НЗ-Н4 является самым прочным, и это, возможно, объясняется особенностями первичной структуры гистона НЗ /115/.

"Умеренно богатые лизином" гистоны В2А иН2В составляют более вариабельную группу, чем рассмотренные выше гистоны НЗ и Н4. Об этом первоначально свидетельствовали результаты электро-форетического исследования гистонов Н2А и Н2В из представителей разных классов позвоночных /163/ и беспозвоночных животных /3/, растений /201/ и низших эукариотических организмов /5,83,102,

133,199,212/.

Результаты исследований первичной структуры гистонов Н2А /57,79,80,91,136/ и В2В подтвердили предположения о большей вариабельности строения их молекул по сравнению с "аргинин богатыми" гистонами. Гистоны Н2А и Н2В из разных организмов образуют ме}кду собой прочные комплексы как в растворе, так и в хроматине, внося вклад в формирование гистонового ядра нуклеосомы /63,100,115,133,139,202/.

Исследование первичной структуры гистонов углубляет современные представления о гистон-гистоновых и других взаимодействиях гистонов в составе хроматина и способствует выяснению вопроса о том, какие области молекул этих белков необходимы для форілирования определенной структуры нуклеосомы* Наибольшее внимание исследователей в этом отношении привлекал гистон Н2В как самый вариабельный среди кор-гистонов.

В настоящее время известны 15 полных и II частичных аминокислотных последовательностей гистонов Н2В из различных организмов: в 1972 году Иван и соавторы определили первичную структуру гистона Н2В из тимуса теленка /101/, затем были опубликованы первичные структуры Н2В из семенников форели salmo tratta /109/, спермы морского ежа Parechinus angulosus /207,208,209/, эмбрионов морского ежа Parechinus angulosus /42/, гонад моллюска Patella granatina /223/, насекомого Drosophila melano-gaster /72/^ тимуса крысы /135/, селезенки человека /158/, морской звезды Marthasterias glacialis /211/.

Установлены частичные аминокислотные последовательности гистонов Н2В из семенников форели Salmo gairdnerii /48/, рептилии Crocodilus niloticus /222/, амфибии Xenopus laevis

/222/, проростков гороха /91/, двух субфракций гистона Н2В из спермы морского ежа Psammechinus miliaria /210/. Обнаружены, но недостаточно охарактеризованы структурные варианты Н2В из зародышей пшеницы /226/.

Из сравнительного анализа первичных структур гистонов В2В высших эукариотических организмов, стоящих на разных уровнях организации, вытекают следующие выводы.

Во-первых, основные аминокислоты расположены неравномерно по длине молекулы; они концентрируются в N-концевой части, сообщая ей значительный положительный заряд. Наиболее основным является район, соответствующий участку 27-34 у Н2В тимуса теленка, который представляет собой блок из 6-7 основных аминокислот, ^-концевая треть молекулы Н2В обогащена также остатками аланина, пролина, серина, причем две последние аминокислоты не способствуют образованию оС ^-спиральной конформации. Центральная и С-концевая области молекулы содержат основную массу гидрофобных и ароматических аминокислот. Неравномерное распределение аминокислот согласуется с предетавлениями о разделении функций по длине молекулы гистона Б2В: ^-концевая область может наиболее эффективно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группировкагли ДНК', а остальные 2/3 молекулы - участвовать в белок-белковых взаимодействиях в составе хроматина /38,39,52,70,73,137,144,147/.

Во-вторых, в отличие от гистонов НЗ и Н4, демонстрирующих консервативность первичной структуры по всей длине молекулы, гистон Н2В имеет эволюционно-вариабельный по длине и аминокислотной последовательности ж-концевой участок молекулы и необычайно консервативные центральную и С-концевую области.

В-третьих, если филогенетически близкие организмы имеют сходную аминокислотную последовательность гистонов Н2В даже в N -концевом участке, то при сравнении первичных структур Н2В из организмов, стоящих на более низкой ступени развития, с гисто-ном Б2В из тимуса теленка не удается проследить аналогию в строении ^N -концевых областей молекул. Например, аминокислотная последовательность трех структурных вариантов гистона Н2В из спермы морского ежа Parechinus angulosus /207,208,209/ в значительной степени уникальна. Яркой отличительной чертой этих белков являются повторяющиеся пентапептиды в N -концевой области. 8а их счет данная область молекулы Б2В морских ежей удлинена на 19-23 аминокислоты по сравнению с аналогичной областью Н2В тимуса теленка. Повторяющиеся пентапептиды образуют участок, обогащенный остатками лизина и глицина. Наличие таких структур, вероятно, связано с особенностями функционирования генеративных клеток /209/. Центральная и С-концевая области вариантов Н2В p.anguiosus так же, как аналогичные участки молекул данного гистона из других изученных организмов, очень сходны по первичной структуре /226/.

Ван 'осольт и соавторы /226/ считают, что вариабельноетьи -концевой части молекул гистонов Н2В может являться выражением увеличивающейся в ходе эволюции сложности строения хроматижшго комплекса (филогенетическая гистоновая программа) и/или отражением дифференциальной генетической активности клеток или тканей в течение жизненного цикла одного организма на определенном уровне его развития (онтогенетическая гистоновая программа).

В 1980-83 годах была опубликована полная аминокислотная последовательность гистонов из 2 представителей низших эукарио-

тов - дрожжей S.cerevisiae /227/ и простейшего - тетрахимены /157/. Этими работами сведения о первичной структуре гистонов Б2В у низших эукариотических организмов к настоящему времени исчерпываются.

Следует отметить, что проведенные исследования доказывают универсальность общего плана строения молекулы Н2В, присущего как высшим, так и низшим эукариотам (табл. 4).

В N -концевой области, обогащенной основными аминокислотами и пролином, не наблюдается сходства первичных структур ни между гистонами Б2В обоих микроорганизмов, ни каждого из них с Н2В тимуса теленка. Кроме того, у s.cerevisiae были обнаружены два клона, кодирующие две субфраквди Н2В, отличающиеся между собой четырьмя аїлинокислотньми заменами в N-концевой части молекулы /227/.

В гидрофобном С-концевом участке аминокислотные последовательности гистонов Б2В дрожжей, тетрахимены и тимуса теленка гомологичны. Н2В дрожжей отличается от Н2В тимуса теленка 9 аминокислотными заменами, из которых одна неконсервативна: гис-тидин-82 заменен на аланин. Вставок и делений не обнаружено. Общее количество аминокислот в белке - 130.

В гистоне Н2В тетрахимены выявлено большее количество аминокислотных замен, чем в Н2В дрогшей. Он отличается от Б2В из тимуса теленка 26 аминокислотными заменами, три из них неконсервативны; имеется четыре вставки и одна делеция /157/. Общее количество аминокислот в белке - 119, это самая короткая из известных последовательностей В2В. Напомним, что и гистон Н4 тет-рахимены отличается от Н4 тимуса теленка большим количеством замен аминокислот /82/, чем Н4 дрожжей и нейроспоры /244/. Это,

ТАБЛИЦА 4. Аминокислотная последовательность гистона Н2В из некоторых организмов

1 X -Pro——~Lys-Ьуs --.Ala-Pro-Ala-Ala——-Ala-Glu-Lys-Lys- Yal Lys-Lys-Ala-

2.' ИІЦ-Pro-Glu-————Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-Pro-Ala-Pro-Lys-Lys Gly-Ser-Lys-Lys-Ala-

3^ Ser-Ala-Lyg-Al a-Glu-Ly s-Ly s-Pr o-Ala-Ser-Ly s-Ala-Pro-Ala-Glu-Ly s-Lys-Pro-Ala-Ala-Ly s-Ly s-Thr-

5р.¹ Ser Ala

1_fPro-Thr Thr-Glu Lys-Lys-Asn— Lys-Lys—--Lys-Arg-Ser- —Glu-Thr-Phe-Ala-Ile-

2, Val-Thr-Ly s-Ala-Gln Ly s-Ly s-Asp-Gly-Ly s-Ly s-Arg-Ly s-Ar g-S er-Ar g-Ly s-Gl u-Ser-Ty r-S er-Val-

5и» Ser-Thr-Ser-Ihr-Asp-Gly-Ly s-Ly s-Arg-Ser-Lys—~ —— Ala-Arg-Lys-Glu-Thr-Tyr-Ser-Ser-

3₂i Val Val

1_tTyr-Ile-Phe-Lys-Val-Leu-Lys-Gln-Val-His-Pro-Asp-7al-Gly-Ile-Ser-Lys-Lys-Ala-Met-Asn-Ile-Met- . ,**. 2»Tyr-7al-Tyr-Lys-Val-Leu-Lys-Gln-Yal-His-Pro-Asp-Thr-Gly-Ile-Ser-Ser-Lys-Ala-Met-Gly-Ile-Met- ^w5.Tyr-Ile-Tyr-Lys-Val-Leu-Lys-Gln-Thr-His-Pro-Asp-Thr-Gly-Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Met-Ser-Ile-Leu- I

1-^Asn-Ser-Phe-Ile-Asn-Asp-Ser-Phe-Glu-Arg-Ile-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Lys-Leu-Yal-Arg-Phe-Asn-Lys-2,Asn-Ser-Phe-Val-Asn-Asp-Ile-Phe-Glu-Arg-Ile-Ala-Gly-Glu-Ala-Ser-Arg-Leu-Ala-His-Tyr-Asn-Lys-3 Asn-Ser-Phe-Yal-Asn-Asp-Ile-Phe-Gl u-Arg-Ile-Ala-Thr-Gl u-Al a-Ser-Ly s-Le u-Ala-Al a-Ty r-Asn-Ly s-

1 Arg-Arg-Thr-L e u-Ser-S er Ar g-Gl u-Val-Gln-Thr-Al a-Val-Ly s-Le u-L e u-Le u-Pr o-Gly-Gl u-L e u-Al a-

2, Ar g-—~S er-Thr-Il e-Thr-S er-Arg-Gl u-Ile-Gln-Thr-Al a-Val-Ar g-Le u-L e u-L e u-Pr o-Gly-Gl u-Le^ -Al a-
3.Lys —Ser-Thr-Ile-Ser-Ala-Arg-Glu-Ile-Gln-Thr-Ala-Val-Arg-Leu-Leu-Leu-Pro-Gly-Glu-Leu-Ala-

1,Arg-His-Ala-Ile-Ser-Glu-Gly-Thr-Lys-Ala-Yal-Thr-Lys-Phe-Ser-Ser-Ser-G?hr-Asn-0H

2_fLys-His-Ala-Val-Ser-Glu-Gly-Thr-Lys-Ala-Yal-0}hr-Lys-Tyr-Thr-Ser-Ser-Lys-OH

J.Lys-His-Ala-Val-Ser-Glu-Gly-Thr-Arg-Ala-Val-Thr-Lys-Tyr-Ser-Ser-Ser-Thr-Glii-Ala-OH

Примечание: I_#-ffetrahymena /157/;2.-тимус теленка/І0І/;3_І и 3₂- субфракции I и 2 H2B из

S.cerevisiae /227/; ( —- ) - совмещение последов.для выявления максимальной гомологии.

вероятно, свидетельствует о ранней дивергенции ветви простейшее и находит свое отражение в структуре их гистонов.

При сравнении между собой в эволюционном аспекте аминокислотных последовательностей С-концевых областей молекул Б2В дрожжей (грибы) и тетрахимены (простейшие) с Н2В проростков гороха (представитель царства растений) не удается обнаружить большей гомологии, чем при сравнении каждого из них с гистонами Б2В тимуса теленка (представитель царства животных).

Таким образом, как следует из данных, представленных в таблице 4, центральная и С-концевая области гистона В2В содержат большое количество гидрофобных остатков и являются эволю-ционно консервативными по первичной структуре также и у представителей низших эукариотов. Отличия в этих 2/3 молекулы у Н2В из разных организмов характеризуются наличием консервативных точечных мутации. Недавно было показано, что гистон Н2В дрожжей, имеющий большие делеции в N-концевой области, может функционировать in vivo /228/. Это наблюдение является прямым доказательством важности функции, выполняемой центральными и С-концевыми частями молекулы и объяснением высокой эволюционной консервативности этих областей. От блока основных аминокислот до N-концевой аминокислоты распространяется вариабельный участок молекулы, аналогию с N-концевой областью Б2В тимуса теленка для низших эукариотических организмов провести довольно трудно.

"Лизин-богатые" тистоны из низших эукариотов изучены очень мало, что связано с трудностями выделения гистонов из данных объектов. Характеристика этого класса гистонов, как правило, ограничивается данными электрофоретического анализа и, реже,

аминокислотным составом.

Гистон, подобный HI высших эукариотов, обнаружен не у всех изученных в этом отношении низших эукариотов /43,93,104,133, 182/. Возможно, это объясняется несовершенством применявшихся в данных исследованиях методов, которые не позволяли в достаточной степени ингибировать действие эндогенных протеиназ или включали обработки, которые, по-видимому, разрушали непрочную связь HI с хроматином. Исключения составляют работы, проведенные на дрожжах /43-,53,133,199,217/. Возможно, отсутствие гисто-на HI у них является истинным. Так, сообщалось, что Н1-подобный гистон s.cerevisiae оказался митохондриальным белком /53/. Высказывается предположение о том, что в отсутствие HI гистоны нуклеосомного ядра сами могут организовывать ДНК в структуру с нуклеосомным повтором в 168 п.о. /172/. Идея о таком исключительном свойстве хроматина дрожжей согласуется с тем фактом, что величина нуклеосомного повтора ДЖ у этих организмов мала и составляет приблизительно 165 п.о. /217/. Однако, Пастинком и соавторами /164/ сообщалось о присутствии НІ в другом виде дрожжей - s.carlsbergensis . Большинство исследователей считает вопрос о наличии гистона НІ у дрожжей открытым /43,199,212,215, 217/.

Гистон HI обнаружен в близком к дрожжам организме - аско-мицете KVcrassa ^!, его аминокислотный состав свидетельствует о меньшей основности этого белка по сравнению с HI из тимуса кролика /83/. HI-подобный гистон обнаружен также у гриба - зиго-мицета Phycomyces "biakesleeanus /59/, трех видов миксомицетов /56,182/, водоросли Euglena gracilis /131/, простейших Tetra-hymena pyriformis /102/, Stylonychia myiilis /118/, Oxy-

tricha sp. /49/, Astasia longa /17/. Вопрос о наличии гистона HI в хроматине Охуtricha , однако, является спорным. В недавних исследованиях Батлера и др. /46/, проведенных на макронуклеусе Oxytricha nova , гистон НІ не был обнаружен.

Суммируя материал, изложенный в данном разделе, обратим еще раз внимание на то, что для гистонов высших эукариотов характерно наличие и - и С-концевых доменов в молекулах, которые отличаются друг от друга как по набору аминокислот (основные аминокислоты концентрируются в ^-концевых областях, а гидрофобные - в центральных и С-концевых областях)^:, так и по степени эволюционной консервативности. Анализ первичных структур гистонов из низших эукариотов свидетельствует о том, что общий план строения молекул гистонов одинаков для высших и примитивных эукариотических организмов. Однако аминокислотные последовательности гистонов низших эукариотов отличаются в гораздо большей степени, а наличие гистона HI, взаимодействующего, как предполагают, с межнуклеосомной. ДЖ /18,26,155/, установлено не для всех изученных представителей. Сведения о первичной структуре гистонов из низших эукариотов ограничиваются, в основном, работами, проведенными на дрожжах и простейшем Tetrahymena Изучение строения гистонов других примитивных эукариотических организмов не только расширило бы представления об универсальности субъединичной струкауры хроматина, но и позволило бы установить, какая группа низших эукариотов - водоросли, миксоми-цеты, простейшие и грибы - проявляет большее сходство в строении гистонов с высшими животными и растениями и в какой степени отличаются гистоны у представителей разных групп. Нерешенным остается и вопрос о наличии гистона НІ у низших эукариотов.

Накопленные к настоящему времени данные о строении гистонов низших эукариотов ставят еще одну задачу - выяснение связи между особенностями структуры гистонов и особенностями организации и функционирования хроматина у этой группы организмов.

1.2.2. Нуклеосомная организация хроматина низших эукариотов

Поскольку основой для изучения функционирования хроматина является анализ его структурной организации, установление факта высокой консервативности гистонов стимулировало появление ряда работ по изучению структуры хроматина низших эукариотов. Цель их заключалась в том, чтобы доказать или опровергнуть существование нуклеосомной организации хроматина у примитивных эукариотических организмов, выявить связь между особенностями структуры гистонов и особенностями их функционирования в составе хроматина и проследить, как изменялось в ходе эволюции строение хроматинового комплекса. Однако работы по изучению структуры хроматина низших эукариотов сопряжены со значительными трудностями его выделения, которые связаны с малыми размерами генома и, следовательно, низким содержавшем ДНК, а также высокой активностью клеточных протеаз и нуклеаз /3,83,182,199/.

В последнее время субъединичная структура хроматина была

установлена для представителей всех групп низших эукариотов:

водорослей - Porphyridium aerugineum /23/, Olisthodiscus

luteus /192/, Euglena gracilis /13I/; простейших - Tetra-

hymena pyriformis /168/, Paramecium aurelia /168/, stylo-

nychia mytills /119,120/, Oxytricha nova /46/,

Thrypano-

some cruzi/184/; миксомщетов - Physarum polycephalum /103, 204/, Dictyostelium discoideum /21,240/ И грибов - плеснево-

го гриба Neurospora. crassa /154/, несовершенного гриба As-pergilus nidulans /145/, пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae /217/, оомицета Achlya ambisexualis /193/.

1.2.2.1. Вар_иабельность_^даны_н^ле ос омного_повтоа_,ЩЖ

О нуклеосомной организации хроматина низших эукариотичес-ких организмов свидетельствует накопление специфических фрагментов ДНК при обработке хроматина шшрококковой нуклеазой или ДНКазой I. При определении длины нуклеосомного повтора ДНК было обнаружено, что значение её может варьировать в широких пределах для различных представителей низших эукариотов: от 154 п. о. в хроматине несовершенного гриба Aspergillus nidulans /145/ до 225 п.о. у фитофлагеллята Euglena gracilis /ІЗІ/ и 230 п.о. у Tetrahymena pyriformis в стационарной фазе роста /168/. Из таблицы 5 следует, однако, что для большинства представителей низших эукариотических организмов длина нуклеосомного повтора ДНК существенно меньше, чем в хроматине высших эукариотов. Так, меньшая длина нуклеосомного повтора ДНК, вероятно, является характерной для хроматина грибов.

Некоторые авторы склонны считать, что нуклеосомная организация хроматина каждой большой группы низших эукариотов характеризуется специфическим,строго определенным значением длины нуклеосомного повтора ДЖ, которое является высококонсервативной величиной внутри группы и могло бы служить,в связи с этим, удобным критерием в области филогении протистов /23/. Однако для проверки этого положения требуются данные по изучению структуры хроматина многих других представителей низших эукариотических организмов.

ТАБЛИЦА 5

Длина нуклеосомного повтора ДНК в хроматине низших эукариотов.

Объект

Среднее значение длины нуклеосомного повтора ДНК в парах основании

Литературный источник

Водоросли Porphyridium aerugineum

Olysthodiscus luteus

Euglena gracilis

/23/

/192/ /131/

Простейшие Tetrahymena pyriformis

Paramecium aurelia

Stylonychia mytilus

207+Ю(лог.фаза роста) /168/ 230+10(стацион.фаза роста)

153+7 (лог.фаза роста) /168/ 178+6 (стацион.фаза роста)

202 (диплоидный микронуклеус)

217(развивающийся макронук- /119/ леус)

22 0(веге тативныи макронуклеус)

При определении длины фрагмента ДНК, прочно ассоциированного с октамером кор-гистонов, было показано, что эта величина одинакова для хроматина животных, растений и низших эукариотов и составляет 146 п.о. Другими словами, ДНК коровых частиц размером приблизительно 140 п.о. становится основным продуктом, который накапливается при переваривании хроматина микрококковой нуклеазои, независимо от источника его получения. Таким образом, коровая частица с набором гистонов Н4, НЗ, Б2А и Н2В и с молекулой ДНК длиной в 146 пар оснований является общим элементом для всех нуклеосом, фундаментальным звеном в структуре хроматина, начиная с примитивных эукариотических организмов. Следовательно, вариабельность длины нуклеосомного повтора ДНК может определяться вариабельностью межкоровой (линкерной, спей-серной) ДБК. Интересно отметить, однако, что фрагменты ДНК длиной 140 п.о, не накапливались при обработке нуклеазои хроматина из простейшего ^brypanosome cruzi /184/, они быстро деградировали дальше до фрагментов в НО, 75, 60 и 50 п.о. Существование подобного "лабильного" кора сообщалось и для хроматина Physarum polycephalum _/1_Ш _j204/# причины этого явления не понятны, возможно, "лабильность" кор-частиц является свойством объекта или результатом высокой активности внутриклеточных нук-леаз или отражает тот факт, что взаимодействия гистонов между собой и с нуклеосомной ДНК ослаблены в хроматине этих организмов /184/.

Поскольку предполагается, что с линкерной ДНК связываются гистон . HI и некоторые негистоновые белки /18,26,155,176,225/, многие авторы считают, что тленно эти белки определяют вариабельность длины нуклеосомного повтора ДНК. Они объясняют мень-

шуто его длину по сравнению с высшими эукариотами для хроматина большинства изученных низших эукариотических оргашзмов меньшей основностью гистона НІ или полным его отсутствием /21,119,145, 154,217/. Так, Моррис /145/ предполагает, что длина линкерной ДНК определяется количеством основных аминокислот и размером НІ. К такому же выводу пришел в своей работе Нолл /154/, который сравнивал число основных агжнокислотных остатков в гистонах для Neurospora crassa и тимуса теленка; их соотношение составляло 238/284 = 0,84. Такое же соотношение имеют длины нукле-осомных повторов ДНК в хроматине этих организмов: 170/200 = 0,85. Важно, что различие в общем количестве основных аминокислот в гистонах N.'crassa и тимуса теленка связано, главным образом, с меньшим числом остатков лизина и аргинина в гистоне HI гриба.

Во многих работах, проведенных на высших эукариотах, также была обнаружена корреляция между длиной линкерного участка ДНК и типом связанного с ним белка. Например, Вайнтрауб /233/ показал, что в процессе созревания эритроцитов происходит увеличение длины нуклеосомного повтора со 190 до 212 пар оснований,и это увеличение коррелирует с уменьшением содеркания гистона HI и заменой его на более основной гистон Н5.

Возможно, малая длина линкерной ДНК в хроматине грибов действительно связана с отсутствием либо низкой основностью гистона HI. Однако, по аминокислотному составу не только HI, но и другие гистоны изученных грибов отличаются от аналогичных гистонов тимуса теленка. Особенности структуры этих белков тоже могут влиять на величину нуклеосомного повтора ДНК. Так, в настоящее время имеются данные, которые позволяют ряду авторов

полагать, что и -концевой участок гистона Н2В может контролировать суперепирализацию хроматина и длину линкерной ДНК. Заленская и соавторы /246/ показали, что у двух представителей иглокожих - морского ежа и морской звезды - повтор ДБК хроматина из спермы значительно отличается от 200 п.о. и равен, соответственно, 237+5 п.о. и 224+6 п.о. Состав нуклеосом этих двух организмов ничем существенно не отличается, за исключением гис-тонов Н2В: в сперме морского ежа присутствует гистон Н2В с удлиненным N -концевыгл участком за счет повторяющихся пентапепти-дов. В работе Спадафррыи др. /200/ при анализе изменения величины нуклеосомного повтора во время эмбриогенеза морского ежа авторы предположили, что эта величина может зависеть от присутствия вариантов гистонов Н2А и Н2В, заменяющих друг друга на разных стадиях развития. Кэри и др. /52/ на основании исследования методом ШР нуклеосомных частиц, выделенных из хроматина тимуса теленка, показали, что основные участки гистонов Н2А и Н2В (для последнего это 1-30 и 105-125 аминокислотные остатки) имеют места связывания с межнуклеосомной ДНК. Различные варианты Н2В могут влиять, таким образом, на величину нуклеосомного повтора ДНК-, наряду с гистоном HI.

Многие авторы связывают изменение величины нуклеосомного

е повтора со скоростью клеточного деления, стадий клеточного цикла, транскрипционной активностью, фосфорилированием гистона HI и ацетилированием гистонов НЗ и Н4. Так, увеличение длины нуклеосомного повтора ДНК на 25 п.о. у Paramecium aurelia _и на 23 п.о. у Tetrahymena pyriformis /168/ при переходе этих организмов из логарифмической фазы роста в стационарную объясняется изменениями гистона HI, которые, возможно, происходят на

разных стадиях развития (фосфорилирование HI или изменение числа молекул HI, способных взаимодействовать со спейсерной ДНК). Интересные результаты были получены при изучении структуры хроматина морских ежей в ходе эмбриогенеза /54,177,186/. Перед оплодотворением хроматин спермы морского ежа strongylocentrotus purpuratus имеет один из самых больших среди известных нукле-осомный повтор ДНК - 250 п.о. /186/. После того, как прошло оплодотворение, у двухклеточного эмбриона хроматин имеет нуклео-сомный повтор 189+2 п.о. /54/. Это самая малая величина из опубликованных для S.purpuratus _# хроматине восьмиклеточного эмбриона нуклеосомный повтор ДНК равен 201+2 п.о., и он увеличивается в дальнейшем по ходу развития. Результаты работ свидетельствуют о том, что увеличение количества ДНК при оплодотворении, т.е. при переходе от гаплоидного к диплоидному состоянию, сопровождается глубокими перестройками хроматина, связанными с укорочением размера нуклеосомной ДНК, и эти перестройки продолжаются на ранних стадиях эмбриогенеза. Полученные данные согласуются со следующими предположениями: (а) Большая величина нук-леосомного повтора ДНК характерна для сильно дифференцированных клеток, (б) Малая его величина характерна для клеток, более активных в клеточном делении и в транскрипции.

Согласно этим предположениям, меньшая длина нуклеосомного повтора ДНК в хроматине грибов объясняется тем, что значительная часть их генома активно транскрибируется. Так, у пекарских дрожжей S.cerevisiae _в логарифмической фазе роста транскрибируется 40-60% хроматина /123,124/. Однако транскрипционно неактивный микронуклеус Stylonychia /119/, Tetrahymena /^І68/ ^иOxytricha /46/ _шеет более короткий нуклеосомный повтор, чем

активный макронуклеус (см. табл.5). Авторы этих работ считают, что так как в регуляцию активности генов должно быть вовлечено много факторов, изменения в длине нуклеосомного повтора ДНК не обязательно приведут к сильному изменению транскрипционной активности хроматина.

Накопленных к настоящему времени данных недостаточно для однозначного объяснения того факта, что в хроматине разных организмов, одного организма на разных стадиях его развития или разных тканей одного организма длина нуклеосомного повтора ДНК различна. Возможно, что вариабельность его длины определяет не один, а совокупность факторов, оказывающих влияние на взаимное расположение нуклеосом и способ их укладки в структуры более высокого порядка.

1.2.2.2. Некоторые особенности стр_укту_ры хроматина дрожжей

Наиболее хорошо изученным представителем низших эукариотов, а именно, грибов, являются пекарские дрожки Saccharomjices . Они являются классическим объектом исследований биологов, для которого доступны методы генетического и биохимического анализа. Высокая транскрипционная активность генома дрожжей делает этот организм особенно интересным для изучения структуры и функционирования хроматина.

При детальном анализе продуктов переваривания ДНКазой I хроматина дрожжей были выявлены некоторые особенности, отличающие дрожжи от высших эукариотов. Во-первых, для высших эукариотов является признанным тот факт, что активные участки хроматина проявляют повышенную чувствительность к ДБКазе I. Это впервые было показано Вайнтраубом и Гроудином /232/ для активно транс-

крибируемого глобинового гена в ядрах эритроцитов цыпленка и подтверждено результатами многих других работ /96,175,234/. В 1979 г. Лор и Херефорд /124/ установили, что отличительная черта активного хроматина - его повышенная чувствительность к ДНКазе I-не применима для дрожжей. В логарифмической фазе роста 40$ их генома транскрибируется /123/. Оказалось, что в случае дрожжей не происходит преимущественного гидролиза ферментом транскрибируемых участков хроматина. Транскрибируемый и тотальный хроматин проявляют одинаковую чувствительность к ДНКазе 1, которая выше у клеток в логарифмической фазе роста и ниже у клеток в стационарной фазе /123/. Таким образом, в отличие от мет&зоа, весь хроматин дрожжей ведет себя как активный хроматин, судя по критерию повышенной чувствительности к ДНКазе I. Транскрибируемые и нетранскрибируемые районы хроматина, вероятно, находятся в одинаковом состоянии, и распознавание этих районов идет по каким-то более тонким критериям, чем степень доступности действию ДЕЖазы I /124/.

Вторая особенность строения хроматина дрожжей связана с организацией линкерного участка ДНК. Как показал в своем исследовании Лор /125/, при обработке хроматина дрожжей ДНКазой I 10-тинуклеотидная периодичность продуктов гидролиза ДНК распространяется вплоть до 300 нуклеотидов. Образуется два набора фрагментов ДНК, которые при электрофоретическом разделении дают две серии регулярно расположенных полос, смещенных относительно друг друга на 5 оснований. Принципиальное различие между двумя сериями фрагментов заключается в присутствии линкерной ДНК во фрагментах верхней серии полос. Согласно расчётам Лора, длина линкерного участка ДНК подчиняется формуле (1СЫ-5) п.о., где

m = 0,1,2,... /125/.

Наличие "прибавки" в спейсерной ДНК длиной 5 п.о. отличает хроматин дрожжей от хроматина высших эукариотов и накладывает строгое ограничение на взаимное расположение соседних кор-час-тиц при определенной ориентации ДНК относительно гистонового октамера (большая бороздка обращена внутрь или наружу в месте "вхождения" ДЖ в нуклеосом^. Предполагают, что ДНК в нуклеосо-мн охватывает снаружи октшлер кор-гистонов, образуя левую супер-спираль. Кор-частицы, отделенные спейсерной ДНК длиной в (I0^m + 5) п.о., не могут располагаться относительно друг друга по типу стопки монет, одна на вершине другой, как это предполагается для хроматина высших эукариотов /96/, так как в этом случае ДБК сменит левую суперспираль на правую при переходе с одной кор-частицы на другую. Чтобы в соседних нуклеосомах ДНК находилась в форме левой суперспирали, кор-частицы должны располагаться по типу "бок-о-бок" (рис. I). Такая модель допускает взаимодействие ДНК одной кор-частицы с гистонами соседних кор-частиц и делает структурной повторяющейся единицей не мононуклеосомъг,а ди-сомы. Элементы "дальних" взаимодействий, вероятно, необходимы для обеспечения стабильности структур) более высокого порядка.

Рис. I. Схематическое изображение возможного взаимного расположения нуклеосом, когда длина линкерной ДНК согласуется с формулой (I0m+5) пар оснований. Для простоты представлена структура с линкерным участком ДНК в 5 пар оснований.

Исследование действия нуклеаз на хроматин выявляет особенности его структуры, но не объясняет причин их возникновения. Важные результаты, по-видимому, могут дать исследования структуры нуклеосом как повторяющихся единиц хроматина. Однако в большинстве работ по низшим эукариотам авторы ограничивались анализом продуктов переваривания хроматина микрококковой нуклеаз ой путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и установлением наличия фракции, седиментирущей с коэффициентом седиментации II-II,5s , которая соответствует фракции мононук-леосом /21,149,205/.

В 1982 г. Ли и соавт. /115/ выделили препарат мононуклео-сом из дрожжей s.'cerevisiae и охарактеризовали его по химическому составу, а также методом кругового дихроизма и тепловой денатурации.

Хотя нуклеосомы дрожжей и высших эукариотов оказались сходны по белковому составу (присутствуют все гистоны, формирующие ядро нуклеосомы, - Н4, S3, Н2А и Н2В) и длине фрагментов ДНК, главный результат работы заключается в обнаружении двух существенных различий в физико-химических характеристиках нуклеосом дрожжей и высших эукариотов.

Во-первых, спектр кругового дихроизма мононуклеосом дрожжей характеризуется повышенной молярной эллиптичностью, а профиль их тепловой денатурации - тем, что основной структурный переход,связанный с плавлением половины всей ДНК, происходит при более низкой температуре по сравнению с мононуклеосомами тимуса теленка или эритроцитов цыпленка (где плавится около трети всей ДНК). Перечисленные параметры ближе к соответствующим параметрам свободной ДНК; из этого следует, что нуклеосомы дрожжей есть структура менее компактная, более "рыхлая", чем нуклеосомы

высших эукариотических организмов /115/.

Кроме того, было обнаружено, что нуклеосомы дрожжей гораздо менее стабильны в растворе с низкой ионной силой, о чем свидетельствовала диссоциация гистонов от ДНК. Они не могут быть реконструированы с помощью методов, применимых для нуклеосом тимуса теленка и эритроцитов цыпленка. На основании результатов реконструкции гибридных нуклеосом, содержащих гистоны Н2А,Н2В и НЗ тимуса теленка и гистон Н4 дрожжей, авторы приходят к выводу, что особенности первичной структуры Н4 дрожжей, по-видимому, не связаны с пониженной стабильностью мононуклеосом этого организма. Результаты гель-фильтрации выделенных из мононуклеосом гистоновых комплексов и последующий их электрофоретический анализ, а также более ранние данные Мардиана и Айзенберга по взаимодействию гистонов дрожжей в растворе /133/ - свидетельствуют о том, что с пониженной стабильностью нуклеосом дрожжей, вероятно, связаны особенности структуры гистона НЗ.

Несколько позднее Сцент-Дьёрди и Айзенберг /214/, применив разработанный ими метод высокоразрешающего электрофореза ДНІ для анализа растворимой и нерастворимой фракций хроматина дрожжей после его обработки микрококковой нуклеазой, показали, что тотальный хроматин дрожжей по ряду структурных характеристик, рассмотренных ниже, значительно отличается от тотального хроматина высших эукариотов и, очевидно, имеет конфигурацию, характерную для транскрипционно компетентных участков.

Во-первых, не весь хроматин дрожжей может быть солюбилизи-рован путем обработки его микрококковой нуклеазой; 30% ДНК остается в нерастворимой фракции. Электрофоретический анализ ДНК, выделенной из этой фракции, свидетельствует об отсутствии дис-

кретности в распределении продуктов гидролиза по длине геля. Известно, что под электронным микроскопом в хроматине дрожжей, для которого, как и для хроматина высших эукариотов, характерна "бусиничная" морфология, можно также обнаружить участки гладких фибрилл /172/. Наличие их связывают с высокой транскрипционной активностью данных областей хроматина /189/. Гладкие фибриллы, вероятно, не содержат нуклеосом, и при обработке их микрококковой нуклеазой не будут накапливаться фрагменты ДЕК с длиной, кратной нуклеосомному повтору. Подобные наблюдения были сделаны и для хроматина высших эукариотов. Так, в активно экспрессируе-мых клетках мыши 90% хроматина, кодирующего рибосомальные РНК, остается в нерастворимой фракции при обработке его микрококковой нуклеазой. При электрофретическом разделении фрагментов ДНК, выделенных из нерастворимой фракции,.также наблюдается недискретное, равномерное распределение ДЖ в геле. В клетках печени мыши, где уровень транскрипции низок, большая часть хроматина, кодирующего рибосомальные РНК, растворима, и при обработке

его тем же ферментом образуются фрагменты, которые дают типич- ,

^при ную "лестницу" полос электрофорезе ДНК /65/.

Таким образом, тотальный нерастворимый хроматин дрожжей может представлять собой активнотранскрибируемый хроматин. Вероятно, он связан в нерастворимой форме с ядерным матриксом и не может быть , в связи с этим, солюбилизирован /214/.

При анализе растворимой фракции хроматина дрожжей были также выявлены необычные черты.

Постоянство соотношения ДНК в составе ди-, три- и тетранук-леосом в ходе гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой свидетельствует о том, что в хроматине дрожжей нуклеосомы располагаются тандемами, группами. Обнаруженная относительная устойчи-

вость динуклеосом к ферменту, возможно, связана с другим способом взаимного расположения нуклеосом в хроматине дрожжей ("бок-о-бок", или "конец-в-конец"), о чем говорилось выше. Другая,чем у большинства высших эукариотов, организация линкера делает повторяющейся единицей в структуре хроматина дрожжей не мононук-леосомы, а дисомы.

Важным представляется тот факт, что в процессе обработки хроматина дрожжей микрококковой нуклеазой не происходит накопления мононуклеосом; интенсивность полосы, соответствующей ДНК длиной 146 и.о., при электрофорезе продуктов гидролиза, значительно меньше, чем интенсивность других полос. В исследованиях Ли и др. /115/ были обнаружены меньшая стабильность и меньшая компактность мононуклеосом дрожжей. Представляется вероятным, что в изолированных мононуклеосомах дрожжей взаимодействия гис-тонов с ДНК чрезвычайно слабы, особенно по концам нуклеосомной ДНК, а гистон-гистоновые взаимодействия изменены таким образом, что делают определенные места ДНК внутри кор-частиц чувствительными к действию нуклеазы. Следует отметить, что при обработке этим ферментом некоторых активных генов высших эукариотов (например, гена овальбумина цыпленка или гена рибосомальной РНК печени крысы) также не происходит накопления мононуклеосом /25, 65/. Сопоставление этих данных позволяет предположить, что структура растворимой фракции хроматина дрожжей соответствует конаж-

выашх гурации хроматина эукариотов в участках тех генов, которые шлеют "потенцию" транскрибироваться с большими скоростями.

Данные Сцент-Дьёрди и Айзенберга по анализу нерастворимой фракции хроматина дрожжей согласуются с предположением о том, что активно транскрибируемые участки хроматина не шлеют нуклео-

сомную организацию. С друг.ой стороны, существует множество работ, в которых было показано, что как повторяющиеся гены, так и гены с уникальной последовательностью сохраняют нуклеосомную организацию в активно экспрессируемом состоянии /81,112,175, 232/. Ряд исследователей считает, что при этом увеличивается их чувствительность не только к ДНКазе I, но и к микрококковой нук-леазе. Так, в работах Ривса было показано, что чувствительность активно транскрибируемых рибосомальных генов у Xenopus laevis к микрококковой нуклеазе зависит от скоростей, с которыми эти гены транскрибируются /173,174/. Выводы Ривса были подтверждены в работах, проведенных на рибосомальных генах Physarum /104, 169/, Tetrahymena /85,160/ и Dictyostelium /150/, в которых была обнаружена повышенная чувствительность этих генов к ферменту в активно транскрибируемом состоянии. Авторы данных исследований считают, что нуклеосомы активных генов представляют собой динамичные структуры, способные претерпевать обратимые переходы, которые приводят к изменению чувствительности генов к микрококковой нуклеазе. Повышенная чувствительность к ферменту, возможно, связана с тем, что нуклеосомы активных генов имеют более открытую или более вытянутую конформацию по сравнению с нуклеосомами неактивных генов. Прайер /169/ предложил динамическую модель для структурных переходов нуклеосом, согласно которой "разворачивание" компактных неактивных нуклеосом в "открытую" активную форму (в "лекеосому") происходит при участии специфических негистоновых белков. Была также показана повышенная чувствительность к микрококковой нуклеазе высокоактивного в транскрипции овальбуминового гена, имеющего уникальную последовательность /29/.

Лор /126/, сравнивая нуклеосомы транскрибируемых участков

и тотального хроматина дрожжей, установил, что структурно они очень похожи, что говорило о сохранении нуклеосомной организации активных районов хроматина. Поскольку по критерию повышенной чувствительности ДНКазе I весь геном дрожжей ведет себя как активный хроматин, Лор предположил, что, возможно, ДЖ в составе нуклеосом дрожжей находится в состоянии, "подготовленном" для транскрипции, как если бы хроматин уже претерпел обратимый структурный переход.

В более детальном исследовании Лора, посвященном изучению структуры хроматина активно экспрессируемого уникального гена галактокиназы у дрожжей /127/, было показано, что экспрессия гена приводит к повышению чувствительности кодирующих областей к микрококковой нуклеазе. Это сопровождается расширением полос на неденатурирующих гелях при электрофорезе продуктов гидролиза и увеличением количества полос ДЖ, располагающихся между основными пиками и дающими на денатурирующих гелях регулярную "лестницу" полос. Автор делает заключение, что наиболее простое, и естественное объяснение результатов сводится к тому, что при экспрессии гена галактокиназы нуклеосомы претерпевают обратимые конформационные переходы. При этом происходит увеличение доступности ДЖ внутри коровых частиц действию микрококковой нуклеа-зы, возможно, вследствие разворачивания или раскрытия нуклеосом /127/.

В целом', с проблемой активного хроматина связано много нерешенных вопросов, и эта проблема как одна из наиболее актуальных интенсивно изучается /15,51,175,187,234/.

Подробные исследования структуры хроматина были проведены лишь на одном представителе грибов - дрожжах Saccharomyces

.- 63 -cerevisiae . Поэтому остается неясным, являются ли обнаруженные особенности характерными только для данного организма - или они присущи всем грибам, а возможно, и всем низшим эукариотам. Дальнейшие исследования должны также решить, связанн ли особенности в структуре хроматина дрожжей с тем, что они стоят на более низкой ступени эволюционного развития, чем высшие животные и растения, или/и они отражают высоё уровень транскрипционной активности генома этого организма.

-Ъ4 -

і.з.краткие вывода и постановка эксштттАлыш задач

К настоящему времени нуклеосомная организация хроматина доказана для всех эукариотических организмов. В то же время, основные сведения о структуре нуклеосом, в частности, о роли различных доменов гистонов в поддержании их компактности, получены при изучении ограниченного числа объектов - хроматина из эритроцитов цыпленка, печени крысы. По-видимому, углубление наших знаний в этой области связано с исследованием особенностей структуры и функционирования хроматина у большего числа организмов, тканей, одного организма на разных стадиях развития и т.д.

Изучение первичной структуры гистонов низших эукариотов показало, что они имеют тот же общий план строения молекул, что і внсше эукариош, но отличаются гораздо большим количеством аминокислотных замен. На примере дрожжей Saccharomyces cerevi-siae было установлено, что локальные изменения во взаимодействии гистонов и ДНК в хроматине данного организма приводят к понижению компактности мононуклеосом, что было выявлено физико-химическими методами, повышению доступности некоторых участков внутри кор-частиц действию микрококковой нуклеазы; они не могут быть реконструированы с помощью методов, применимых для нуклеосом из высших эукариотов и т.д. /115, 214/. Однако остается неясным, являются ли обнаруженные особенности в структуре хроматина характерными только для дрожжей - или они присуши всем грибам, а возможно, и всем низшим эукариотам.

Хотя вопрос о роли и- и С-концевых доменов гистонов в поддержании структуры ДЦП до конца не решен, многие авторы считают, что специфическая функция ^-концевых участков, по-видимому, проявляется на более высоких уровнях организации хроматина / 19,35, 87,144/. Выло также показано, что гистон Н2В дрожжей, имеющий

(большие делеции в N-концевой области молекулы, может функционировать in vivo /228/. Однако вывод о меньшей стабильности и меньшей компактности мононуклеосом дрожжей требует более глубокого исследования роли N-концевых доменов гистонов на уровне кор-частиц в хроматине низших эукариотов.

Для выявления возможных особенностей в строении хроматина грибов мы исследовали структуру хроматина другого их представителя - плесневого гриба Neurospora crassa , который является классическим объектом исследования биологов.

Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

Разработать метод выделения препарата кор-частиц из Neurospora crassa.
Провести сравнительную характеристику выделенного препарата кор-частиц по: длине фрагмента ДНК и белковому

составу;

скорости седиментации;

доступности действию ДНКазы I.

3. Изучить изменение перечисленных характеристик в ходе
ограниченного протеолиза кор-частиц с целью выявить
вклад различных доменов гистонов в поддержание компакт
ной структуры нуклеосом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались следующие материалы и реактивы:

Неорганические и органические соли ( NaCI , СаС^, MgCl₂, КН2РО4, уксуснокислый натрий трехводный, цитрат натрия трехза-мещенный и т.д.), кислоты (уксусная кислота ледяная, борная кислота кристаллическая, соляная кислота и т.д.), щелочи и спирты, а также сахароза и мочевина - были химически чистыми (ХЧ) или особой чистоты (ОСЧ), "Реахим".

Реактивы для "пептидных карт" и определения и-концевых аминокислот белков и пептидов: муравьиную кислоту, бензол, этил-ацетат, пиридин, триэтиламин и т.д. - предварительно перегоняли.

В работе использовались: трис - триоксиметиламинометан ("Merck " ); Na, -ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия трехзвмещенный ( " Sigma " ); глицин ( » Reanal " ); J3 -мер-каптоэтанол перегнанный ( " Reanal" );дитиотреитол ( "Pierce"); акриламид перекристаллизованный ( "Reanal" ); N,N« *-метиленбис-акриламид ( "Reanal" ); ТЕМЭД - її,її,Н* ,N« -тетршлетилэтиленди-амин перегнанный. ( "Reanal" ); (13. - персульфат аммо-ния ( "Reanal" ); ДЦС-їТа - додещлсулъфат натрия ( nbc ; "Pierce'}; тритон Х-100 ( "Merck" ); фшюлл-400 ( "Pharmacia" ); агароза ( "Sigma" и "Reanal" ); ФМСФ - фенилметішзульфонилфто-рид ( "Serva" ); формамид ("Реахим"', Ч); формальдегид перегнанный 37 ("Реахим"); кумасси голубой R-250 ( "Serva"); ами-до'вый черный 10В ( "Reanal" ); бромфеноловый синій ("Реахим"); брошстый этидий ( "Calbiochem"); флуорескамин( "Serva"); ксилолцианол голубой ( "Reanal" ); пиронин ("Реахим" ); дшетилашшонафталинсульфшилхлорид (ДНС-СІ) и дансиламинокис-лоты ( "Pierce" ); саркозил ( "Serva" ); АТЗ? - аденозиытрифосфор-

ная кислота ( "Reanal" ); У-(³²Р)-АТФ ( "Amersbam" ).

Ферменты: микрококковая нуклеаза (Е.С.3.1.4.7) ( "Wor-t-hing-ton" ); ДНКаза I - дезоксирибонуклеаза панкреатическая (E.C.3.I.4.5) ( "Sigma"); трипсин бычий (кат. №37260, 40 ед/мг) ("Serva" )_f обработанный ТКЖ - (1-тозиламидо-2-фенил)-этил-хлорметилкетоном ( "Serva" ). проназа В S^rade ( "Calbiochem*}_;карбоксипептвдаза В (кат, LS 0005305, 170-210 ед/мг, "Worthing-

ton" ); Т4 - полинуклеотидкиназа (НПО "Биопрепарат" ВНИИ прикладной энзимологии, г.Вильнюс, 42000 ед/мг).

Материалы: ионообменная смола Dowex 50 W^oc 2 (200-400 меш) ( "Serva" ); диализные шешки disking tubes ( "Serva" ); се-фароза 6В ( "Pharmacia" ); насадка для ультрафильтрации Immer-sible СХ ( "Millipore" )_; акрилекс Р-60, размер частиц 50-100 мк ( "Reanal" ); сефадекс G -75 (superfine,"Pharmacia" ); полиамидные пленки ( "Chin-Chung" \_% Тайвань); пластины с тон-ким слоем целлюлозы ( "Eastman Chromatogram Sheet"» & ⁶65, "Kodak" ); мембранные фильтры с диаметром пор 0,4 мкм ("Сынпор", "Chemapol" )_; рентгеновская пленка типа РМ-В, ошо HS-11 , ЪКВ - Ultrafilm.

Фрагменты ДЖ фага SV -40 после рестрикции Hind III были \ предоставлены Д.А.Масловым.

2.1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Плесневый гриб Neurospora crassa имеет следующее систематическое положение:

класс Ascomycetes

подкласс Euascomycetidae

порядок Zyl аг і ale s

семейство Sordariaceae

вид Neurospora crassa

Объектом настоящего исследования являлся мутант fqsc 327 ( arg~,cr-i,aur, os-1 ), лишенный механически прочной клеточной стенки. Клетки его представлены в виде отдельных сфероплас-тов.

2.2. ВЫРАЩИВАНИЕ NEUROSPORA CRASSA

Клетки гриба выращивали в жидкой "минимальной" среде следующего состава (в граммах на I литр)(24 ):

аммоний виннокислый средний 5

аммоний азотнокислый I

калий фосфорнокислый одно замещенный I

магний сернокислый 0.5

натрий хлористый 0.1

кальций хлористый безводный 0.1

сахароза 20

глицерин 150

биотин I мл

раствор микроэлементов I мл

L-аргинин 0.2

Использовали раствор биотина в 50$ этаноле (5 мкг/мл) и раствор микроэлементов следующего состава ( в мг на 300 мл воды):

борная кислота 18

натрий молибденовокислый двуводный 15
железо сернокислое закисное семиводное 300
медь сернокислая пятиводная 120

марганец сернокислый семиводный 29
цинк сернокислый семиводный 1800

В качалочные колбы объемом 0,5 л помещали по 200 мл среды и стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 минут. Посевной материал готовили следующим образом. Микробиологической петлей забирали с косяка клетки гриба и заражали ими 200 мл среды. После 72 часов роста на качалках при +28С вырастала культура гриба, которой засевали опытные колбы. В каждую колбу вносили 15 мл инокулята и выращивали, как описано выше, в течение 48 часов. Культура при этом достигала стационарной фазы роста. Иногда в среду добавляли антибиотики пенициллин и стрептомицин (конечная концентрация 10 000 единиц на 100 мл среды) для предотвращения роста посторонних микроорганизмов.

Сферопласты осаждали центрифугированием при 3 000 _g в течение 5 минут, при температуре +4С, промывали свежей порцией среды для выращивания, переосаждали и сразу же использовали для выделения ядер. С I колбы получали 2,5-3 г сырой биомассы.

2.3. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

2.3.1. Выделение кор-частиц хроматина из угечтярпт'я лт._яяоя

Все операции по выделению ядер и получению препаратов ДНЇЇ и белков проводили при температуре +4С. Во все растворы непосредственно перед применением добавляли ФМСФ до конечной концентрации I мМ, используя исходный 100 мМ раствор в изопропаноле.

Сферопласты (100 г) лизировали в буфере, содержащем 18$ фи-колла 400, 20 мМ КЕ^РО^, 0,5 мМ СаС1₂, рН 6,5, добавляя его из расчета 3 мл на I г сырых клеток. Лизирующий буфер добавляли порциями, при перемешивании суспензии стеклянной палочкой, и далее разрушали сферопласты в гомогенизаторе Поттера с тефлоновим пестиком. Разрушение сферопластов контролировали с помощью световой и люминесцентной микроскопии (см. раздел 2.3.1.2). Неразрушенные сферопласты осаждали при 4 000 g , 5 минут, а неосевшую суспензию осторожно наслаивали на подложку из среды А, содержащей 1,7 М сахарозы, 20 мМ Ш^РО^, I мМ СаСЪ?, рН 6,5, в заранее подготовленных центрифужных пробирках. В центрифужные пробирки для ротора ja-20 центрифуги Весішап J-21B обычно ВНОСИЛИ ПО 13-15 мл среды А, имеющей плотность 1,223-1,224 г/см³ при температуре +5С.

Ядра осаждали центрифугированием при 30 000 g в течение 40 минут. Осадок ядер собирали, суспендировали в буфере, содержащем 0,5 М сахарозы, 20 мМ ШуРО^, * ^м^ CaC^t рН 6,5 и переосаждали при 8 000 g , 10 минут. Процедуру повторяли 2-3 раза. Препарат ядер использовали для дальнейших исследований либо непосредственно после выделения, либо после хранения при +4С не более 12-14 часов.

2.3.1.2. Контоль_чис.то^ты_и__целосл?ности_^епаата_яде;]э Степень разрушения сферопластов, а также чистоту и целостность выделенного препарата ядер контролировали с помощью люминесцентной микроскопии. Мазок окрашивали акридиновым оранжевым (0,01$ раствор в воде) и исследовали при увеличении 700 и 1000 .

Ядра при этом окрашивались в изумрудно зеленый цвет, а мембраны и некоторые внутриклеточные структуры - в красный.

2.3.1.3. Получение препарата хроматина Препарат ядер осторожно суспендировали в 2-3 объемах 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащего 0,25$ тритона Х-100 и 75 мМ NaCl , в гомогенизаторе Поттера со слабо пригнанным тефлоновим пестиком. Освобождающийся при этом хроматин осаждали при 7 500 є в течение 10 минут и операцию повторяли еще раз. Далее препарат хроматина отмывали 2-3 раза от следов детергента и некоторых негисто-новых белков, суспендируя его в 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, содержащем 75 мМ НаС1 и 2 мМ ЭДТА, и переосаждали при тех же условиях. Полученный препарат хроматина использовали для дальнейших исследований.

2.3.1.4. Выделение ко-частиц_хроматина_ Кор частицы получали при обработке хроматина микрококковой нуклеазой ( I9Q. Полученный препарат хроматина суспендировали в 10 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,5 (A2gQ⁼I00) и добавляли к нему раствор 0,5 М СаСІ до концентрации I мМ, 100 мМ раствор ФМСФ до I мМ и микрококковую нуклеазу с активностью 6 000 ед/мл до конечной концентрации 120 ед/мл. Гидролиз нуклеазой проводили при +37С, при перемешивании. Время инкубации предварительно подбирали экспериментально (оно составляло обычно 40-45 минут). Реакцию останавливали добавлением 100 мМ раствора ЭДТА до концентрации 5 мМ и охлаждением до 0-2С. Гидролизат центрифугировали при 30 000 g в течение 10 минут, к супернатанту добавляли сахарозу до концентрации 6$, раствор 100 мМ ФМСФ до I мМ и наносили на колонку с сефарозой 6В (3,2x120 см), уравновешенную 10 мМ трис-HCI с 0,7 мМ ЭДТА, рН 7,5 ( ⁸⁷). На колонку наносили препарат

с общим содержанием ДНК 25-30 мг (500-600 ед A₂gg). Элюцию проводили тем же буфером со скоростью 10-12 мл/час, собирая фракции объемом 5 мл. Количественное содержание ДНК во фракциях определяли по оптическому поглощению при 260 нм. Качественный состав ДНК во фракциях определяли методом электрофореза в геле 2% агарозы (см. раздел 2.4.2). Фракции, содержащие молекулы ДНК размером только 140-150 п.о., собирали и концентрировали до содержания ДНК 0,5 мг/мл (А2бд⁼ЗД) при помощи насадки для ультрафильтрации Immersible GX-10 (Millipore ) . Полученный препарат диализовали в течение 12 часов против 100-кратного объема 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, 0,7 ЭДТА. Из 100 г сырой массы выделяли кор-частицы с общим содержанием ДНК 2,5-3 мг.

В ряде случаев интактные кор-частицы получали из гидролиза-та хроматина микрококковой нуклеазой методом препаративного электрофореза ДНП (см. раздел 2.3.6). Этот же метод использовали для дополнительной очистки кор-частиц после фракционирования на колонке с сефарозой 6В.

2.3.2. Выделение кор-частиц из эритроцитов курицы

2.3.2.1. Получение препарата ядер_из .эритроцитов куржы__

Ядра из эритроцитов курицы получали с использованием детергента тритон Х-100 (196). От одной белой курицы после декапита-ции получали 70 мл крови. К полученной крови добавляли 15 мл 10$ цитрата натрия, рН 7,0, фильтровали через 4 слоя марли и осаждали эритроциты центрифугированием при 3 000g в течение 10 минут. Эритроциты 2 раза промывали в 80 мл 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, содержащего 0,ЬМ NaCl и 0,01 М цитрата натрия, и осаждали при тех же условиях. Эти и все последующие операции проводили при температуре +4С.

Эритроциты лизировали в 80 мл 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, содержащего 0,5% тритона Х-100 (объем/объем) и І мМ СаСІ. Лизис проводили в две порции по 40 мл в стеклянном гомогенизаторе Пот-тера с тефлоновим пестиком. Ядра осавдали из суспензии центрифугированием при 7 500 g в течение 10 минут, дважды промывали тем же буфером и переосаждали.

Осадок ядер эритроцитов три раза отмывали от следов детергента, суспендируя его в 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащем 0,15 М їїкбї , I мМ СаС1₂ и 0,34 М сахарозы (буфер В) и центрифугируя при 7 500g в течение 10 минут. Полученный препарат использовали для дальнейших исследований либо непосредственно после выделения, либо после хранения при температуре -20С в буфере В с 50$ глицерина (объем/объем). Препарат ядер, полученный из 70 мл крови, содержал около 200 мг ДНК.

2.3.2.2. Получение препарата хроматина,_лишенного_гистонов Н1_и_

- -Д5 _

Солюбилизированный препарат хроматина получали при обработке ядер микрококковой нуклеазой. С этой целью осадок ядер суспендировали при +37С в буфере В до концентрации ДНК около 10 мг/мл. К суспензии добавляли раствор 100 мМ ФМСФ в изопропаноле до конечной концентрации I мМ и микрококковую нуклеазу до конечной активности 15 ед/мл. Инкубацию проводили при постоянном перемешивании, в течение 3 минут, при +37С и останавливали реакцию добавлением 100 мМ раствора ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ. Ядра осаждали центрифугированием при 7 500g в течение 10 минут и дважды промывали полученный осадок буфером В, не содержащим иаохр.

Осадок суспендировали в стеклянном гомогенизаторе со слабо пригнанным стеклянным пестиком в І мМ трис-НСІ, 2 мМ ЭДТА,

pH 7,5 при концентрации ДНК 6 мг/мл. При этом происходил лизис ядер и солюбилизация хроматина.

Гистоны HI и Н5 удаляли при помощи ионообменной смольгооетех 50W х2 ( 36). Для этого к I части препарата хроматина с содержанием ДНК 6 мг/мл добавляли 5 частей раствора следующего состава: 0,6 М NaCl и 0,06 М фосфата натрия, рН 7,0, и суспендировали выпадающий при этом осадок в стеклянном гомогенизаторе со слабо притертым пестиком. После нескольких ходов пестика осадок вновь солюбилизировался. К раствору добавляли ионообменную смолу Dowex 50W х2 (25$, объем/объем), предварительно отмытую последовательно 0,5 М HGI, 0,5 М NaOH и уравновешенную буфером, содержащим 0,5 М NaCl и 0,05 М фосфата натрия, рН 7,0. Суспензию выдерживали в течение I часа при +4С, при постоянном перемешивании. Затем смолу отделяли центрифугированием при I 000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирали и диализовали в течение 12 часов против 100-кратного избытка по объему 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, содержащего 0,7 мМ ЭДТА. Полученный после диализа препарат использовали для дальнейших экспериментов. Этот препарат содержал около 90$ ДНК от ее первоначального содержания в препарате.

2.3.2.3. Вьщеление ко^-частиц^. Кор-частицы получали при обработке микрококковой нуклеазой хроматина эритроцитов курицы, лишенного гистонов ЕЕ и Н5 (128). К препарату хроматина (с концентрацией 2 мг/мл ДНК) в 10 мМ трис-НОІ, І мМ СаСІ₂, І мМ ФМСФ, рН 7,5 добавляли при +37С микрококковую нуклеазу (8 000 ед/мл) до конечной концентрации 60 ед/мл. Реакцию вели в течение 40 минут при постоянном перемешивании и останавливали, добавляя 100 мМ раствор ЭДТА до концентрации 5 мМ.

Все последующие операции описаны в разделе 2.3.1.4.

2.3.3. Обработка кор-частид трипсином Препараты кор-частиц с различной степенью протеолиза гисто-нов получали их обработкой трипсином с разной его концентрацией.

К раствору кор-частиц (с концентрацией ДНК 0,5 мг/мл) в 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, содержащем 0,7 мМ ЭДТА, добавляли раствор 0,1 мг/мл трипсина в воде до конечной концентрации 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 6,4; 12,8 мкг/мл. Реакцию проводили при +37С в течение 20 минут и останавливали добавлением раствора 100 мМ ФМСФ в изопропаноле до конечной концентрации I мМ. Препараты протеоли-зованных кор-частиц использовали для дальнейших исследований.

2.3.4. Обработка кор-частиц дезоксирибонуклеазой I Кор-частицы обрабатывали ДНКазой I при температуре +4С (156). Реакцию проводили с препаратами интактных или обработанных трипсином кор-частиц, непосредственно после их получения или после предварительного введения ^олР (см. разделы 2.3.5 и 2.3.6).

К раствору кор-частиц, содержащему 0,5 мг/мл ДНК в 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5; 0,7 мМ ЭДТА, добавляли при +4С раствор 100 мМ МєС1₂до конечной концентрации 1-2 мМ и раствор ДНКазы I с активностью 600 к.е./мл до конечной концентрации 150-200 к.е./мл (для интактных препаратов) или 50-70 к.е./мл (для протеолизован-ных кор-частиц). В работе использовали препарат ДНКазы I,(Sigma), с активностью I 200 к.е./мг. Через определенные промежутки времени реакцию останавливали, добавляя равный объем раствора, содержащего I мг/мл проназы, 10 мМ ЭДТА, 1% ДЦС-Na и 0,2 М СН₃С00 Na .ЗН₂0. Продукты обработки ДНК выделяли, как описано в разделе 2.4.1 и разделяли путем электрофореза в денатурирующих условиях (см. раздел 2.4.4) или путем высокоразрешающего электрофо-

реза ДНК (см. раздел 2.4.5).

2.3.5. Получение меченных ^-^ор-частиц, Интактные кор-частицы метили по 5 -концу, используя У--(³²Р)-АТФ, как описано у Латтера (129). Поскольку стафилококковая нуклеаза расщепляет ДНК в составе хроматина, оставляя фосфатную группировку на з'-конце фрагментов ДНК, специально реакцию дефосфорилирования по 5 -концу не проводили.

100 мкл раствора кор-частиц с концентрацией ДНК около 0,5 мг/мл инкубировали со 150 микрокюри ](-(³%)-АТФ в 100 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащем 10 мМ MgClp , 4 мМ дитиотрейтола и 1-2 мкл Т4-полинуклеотидкиназы (приблизительно 10 ед) при +370. Реакцию проводили в течение 20-30 минут и останавливали, добавляя к реакционной смеси 100 мМ раствор ЭДТА до концентрации 20мМ и 20 мМ раствор АТФ до I мМ. Далее добавляли исходный раствор кор-частиц до объема 0,5-1 мл. Для получения гомогенного препа-рата и освобождения от непрореагировавшего у -( Р)-АТФ, продуктов деградации нуклеосом и некоторых других примесей использовали метод препаративного электрофореза ДНП (см. раздел 2.3.6).

2.3.6. Препаративный электрофорез ДНП Выделение кор-частиц, гомогенных по длине ДНК и содержащих интактные кор-гистоны, проводили путем препаративного электрофореза ДНП, как описано у Шика и др. (191), в 1% ПААГе, используя в качестве буферной системы 10 мМ трис-НСІ, 2 мМ ЭДТА, рН 8,3.

Для приготовления геля смешивали 14 мл раствора А (36% АА, 1% МБА, вес/объем), 7,2 мл концентрированного электродного буфера (ХІ0) и около 30 мг персульфата аммония, объем доводили водой до 72 мл и дегазировали раствор под вакуумом. Далее добавляли 80-100 мкл ТЕМЭД и заливали раствор в блок размером 16x16x0,3 см

до высоты 12 см. Полимеризация завершалась за 30-40 минут. Пре-форез вели при +4С, напряжении 200 В (сила тока изменялась при этом с 35-37 мА до 31-33 мА), в течение 1-2 часов, при постоянном перемешивании электродного буфера в камерах. По окончании преэлектрофореза в камеры заливали свежую порцию буфера.

В образцы добавляли фиколл 400 до Ъ% и краситель бромфено-ловый синий и наносили на гель. Электрофорез проводили при напряжении 200-250 В, в течение 5-6 часов, при постоянном перемешивании электродного буфера в камерах и температуре +4С. На гели толщиной 3 мм наносили препараты, содержащие не более 200 оптических единиц ДНК. После окончания электрофореза вырезали полосы по краям геля и прокрашивали раствором бромистого этидия в воде (I мкг/мл). Соответствующий положению интактных кор-час-тиц участок непрокрашенного геля вырезали, измельчали и элюиро-вали кор-частицы тремя объемами 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, 0,7 мМ ЭДТА, при постоянном перемешивании, в течение 18 часов, при +4С. В этих условиях удается о-элюировать 30-40$ материала.

Далее суспензию фильтровали и раствор кор-частиц концентрировали до минимального объема с помощью насадки для ультрафильтрации Immersive СХ-10.

К полученному препарату, содержащему меченые кор-частицы, добавляли раствор "холодных" нуклеосом до концентрации ДНК 0,2-0,5 мг/мл, и проводили обработку ДНКазой I, как описано в разделе 2.3.4.

2.3.7. Выделение суммарного препарата гистонов

из Neurospora crassa. Выделение суммарного препарата гистонов гриба осуществляли по методу, предложенному Гоффом (83).

Сферопласты гриба собирали центрифугированием при 3 000 g 5 мин., промывали свежей порцией среды для выращивания и пере-осаждали при тех же условиях. Начиная с промывки сферопластов, все операции проводили при 4С. Одновременное разрушение клеток и ядер проводили в лизирующем буфере, содержащем 0,3 М сахарозы, 0,025 М трис-НСІ, 0,01 Щ S0₄ , 5 х 10*"% ЭДТА, 0,04 М NaHSO* 0,5$ тритон Х-100, рН 7,4, в гомогенизаторе Поттера с притертым тефлоновим пестиком. На каждые 15 г сырых клеток брали 15 мл буфера и лизировали 2 мин. при вращении пестика со скоростью 5-6 тыс. об/мин. Хроматин осаждали центрифугированием при 7 500з 10 мин. Процедуру повторяли еще раз. Лизирующий буфер и все последующие растворы содержали ингибитор протеиназ ФМСФ в концентрации I мМ, который добавляли из исходного 100 мМ раствора в изопропаноле.

Выделенный хроматин суспендировали в 5-Ю мл 0,025 М NaHSO* рН 7,2. Для выделения суммарного препарата гистонов к раствору хроматина добавляли равный объем 0,5 н HCI и перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 мин. при 4С. ДНК отделяли центрифугированием при 7 500 g 10 мин. Экстракцию гистонов повторяли. Супернатанты объединяли и осаждали гистоны шестью объемами подкисленного холодного ацетона (I мл конц. HCI на I л ацетона). Осадок белков формировался в течение ночи при -20С.

2.3.8. Фракционирование суммарных препаратов гистонов

Для получения гистона Н2В применяли методику гель-фильтрации суммарных препаратов гистонов, предложенную Бёмом и соавторами ( 30). С этой целью из суммарного препарата сначала удаляли гистон HI путем экстракции его 0,5$ раствором НСЮ₄, а оставшиеся белки хроматографировали.

70-90 мг гистонов растворяли в 3-4 мл 8М мочевины с 1% 2-меркаптоэтанолом, инкубировали ночь при 4С и наносили на колонку размером 2x150 см с акрилексом Р-60. Белки элюировали раствором 0,02 н HCI, содержащим 0,05 М NaCl и 0,02$ азида натрия, рН 1,7. Скорость элюции составляла 0,5 мл/час. Собирали фракции I мл с помощью автоматического коллектора ⁿUltrarac"LKB при 4С.

Концентрацию белка во фракциях определяли по окрашиванию амидовым черным аликвоты объемом 5-Ю мкл на мембранном фильтре "Сынпор" (см. п. 2.5.2). 0 качественном составе фракций судили по результатам электрофоретического анализа.

2.3.9. Очистка гистона Н2В Для получения гомогенного препарата гистона Н2В обогащенные после хроматографии на колонке с акрилексом Р-60 фракции переосаждали ацетоном и рехроматографировали на колонке размером 1,4x120 см с сефадексом G-75. Использовался такой же элюент, как при хроматографии на акрилексе. Скорость элюции составляла I мл/час. Анализ фракций проводили, как описано выше.

2.4. ЭЛЕКТРШОРЕШЕСЖЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Большинство используемых реактивов дополнительно подвергалось очистке: акриламид перекристаллизовывали из хлороформа; N, N -метиленбисакриламид из ацетона; $ $ и'^¹ -тетраметилэти-лендиамин перегоняли, собирая фракции, кипящие при 122-123С, мочевину (осч) перекристаллизовывали из бидистиллята.

2.4.1. Приготовление образцов ДНК для электрофореза Образцы ДНП смешивали с равным объемом раствора, содержащего I мг/мл проназы, 1% ДДС-иа » 0,2 М _сн coONa 3%0 и

- 80 -10 мМ ЭДТА, и инкубировали их при +37С в течение 30 минут. Далее к пробам добавляли равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) либо фенола, насыщенного в два раза более концентрированным ТАЕ-буфером (раздел 2.4.2).

После интенсивного встряхивания суспензию центрифугировали, отбирали водную фазу и содержащуюся ДНК осаждали двумя объемами холодного этанола* Осадок формировался при -20С в течение 12 часов. Его собирали центрифугированием, высушивали под вакуумом и непосредственно перед проведением электрофореза растворяли в соответствующем буфере для образцов.

2.4.2. ЭлекттэоФотзез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в условиях, при которых сохраняется ее на-тивная структура, проводили в геле 2% агарозы в системе Лёнинга ( 12$. в качестве буферной системы использовали ТАЕ-буфер, содержащий 0,04 М трис, 0,02 М CH,COONa *ЗН₂0, 2 мМ ЭДТА, 0,32$ (объем/объем) ледяной СН3СООН, рН 7,8. Размеры геля: 17x17x0,Зсм, ширина ячеек для нанесения проб 0,6 см.

Образцы ДНК готовили, как описано в разделе 2.4.1. В ряде случаев непосредственно в пробы ДНИ добавляли равный объем 2-кратного ТАЕ-буфера, содержащего 20$ сахарозы и 0,8$ саркози-ла, который разрушает связь белков с ДНК ( 60), и наносили их на гель. Образцы содержали до 10 мкг ДНК и имели конечный объем не более 50 мкл.

Электрофоретическое разделение проводили при постоянном напряжении 80-100 В, в течение 2-3 часов, при температуре +4С. Краситель бромфеноловый синий проходит при этом 2/3 длины геля.

По окончании электрофореза гель прокрашивали раствором бромистого этидия (1-2 мкг/мл) и фотографировали через оранжевый

светофильтр 0C-I2 на фотопленку Фото-65, "Тасма".

2.4.3. Определение длины нуклеосомного повтора методом электрофореза ДНК в агарозном геле

Для калибровки геля при проведении электрофореза в одну из ячеек наносили фрагменты ДВК фага sv -40 после рестрикциинхпсі III, размеры которых точно известны,, Исходя из логарифмической зависимости подвижности фрагментов ДНК от их молекулярной.массы, строили калибровочный график, откладывая по оси абсцисс значение

подвижности каждого фрагмента ДНК определенной длины, а по оси ординат - соответствующую ему молекулярную массу$з)(ЇІ2).

По калибровочному графику определяли длину фрагментов ДНК, образующихся из хроматина N.crassa под действием микрококковой нуклеазы. Для определения размера нуклеосомного повтора вычисляли разницу длин ДНК соседних, кратных нуклеосомному повтору, полос. Следует отметить, что эти полосы достаточно гетерогенны по длине ДНК, и расстояние измеряли от центра диффузных полос.

Вычисленные значения разниц длин ДНК соседних, кратных нуклеосомному повтору, полос усредняли и среднее значение определяли как величину нуклеосомного повтора.

2.4.4. Электрофорез ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях

Для разделения одноцепочечных фрагментов ДНК нуклеосом использовали блок % ПААГ (акриламид:бисакриламид=36:1), содержащего 7М мочевины. В качестве буферной системы использовали 0,09 М трис-боратный буфер рН 8,3; 2,5 мМ ЭДТА (ТВЕ-буфер)(132).

Для приготовления геля смешивали 9 мл раствора А (36$ АА, 1% МБА), 3,6 мл 10-кратного ТВЕ-буфера, 15,1 г мочевины, 10 мг персульфата аммония и бидистиллятом доводили объем до 36 мл. Раствор дегазировали, добавляли 100 мкл ТЖЭД и заливали в блок

размером 17x17x1,5 см. Блок закрывали гребенкой с шириной зубцов 0,7 см. Полимеризация завершалась в течение 30-45 минут.

Приготовленные, как описано в разделе 2.4.1, пробы (около 20 мкг) ДНК растворяли в 10-15 мкл формамида, содержащего 10$ сахарозы и краситель бромфеноловнй синий, прогревали 2 минуты на кипящей водяной бане и наносили на гель. Важно, чтобы объем проб был одинаковым и все ячейки были заполнены формамидом, только в этих условиях можно получить хорошие результаты. Существенное влияние на качество разделения фрагментов ДНК оказывает чистота используемых ингредиентов.

Электрофорез вели при силе тока 12 мА и напряжении 100-120 В, при комнатной температуре в течение 3,5-4 часов (метчик бромфеноловнй синий проходит при этом 2/3 длины геля).

По окончании электрофореза гель прокрашивали раствором бромистого этидия и фотографировали на пленку Фото-65 (светофильтр 0C-I2) в проходящем ультрафиолетовом свете.

2.4.5. Высоко-разрешающий электрофорез ДНК в ПААГ 2.4.5.1. Проведение_электрофореза_

Для разделения одноцепочечных фрагментов ДНК после обработки кор-частиц ДНКазой I использовали электрофоретическую систему, применяемую при секвенировании ДНК (138). "Структурный гель" содержал 8$АА, 0,4$ МЕА, 8М мочевины в 0,14 М трис-боратном буфере, рН 8,8 с 2,5 мМ ЭДТА. Для приготовления "структурного геля" смешивали 10 мл 1,4 М трис-бората, рН 8,8, содержащего 25 мМ ЭДТА, 20 мл раствора 38$ АА и 2$ МЕА, вес/объем, и 50 г мочевины. Мочевину растворяли при слабом нагревании на водяной бане и доводили объем смеси до 100 мл водой. Раствор фильтровали через фильтр из Ватмана ЗММ, добавляли 0,6 мл 10$ водного раствора ПСА

и дегазировали под вакуумом.

Форму для заливки готовили из 2 стекол размером 20x40 см и 2^хпрокладок 10x400 мм толщиной. По периметру форму тщательно заклеивали лейкопластырем. В 50 мл раствора геля добавляли 25 мкл ТЕМЭД, перемешивали и заливали в форму через шприц-воронку, поместив форму на подставку или держа ее под углом 30-45. При этом следили за тем, чтобы в растворе геля не оставались пузыри. Сверху вставляли гребенку с шириной зубцов 0,5 см, форму зажимали прищепками на высоте гребенки и клали на стол горизонтально. Полимеризация завершалась за 20-30 минут. Гребенку осторожно удаляли и немедленно промывали верх геля струей дистиллированной воды. Сняв лейкопластырь, форму с гелем устанавливали в прибор для электрофореза. В качестве электродного буфера использовали 0,14 М трис-борат, рН 8,8, содержащий 2,5 мМ ЭДТА. Ячейки еще раз тщательно промывали электродным буфером с помощью шприца. В крайние ячейки наносили по 2 мкл смеси красителей бромфенолового синего и ксилолцианола голубого в формамиде. Гель присоединяли к верхнему сосуду с буфером фителем из двух слоев Ватман ЗММ. Префорез вели при напряжении 1200-1500 В (сила тока колебалась в пределах 19-23 мА.) в течение 1-1,5 часов, следя при этом за разделением красителей.

Далее в сосуды заливали свежую порцию буфера и снова тщательно промывали лунки геля. Образцы ДНК, приготовленные, как описано в разделе 2.4.1, растворяли в формамиде, содержащем 10$ сахарозы и красители бромфеноловый синий и ксилолцианол голубой. Пробы прогревали на кипящей водяной бане 2 минуты и наносили в лунки геля в объеме не более 3 мкл. Электрофорез вели при силе тока около 20 мА (обычно 17-19 мА). Начальное напряжение при этом составляло приблизительно 1500 В,по мере разогрева геля

снижалось электронной схемой до 1200 В, затем в ходе электрофореза постепенно поднималось до 1800 В.

Время электрофореза устанавливали, исходя из того, что на используемом геле (8%) краситель бромфеноловый синий движется с фрагментами ДНК длиной около 19-21 п.о., а ксилолцианол -70-80 п.о.

Обычно электрофорез шел 2,5-3 часа, краситель бромфеноловый синий при этом располагался на расстоянии 3-4 см от конца геля. После окончания электрофореза верхнее стекло с геля осторожно снимали, следя, чтобы гель оставался на одном стекле.

2.4.5.2. Авторадиогра^ирование геля__ Далее гель экспонировали одним из двух способов.

1. Гель покрывали пленкой "Saran wrap" и авторадиографировали
в кассете при -70С, используя рентгеновскую пленку типа РМ-В,

HS-11, LKB-Ultrafilm и усиливающий экран типа ЭУИ-1.

2. Гель на стекле помещали в кювету с 10$ СНдСООН на 10 минут,
затем вынимали, давали избытку жидкости стечь, держа почти го
ризонтально. Гель подсушивали на воздухе в течение 15 минут и
покрывали пленкой "Saran wrap" . Сверху гель накрывали листом
рентгеновской пленки, прижимали его чистым верхним стеклом, фор
му скрепляли 6-ю зажимами для бумаги и оставляли на экспозицию

в светонепроницаемом пакете при +4С.

Проявление радиоавтограмм производили по инструкции, напечатанной на упаковке рентгеновской пленки: проявление 5-8 минут, промывка I минута, фиксирование 10-15 минут, промывка 15-20 минут. Температура обрабатывающих растворов и воды 20-23С.

При работе использовали проявитель "Рентген-2" следующего состава (в граммах на литр):

Метол 2,2 г

Сульфит натрия безводный 72,0 г

Гидрохинон 8,8 г

Сода безводная 48,0 г

Калий бромистый 4,0 г Проявитель применяли не ранее чем через 12 часов и не позднее 5 суток после приготовления.

Пластины фиксировали в фиксаже БКФ-2 следующего состава (в граммах на литр):

Гипосульфит натрия кристаллический 260

Аммоний хлористый 50

Метабисульфит натрия 17

2.4.6. Приготовление образцов белка для электрофореза

Гистоны из препарата ядер, хроматина, интактных и протеоли-зованных кор-частиц экстрагировали 0,25 н HCI и осаждали шестью объемами охлажденного ацетона. Осадок формировался в течение 12 часов при -20С. Его собирали центрифугированием, высушивали под вакуумом и растворяли в буфере нанесения.

2.4.7. Диск-электрофорез гистонов в присутствии додепилсульфата натрия

Электрофоретическое разделение гистонов и продуктов их протеолиза в 18$ ПААГе с 0,03$ ДЦС- Na проводили по модифицированному методу Леммли (114) в блоках размером 16x16x0,04 см.

Исходные растворы: Раствор А: 36$ АА и 1$ МБА в бидистилляте (вес/объем); Раствор Д: 0,12$ ДЦС-Na в З М трис-HCI, рН 8,8; Раствор К: 0,12$ ЭДС- Na в 0,5 М трис-НСІ, рН 6,8.

Хроматин низших эукариотических организмов.

До настоящего времени остается много неясного в вопросах о том, каким образом изменяется нуклеосомная структура для обеспечения различных функций хроматина. Ряд особенностей низших эукариотов (водорослей, миксомицетов, простейших и грибов), таких как высокая транскрипционная активность генома и относительная простота его организации, а также доступность техники генетического и биохимического анализа - делают эти организмы интересными и удобными объектами в плане исследования структуры хроматина и его активации. Грибы относятся к низшим гетеротрофным организмам, состоящим из слабо дифференцированных клеток. Этот тип представляет собой резко обособленную группу, филогенетическое происхождение которой неопределенно /10/. Несмотря на то, что грибы относятся к растениям, некоторые анатомические и физиологические черты сближают их с животным миром, а ряд цитологических особенностей не имеет аналогий у высших эукариотов. В частности, при митозе и мейозе у грибов сохраняется ядерная мембрана /84,247/, центриоли не образуются и не наблюдается ярко выраженной конденсации хромосом, свойственной высшим эукари-отам /247/. 1.2.I. Гистоны низших эукариотических организмов Если за последние 10-15 лет были достигнуты большие успехи в изучении первичной структуры гистонов из различных организмов, относящихся к высшим эукариотам /226/, то гистоны из низших эукариотических организмов остаются гораздо менее изученными. Наличие белков, близких к типичным гистонам по ряду биохимических свойств (экстракционные свойства, подвижность при электрофоретическом разделении, аминокислотный состав и другие), доказано для представителей всех низших эукариотов: водорослей - Euglena gracilis /182/, Olisthodiscus luteus /183/; простейших - Tetrahymena piriformis /102/, stylonychia mytilis /118/, Astasia longa /17/; миксомицетов - Physarum poly-cephalum /55,141,182/, Dictiostelium discoideum /22,56/, Polysphondylium pallidum /182/. В настоящее время присутствие 5 гистоновых фракций обнаружено у N. crassa /5,11,83,113/ несовершенного гриба Aspergillus nidulans /74/, зигомицета Phycomyces biakesleeanus (за исключением гистона, аналогичного НЗ) /59/ и аскомицетов - дрожжей Saccharomyces cerevisiae /43/ и S.r carlsoergensis /164/. Однако вопрос о наличии НІ в дрожжах остается открытым /43,64,172,202,212,217/. Гистоноподобные белки обнаружены также в оомицете Achla bisexualis /93/ и аско-мицете Cordyceps militaris /98/, но сравнения их свойств с гистонами высших эукариотов проведено не было.

В данном разделе мы попытались систематизировать имеющиеся в литературе сведения о строении гистонов низших эукариотов. Не останавливаясь подробно на рассмотрении первичных структур гистонов из высших эукариотов, мы применили те основные представления, которые сложились при их сравнительно-эволюционном изучении, для анализа опубликованных к настоящему времени аминокислотных последовательностей гистонов из низших эукариотических организмов. Наиболее эволюционно консервативными среди гистонов являются "богатые аргинином" гистоны Н4 и НЗ. На это указывало сходство электрофоретических подвижностей данных белков, выделенных из многих высших эукариотических организмов /161,163,201/. Предположение об идентичном строении и сходных функциях Н4 и НЗ в хроматине всех высших животных и растений полностью подтвердились результатами исследований, в ходе которых была доказана ключевая роль этих белков в формировании ядра нуклеосомы /ПО, 112,197/, а также результатами исследований первичной структуры НЗ и Н4 ряда организмов. Например, аминокислотная последовательность Н4 из тимуса теленка /66/ отличается от Н4 из проростков гороха /67/ всего двумя остатками: валин в положении 60 ти-муснчгогистона замененв гистоне гороха на изолейцин, а лизин-77 -на аргинин. Эти замены являются консервативним и не могут оказать существенного влияния на пространственную организацию его молекул. 7 гистона НЗ из проростков гороха обнаружены только 4 замены по сравнению с НЗ из тимуса теленка /68/, причем три из них консервативны /166/. Отметим, что консервативными называют аминокислотные замены, при которых не изменяется заряд, гидро-фобность и размер (объем) молекулы. Полуконсервативными - заме- ны, когда изменяется объем, но не заряд молекулы. Неконсервативными всегда будут замены, изменявшие её гидрофобность и объем.

Среди низших эукариотических организмов первичная структура гистона Н4 установлена лишь для нескольких представителей -простейшего Tetrahymena thermophila /82/, плесневого гриба N. crassa /244/ и дрожжей s. carlsbergensis /244/. Н4 из Т. thermophila отличается от Н4 из тимуса теленка в большей степени, чем Н4 из других высших эукариотических организмов: в установленной последовательности 66-ти аминокислот имеется 13 замен (6 консервативных, 5 полуконсервативных и 2 неконсервати-ЕНЫХ), I деления и I вставка (табл. 2). В основном, обнаруженные замены располагаются в F -концевой области молекулы, где концентрируются остатки основных аминокислот. Несмотря на различия в структуре гистона Н4 тетрахимены по сравнению с Н4 тимуса теленка, плотность общего заряда N -концевых участков их молекул (1-45 аминокислоты) отличается незначительно и равна, соответственно +3,1 и +3,3. Таким образом, можно полагать что в случае хроматина тетрахимены взаимодействие гистонов и ДНК не будет существенно слабев. Первичная структура гистонов Н4 из аскомицетов - плесневого гриба N. crassa и дрожжей S. carlsbergensis - была определена по результатам секвенирования ДНК генов соответствующих гистонов /244/. Каждый из этих белков отличается от Н4 тимуса теленка 8-ю аминокислотными заменами консервативного и полуконсервативного характера, половина из которых расположена в центральной части молекулы белка. 3 аминокислотные замены (положения 21, 83 и 84) идентичны у гистона Н4 обоих грибов (табл. 2). Установленные отличия в первичной структуре этих белков не из- меняют числа содержащихся в их молекулах основных и кислых аминокислот, т.е. общего заряда молекулы, и, вероятно, не повлияют и на способность гистонов Н4 грибов образовывать комплексы с друтими гистонами - БЗ, Н2В. Действительно, Мардиан и Айзенберг /133/ показали, что димеры Н2В-ЇЇ4, образованные гистонами близкого вида дрожжей Sv cerevisiae , имеют сходные параметры кругового дихроизма и флуоресцентной анизотропии с аналогичными гистоновыми комплексами из тимуса теленка. Гловер и Горовский изучали спектры кругового дихроизма и флуоресцентную анизотропию комплексов, образованных гистонами Tetrahymena thermophila , а также гетерологичных комплексов, образованных гистонами тетрахимены и тимуса теленка /82/. Было показано, что если Б2А, Н2В и НЗ простейшего не отличается от аналогичных гистонов позвоночного животного по способности образовывать комплексы, то взаимодействие Н4 тетрахимены с НЗ как тетрахимены, так и тимуса теленка оказалось значительно слабее, чем в комплексе Н4-ВЗ, образованном гистонами тимуса теленка. Таким образом гистон Н4 из простейшего тетрахимены существеннее, чем таковой из грибов - аскомицетов отличается от типичного гистона Н4.

Препаративные методы

2.3.1.I. Получение препарата ядер_ Ядра из плесневого гриба Neurospora crassa выделяли по разработанной в нашей лаборатории модификации методов Винтер-сбергер (241) и Идэ ( 95), предложенных для дрожжей Saccharo-myces cerevisiae . Все операции по выделению ядер и получению препаратов ДНЇЇ и белков проводили при температуре +4С. Во все растворы непосредственно перед применением добавляли ФМСФ до конечной концентрации I мМ, используя исходный 100 мМ раствор в изопропаноле. Сферопласты (100 г) лизировали в буфере, содержащем 18$ фи-колла 400, 20 мМ КЕ РО , 0,5 мМ СаС12, рН 6,5, добавляя его из расчета 3 мл на I г сырых клеток. Лизирующий буфер добавляли порциями, при перемешивании суспензии стеклянной палочкой, и далее разрушали сферопласты в гомогенизаторе Поттера с тефлоновим пестиком. Разрушение сферопластов контролировали с помощью световой и люминесцентной микроскопии (см. раздел 2.3.1.2). Неразрушенные сферопласты осаждали при 4 000 g , 5 минут, а неосевшую суспензию осторожно наслаивали на подложку из среды А, содержащей 1,7 М сахарозы, 20 мМ Ш РО , I мМ СаСЪ?, рН 6,5, в заранее подготовленных центрифужных пробирках. В центрифужные пробирки для ротора JA-20 центрифуги Весішап J-21B обычно ВНОСИЛИ ПО 13-15 мл среды А, имеющей плотность 1,223-1,224 г/см3 при температуре +5С. Ядра осаждали центрифугированием при 30 000 g в течение 40 минут. Осадок ядер собирали, суспендировали в буфере, содержащем 0,5 М сахарозы, 20 мМ ШуРО , м CaC t рН 6,5 и переосаждали при 8 000 g , 10 минут. Процедуру повторяли 2-3 раза. Препарат ядер использовали для дальнейших исследований либо непосредственно после выделения, либо после хранения при +4С не более 12-14 часов. 2.3.1.2. Контоль_чис.то ты_и__целосл?ности_ епаата_яде;]э Степень разрушения сферопластов, а также чистоту и целостность выделенного препарата ядер контролировали с помощью люминесцентной микроскопии. Мазок окрашивали акридиновым оранжевым (0,01$ раствор в воде) и исследовали при увеличении 700 и 1000 . Ядра при этом окрашивались в изумрудно зеленый цвет, а мембраны и некоторые внутриклеточные структуры - в красный. 2.3.1.3. Получение препарата хроматина Препарат ядер осторожно суспендировали в 2-3 объемах 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащего 0,25$ тритона Х-100 и 75 мМ NaCl , в гомогенизаторе Поттера со слабо пригнанным тефлоновим пестиком.

Освобождающийся при этом хроматин осаждали при 7 500 є в течение 10 минут и операцию повторяли еще раз. Далее препарат хроматина отмывали 2-3 раза от следов детергента и некоторых негисто-новых белков, суспендируя его в 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, содержащем 75 мМ НаС1 и 2 мМ ЭДТА, и переосаждали при тех же условиях. Полученный препарат хроматина использовали для дальнейших исследований. 2.3.1.4. Выделение ко-частиц_хроматина_ Кор частицы получали при обработке хроматина микрококковой нуклеазой ( I9Q. Полученный препарат хроматина суспендировали в 10 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,5 (A2gQ=I00) и добавляли к нему раствор 0,5 М СаСІ до концентрации I мМ, 100 мМ раствор ФМСФ до I мМ и микрококковую нуклеазу с активностью 6 000 ед/мл до конечной концентрации 120 ед/мл. Гидролиз нуклеазой проводили при +37С, при перемешивании. Время инкубации предварительно подбирали экспериментально (оно составляло обычно 40-45 минут). Реакцию останавливали добавлением 100 мМ раствора ЭДТА до концентрации 5 мМ и охлаждением до 0-2С. Гидролизат центрифугировали при 30 000 g в течение 10 минут, к супернатанту добавляли сахарозу до концентрации 6$, раствор 100 мМ ФМСФ до I мМ и наносили на колонку с сефарозой 6В (3,2x120 см), уравновешенную 10 мМ трис-HCI с 0,7 мМ ЭДТА, рН 7,5 ( 87). На колонку наносили препарат с общим содержанием ДНК 25-30 мг (500-600 ед A2gg). Элюцию проводили тем же буфером со скоростью 10-12 мл/час, собирая фракции объемом 5 мл. Количественное содержание ДНК во фракциях определяли по оптическому поглощению при 260 нм. Качественный состав ДНК во фракциях определяли методом электрофореза в геле 2% агарозы (см. раздел 2.4.2). Фракции, содержащие молекулы ДНК размером только 140-150 п.о., собирали и концентрировали до содержания ДНК 0,5 мг/мл (А2бд=ЗД) при помощи насадки для ультрафильтрации Immersible GX-10 (Millipore ) . Полученный препарат диализовали в течение 12 часов против 100-кратного объема 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, 0,7 ЭДТА. Из 100 г сырой массы выделяли кор-частицы с общим содержанием ДНК 2,5-3 мг. В ряде случаев интактные кор-частицы получали из гидролиза-та хроматина микрококковой нуклеазой методом препаративного электрофореза ДНП (см. раздел 2.3.6). Этот же метод использовали для дополнительной очистки кор-частиц после фракционирования на колонке с сефарозой 6В. 2.3.2. Выделение кор-частиц из ЭРИТРОЦИТОВ КУРИЦЫ 2.3.2.1. Получение препарата ядер_из .эритроцитов куржы__ Ядра из эритроцитов курицы получали с использованием детергента тритон Х-100 (196). От одной белой курицы после декапита-ции получали 70 мл крови. К полученной крови добавляли 15 мл 10$ цитрата натрия, рН 7,0, фильтровали через 4 слоя марли и осаждали эритроциты центрифугированием при 3 000g в течение 10 минут. Эритроциты 2 раза промывали в 80 мл 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, содержащего 0,ЬМ NaCl и 0,01 М цитрата натрия, и осаждали при тех же условиях. Эти и все последующие операции проводили при температуре +4С. Эритроциты лизировали в 80 мл 10 мМ трис-HGI, рН 7,5, содержащего 0,5% тритона Х-100 (объем/объем) и І мМ СаСІ. Лизис проводили в две порции по 40 мл в стеклянном гомогенизаторе Пот-тера с тефлоновим пестиком. Ядра осавдали из суспензии центрифугированием при 7 500 g в течение 10 минут, дважды промывали тем же буфером и переосаждали.

Осадок ядер эритроцитов три раза отмывали от следов детергента, суспендируя его в 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащем 0,15 М їїкбї , I мМ СаС12 и 0,34 М сахарозы (буфер В) и центрифугируя при 7 500g в течение 10 минут. Полученный препарат использовали для дальнейших исследований либо непосредственно после выделения, либо после хранения при температуре -20С в буфере В с 50$ глицерина (объем/объем). Препарат ядер, полученный из 70 мл крови, содержал около 200 мг ДНК. 2.3.2.2. Получение препарата хроматина,_лишенного_гистонов Н1_и_ - -Д5 _ Солюбилизированный препарат хроматина получали при обработке ядер микрококковой нуклеазой. С этой целью осадок ядер суспендировали при +37С в буфере В до концентрации ДНК около 10 мг/мл. К суспензии добавляли раствор 100 мМ ФМСФ в изопропаноле до конечной концентрации I мМ и микрококковую нуклеазу до конечной активности 15 ед/мл. Инкубацию проводили при постоянном перемешивании, в течение 3 минут, при +37С и останавливали реакцию добавлением 100 мМ раствора ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ. Ядра осаждали центрифугированием при 7 500g в течение 10 минут и дважды промывали полученный осадок буфером В, не содержащим иаохр. Осадок суспендировали в стеклянном гомогенизаторе со слабо пригнанным стеклянным пестиком в І мМ трис-НСІ, 2 мМ ЭДТА, pH 7,5 при концентрации ДНК 6 мг/мл. При этом происходил лизис ядер и солюбилизация хроматина. Гистоны HI и Н5 удаляли при помощи ионообменной смольгооетех 50W х2 ( 36). Для этого к I части препарата хроматина с содержанием ДНК 6 мг/мл добавляли 5 частей раствора следующего состава: 0,6 М NaCl и 0,06 М фосфата натрия, рН 7,0, и суспендировали выпадающий при этом осадок в стеклянном гомогенизаторе со слабо притертым пестиком. После нескольких ходов пестика осадок вновь солюбилизировался. К раствору добавляли ионообменную смолу Dowex 50W х2 (25$, объем/объем), предварительно отмытую последовательно 0,5 М HGI, 0,5 М NaOH и уравновешенную буфером, содержащим 0,5 М NaCl и 0,05 М фосфата натрия, рН 7,0. Суспензию выдерживали в течение I часа при +4С, при постоянном перемешивании. Затем смолу отделяли центрифугированием при I 000 g в течение 10 минут.

Аналитические методы исследования

Содержание ДНК в препаратах кор-частиц и солюбилизирован-ного хроматина измеряли по поглощению водного раствора при 260нм, принимая, что I мг/мл ДНК имеет Agn=22 (238). Содержание ДНК в препаратах ядер измеряли по оптическому поглощению раствора, содержащего 1% NaOH (раствор ДНК с концентрацией I мг/мл имеет А260=30)( 233. 2.5.2. Количественное определение содержания белка Содержание белка в препаратах ДНП определяли по модифицированному в нашей лаборатории методу Шаффнера и Вейсмана (188). Экстрагированные 0,25 н HCI гистоны или гистоны непосредственно в составе ДНП наносили в объеме 1-Ю мкл на поверхность мембранного фильтра "Сынпор" фирмы "Хемапол" с диаметром пор 0,4 мкм. Фильтр высушивали и помещали в 0,2$ раствор амидового черного 10В в 7% СНдСООН на 10 минут. Для обесцвечивания фона фильтр многократно отмывали 1% СН3СООН, водой и высушивали. Окрашенные пятна сорбированных белков вырезали пробочным сверлом диаметром 8 мм, помещали их в пробирки и заливали 2 мл элюирующего раствора, содержащего 50$ этанола, 25 мМ NaOH и 0,05 мМ ЭДТА. Через 10-15 минут измеряли оптическую плотность раствора при 630 нм против элюата из неокрашенного участка фильтра. Содержание белка определяли по калибровочному графику, построенному для суммарного препарата гистонов тимуса теленка. Чувствительность метода 1-30 мкг. Эксперименты по измерению скорости седиментации интактных и протеолизованных кор-частиц проводили на аналитической центрифуге Beckman Е , снабженной абсорбционной оптикой, работающей в области 260 нм. Скорость вращения ротора 48 000 об/мин при температуре +4С. Исследуемый препарат находился в одном из следующих буферов: в 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащем 0,7 мМ ЭДТА (буферБ1 ), в буфере 1 со 100 мМ NaCl ; в буфере F С 10 мМ ЫаС1 ; в буфере F с I мМ MgCL2 . Растворы MgCl2 и NaCl добавляли до нужной концентрации непосредственно перед проведением эксперимента. Образцы имели оптическую плотность A2gn=0,5. Коэффициент седиментации s c w определяли, строя график зависимостиim?=f (t) ( 4 ), где г - расстояние от ротора до границы седиментирующих частиц в см, a t - время, в минутах, по формуле: діпг Q s4c,w -At і.З-І ь ю9 Коэффициент седиментации приводили к стандартным условиям экспериментально, умножая полученное значение sg „ w на поправочный коэффициент о К = 20 c.w для кор-частиц, не подверг- пшхся действию трипсина. 4- c,W 2.5.4. Определение аминокислотного состава белков и пептидов Гидролиз белков и пептидов для определения аминокислотного состава проводили в основном по стандартным методикам ( 2 ). Образец (5-Ю мкМ) гидролизовали 5,7 н раствором HCI. Перед гидролизом в образец добавляли каплю 5% водного раствора фенола для предупреждения превращения остатков тирозина в 3-хлортирозин.

Гидролиз проводили в запаянных ампулах в течение 24 часов, а в некоторых случаях 72-х часов, при Ю5С. Гидролизат разбавляли бидистиллятом и упаривали в вакуумном эксикаторе или на роторном испарителе. Процедуру отмывки повторяли 6 раз. Для определения содержания метионина пробу белка перед гидролизом окисляли свежеприготовленной надмуравьинои кислотой, как описано у Дэвени и Гергей ( 9 ). Определение аминокислотного состава осуществляли на автоматических анализаторах "Biotronic V Durrum" и фирмы LKB . Аминокислотный состав белков и пептидов выражали в молярных процентах. Потери при гидролизе не учитывали. Все органические растворители, необходимые для реакции дансилирования и тонкослойной хроматографии, предварительно очищали и перегоняли. 2.5.5.1. Дансиліроваме_белков и пептидов_ Дансилирование белков и пептидов проводили по модифицированному методу Грэй и Хартли ( 86). Раствор белка или пептида (I нмоль) упаривали в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре, перерастворяли в 10-20 мкл 0,2 М NaHCO, , рН 8,3 и вновь высуживали. Сухой остаток растворяли в 10-20 мкл бидистил-лята и добавляли равный объем ДНС-С1 в ацетоне (10-кратный весовой избыток по отношению к весовому количеству свободных N Н2-груші). Реакцию дансилирования проводили при 37С в течение 30 мин. в темноте, затем реакционную смесь высушивали в вакууме. Для определения н-концевой аминокислоты обработанный ДНС-сі белок или пептид подвергали кислотному гидролизу. Для этого к пробе добавляли 30-40 мкл 5,7 н HGI, откачивали воздух из ампулы и гидролизовали при Ю5С ДНС-производные пептидов - 4 часа, ДНС-производные белков - 16 часов. После гидролиза кислоту удаляли в вакуумном эксикаторе, и остаток многократно промывали би-дистиллятом, затем опять высушивали. Сухой остаток растворяли в смеси ацетон-CHgCOOH (3:2) в концентрации I мкг/мкл и подвергали двумерной хроматографии. 2.5.5.2. Тонкослойная_хОматогріафия_дансильшх _ производных аминокислот Двумерную хроматографию дансильных производных аминокислот проводили на полиамидных пленках размером 30x30 мм (242).

Сначала осуществляли восходящую хроматографию в I системе, содержащей 1,5$ HC00H. Затем пластинку высушивали током теплого воздуха и хроматографировали в системе П: бензол-СНдСООН (9:1) в перпендикулярном направлении. Для лучшего разделения ДНС-Ala и ДНС-ИН2 , ДНС- Asp и ДНС-Glu , с -ДНС- His и ДНС-Arg + "ДНС-Lys проводили дополнительно хроматографию во втором направлении в Ш системе: этилацетат-метанол-СНдСООН (20:1:1)( 9 ). ДНС- Arg и Є-ДНС- Lys разделяли в ІУ системе: 0,05 М На,РО. -этанол (3:1), проводя хроматографию после системы П в том же направлении ( 9 ). Местоположение ДНС-аминокислот устанавливали по флюоресценции в УФ-свете. Идентификацию N -концевой аминокислоты проводили по совпадению положения пятен гидролизата с пятном, соответствующим стандартной ДНС-аминокислоте. С-концевую аминокислоту определяли с помощью карбоксипеп-тидазы В. 20 нМ гистона Н2В растворяли в 200 мкл 0,05 н триэтиламинокарбонатного буфера, рН 8,3-8,7 (рН буфера устанавливали, пропуская через него С0). К белку добавляли 40 мкл рабочего раствора фермента. Для приготовления рабочего раствора на каждые 8 мкл его исходного раствора добавляли 2,5 мл триэтиламинокарбонатного буфера 5 мМ соС12 . Реакционную смесь помещали в термостат на 37С и инкубировали 30 мин. и 4 часа. Реакцию останавливали добавлением перегнанной уксусной кислоты. Определение отщепленной С-концевой аминокислоты проводили дансильным методом с помощью двумерной хроматографии на полиамидной пленке. 2.5.7. Гидролиз гистона Н2В ТРИПСИНОМ Для протеолитического расщепления гистонов Н2В использовали кристаллический трипсин, который предварительно обрабатывали ингибитором химотрипсина - ТРСК по методу Карпентера (50 ). Полноту ингибирования химотрилсиновой активности в препарате трипсина проверяли по реакции его с синтетическим субстратом для химотрипсина - п-нитроанилидїЦ -бензоилфенилаланином. К раствору белка с концентрацией 2,5 мг/мл в 10$ растворе N -метилморфолина или 0,1 М растворе бикарбоната аммония (рН растворов 8,5-9,5) добавляли трипсин. Соотношение фермент:субстрат составляло 1:50. Полученную реакционную смесь инкубировали 2ча-са при 37С. После этого добавляли новую порцию фермента в том же соотношении и инкубировали еще 2 часа, а затем реакцию останавливали подкислением смеси перегнанной СНдСООН до рН 3-3,5. За время инкубации появлялся осадок, который удаляли центрифугированием, а затем 2-3 раза промывали буфером и отбрасывали. Полученные супернатанты объединяли и лиофилизировали. Полученные пептиды анализировали методом пептидных карт. 2.5.8. Метод пептидных карт в тонком слое целлюлозы В работе использовали модификацию метода пептидных карт, предложенную Франклином и Звейдлером (77,221 ).

Исследование процесса ограниченного протеолиза кор-частиц из Neurospora crassa

В разделе I.I.2 "Обзора литературы" обсуждались существующие в настоящее время представления о роли N и С-концевых доменов гистонов в поддержании структуры хроматина. N -концевые участки, обладая большой протяженностью и значительным положительным зарядом, могут быть ответственны за основные взаимодействия гистонов и ДНК в составе нуклеосом и хроматина. Ряд авторов, однако, показали для высших эукариотов, что и -концевые области гистонов не играют специфической роли на уровне кор-частиц, внося лишь электростатический вклад в поддержание их компактной структуры /6,19,35,87/. Возможно, более специфические функции этих частей, на которые косвенно указывает их эволюционный консерватизм, проявляются на более высоких уровнях организации хроматина или в ходе динамических процессов с его участием /35,87,144/. С целью выявить вклад различных участков молекул гистонов в поддержание компактности нуклеосом H crassa как представителя низших эукариотических организмов было проведено сравнительное изучение структурных переходов кор-частиц из N crassa и эритроцитов цыпленка при их ограниченном протеолизе. Для этого были определены скорости седиментации препаратов на разных стадиях протеолиза кор-частиц в растворах с различной ионной силой. Далее исследовали изменения в распределении продуктов переваривания кор-частиц ДЖазой I, которые сопровождают процесс ограниченного протеолиза Сем. раздел 3.5). 3.3.1. Электрофоретическое исследование гистонов проте олиз ованных к op-час тиц Обработку кор-частиц трипсином первоначально проводили при +4, поскольку при этой же температуре определяли скорость се-диментации интактных и протеолизованных кор-частиц и переваривали их ДНКазой I. Анализ интактных кор-частиц, выдержанных в течение 20, 40 и 60 минут при +37С, методом ДШ-электрофореза показал, что за это время не происходит изменений кор-частиц, связанных с увеличением температуры. Поэтому в дальнейшем с це- лью свести к минимуму время действия трипсина и его концентрацию при ограниченном протеолизе кор-частиц эксперименты проводили при +37. На рис. 12 представлены результаты электрофоретического разделения гистонов кор-частиц эритроцитов цыпленка в системе с ДЦС-Na при обработке кор-частщ трипсином.

Препараты (б) и (г) соответствуют препаратам TK-I и ТК-4, изученным в работе Григорьева /6,7,87/. В составе этих препаратов находятся продукты ограниченного протеолиза гистонов НЗ (РІ и Р6), Б2А (Р2) , Н2В (РЗ) и Н4 (Р4 и Р5), описанные ранее /32-34,229/. На основании результатов аминокислотного анализа белков препаратов ТК-І и ТК-4 Григорьевым было показано, что при ограниченном протеолизе низкомолекулярные продукты, соответствующие Я"-концевым участкам гистонов, удаляются даже при такой мягкой обработке, как диализ, в то время как центральные их участки сохраняются в составе кор-частщ (6,7,87/. При этом препарат ТК-І теряет около 1Ъ% массы белка, а препарат ТК-4 - около 22$ /6,7/. Результаты электрофоретического разделения гистонов интак-тных и протеолизованных кор-частщ хроматина из N»crassa представлены на рис. 13 и 14. Они позволяют заключить, что набор белковых фрагментов, накапливающихся в ходе ограниченного проте олиза нуклеосом гриба, сх-оден с продуктами протеолиза гистонов в кор-частщах эритроцитов цыпленка. Это свидетельствует о том, что участки молекул гистонов, которые сохраняются в составе кор-частщ, близки по молекулярной массе для двух сравниваемых объектов и что крупные пептиды протеолизованных кор-частщ гриба, по-видимому, также принадлежат центральным и С-концевым областям гистонов. Весьма существенным представляется тот факт, что гистоны в составе кор-частиц из N.crassa подвергаются действию трипсина при более низких (приблизительно в 4 раза), концентрациях фермента. С этим были связаны трудности в исследовании кор-частиц хроматина гриба. Так, если препарат кор-частиц в ходе его выделения не был в достаточной степени очищен от эндогенных про-теиназ, то набор гистонов соответствовал не интактному, а проте-олизованному препарату (препарату ж -I на рис. 16), а его коэффициент седиментации был ниже (I0,6s ), чем для интактных кор- частиц (11,6 s). Меньшая "стабильность" кор-частиц хроматина гриба выражалась также в том, что их гистоны протеолизовались при хранении при +4 гораздо быстрее, чем в кор-частицах эритроцитов цыпленка. С целью точного установления процесса протеолиза гистонов при обработке трипсином кор-частиц из iT. crassa было проведено двумерное электрофоретическое разделение гистонов интактных и протеолизованных кор-частиц. Необходимость постановки двумерного электрофореза объясняется тем, что количество выявляемых полос при электрофорезе с ДЦС-Na или в системе с мочевиной может не отражать точного числа белковых компонентов, так как интакт-ные гистоны и продукты их протеолиза могут иметь близкие элект-рофоретические подвижности в указанных системах. Как следует из данных, представленных на рис. 15 и 16, наиболее доступным действию трипсина является гистон БЗ, далее гидролизуются Б2А и Н4 и последним - гистон Н2В. Как отмечалось в обзоре литературы (раздел 1.1.2), в разных работах дается разная последовательность переваривания трипсином гистонов при ограниченном протеолизе нуклеосом и хроматина из высших эукариотов. В недавнем исследовании / 89 / было показано, что относительная подверженность гистонов протеолизу зависит от ионной силы раствора и присутствия либо отсутствия гистонов HI/H5. Так, для полинуклеосом при 5 мМ NaCl в отсутствии HI/H5 порядок переваривания кор-гистонов следущий: Н3 Н2А Н4 Н2В, но он меняется при увеличении концентрации NaCl до 80 мМ: Н3 -Н4 Н2А Б2В /89 /. Эксперименты по ограниченному протеолизу кор-частиц хроматина из Ni!crassa проводились в условиях низкой ионной силы (10 мМ трис-НСІ, 0,7 мМ ЭДТА, рН 7,5). Возможно, при увеличении концентрации NaCI до 80-100 мМ порядок протеолиза гистонов несколько изменится, но вероятнее всего наиболее чувствительным к трипсину останется гистон НЗ, а наименее чувствительным - Б2В. Как будет показано в следующем разделе, с расщеплением ги-стона Б2В связаны необратимые изменения в структурной организации кор-частиц хроматина из HVcrassa.

Выделение и характеристика кор-частиц хроматина из плесневого гриба NEUROSPORA CRASSA Ананьева Наталия Михайловна

Хроматин низших эукариотических организмов.

Препаративные методы

Аналитические методы исследования

Исследование процесса ограниченного протеолиза кор-частиц из Neurospora crassa

Похожие диссертации на Выделение и характеристика кор-частиц хроматина из плесневого гриба NEUROSPORA CRASSA