Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации Стародубова Елизавета Сергеевна

Содержание к диссертации

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1. Процесс деградации белков в клетке 10

2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков 16

1. Система убиквитинирования 16

2. Убиквитин-независимое направление белков в протеасому 19

3. 26S протеасома 20

4. 20S протеасома 20

5. 19S регуляторний комплекс или РА700 25

4. Иммунопротеасома 26

5. Локализация протеасом в клетке 28

6. Процессы, регулируемые убиквитин-протеасомнои системой 29

1. Транскрипция 29

2. Регуляция клеточного цикла 31

3. Роль процесса деградации белков в представлении антигена в комплексе
с молекулами МНС для узнавания Т-клетками 32

3. Представление антигенов в комплексе с МНС класса 1 32

4. Представление антигенов в комплексе с МНС класса II 35

4. ДНК-вакцины 37

5. Развитие технологии ДНК-вакцин 37

6. Механизм действия 38

7. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа 41

8. Стратегии усиления иммунного ответа на ДНК-вакцинацию 42

9. Терапевтическое применение ДНК-вакцин 44

10. Преимущества использования ДНК-вакцин 45

5. Обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека 48

11. Роль обратной транскриптазы в жизненном цикле ВИЧ 48

12. Свойства обратной транскриптазы ВИЧ 50

13. Лекарственная устойчивость обратной транскриптазы ВИЧ-1 52

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57

1. Материалы 57

2. Методы 59

1. Культивирование и хранение бактериального штамма 59

2. Культивирование, криоконсервация и хранение клеточной линии НЕК293 59

3. Трансфекция клеток линии НЕК 293 60

4. Определение времени полужизни белка методом с импульсным включением метки (pulse-chase) 61

5. Определение времени полужизни белка методом с остановкой трансляции циклогексимидом и последующим иммуноблотингом (cycloheximide-chase) 62

6. Определение концентрации белка по методу Брэдфорд 63

7. Клонирование фрагментов ДНК 63

8. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции 63

9. Электрофорез ДНК в агарозном геле 64

10. Выделение фрагментов ДНК из геля 64

11. Рестрикционный анализ ДНК 65

12. Лигирование фрагментов ДНК 65

13. Приготовление компетентных клеток Е.соН 65

14. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК 66

15. Выделение плазмидной ДНК 66

8. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ 70

9. Перенос белков из ПААГ на целлюлозную мембрану 70

10. Иммуноокрашивание мембраны 70

11. Создание генетических конструкций, использованных в работе.,.. 71

9. Векторные молекулы, содержащие ген обратной транскриптазы 71

10. Клонирование вектора pCIneoODC 72

11. Получение векторных молекул, кодирующих белок слияния ОТ-ОДК 74

12. Флуоресцентная микроскопия эукариотических клеток 74

13. Иммунизация мышей 76

14. Иммуноферментный анализ антител в сыворотке крови мышей.... 77

15. Выделение спленоцитов из селезенки мыши 77

16. Анализ спленоцитов иммунизированных мышей 78

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 80

1. Экспрессия в культуре клеток обратной транскриптазы дикого и
лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 80

1. Генетические конструкции 80

2. Содержание разных вариантов обратной транскриптазы в клетках НЕК293 82

3. Внутриклеточная локализация обратной транскриптазы 84

2. Деградация в клетках обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее лекарственно
устойчивой формы 86

4. Определение скорости деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетках 86

5. Изучение деградации на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 89

6. Оценка участия различных клеточных протеаз в деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 95

3. Искусственное усиление протеасомной деградации обратной
транскриптазы ВИЧ-1 97

3.1. Быстрая протеасомная деградация орнитиндекарбоксилазы в
клетках НЕК293 98

3.2. Деградация химерного белка обратная транскриптаза-
орнитиндекарбоксилаза 100

12. Дизайн конструкции 100

13. Время полужизни 100

14. Стабилизация ингибиторами протеасомы 104

3.3. Иммунизация мышей ДНК-вакцинными конструкциями, несущими
ген обратной транскриптазы ВИЧ-1 107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 115

ВЫВОДЫ 119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120

БЛАГОДАРНОСТИ 141

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

АПК - антигенпрезентирующая клетка

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

МНС - главный комплекс гистосовместимости

ОДК - орнитиндекарбоксилаза

о.е. - оптическая единица

ОТ - обратная транскриптаза

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол

dNTP - дезоксирибонуклеотид

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

Ig - иммуноглобулин

INF-y - интерферон-гамма

MQ - вода особой чистоты из установки "МШІ-Q"

NNRTI - ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы

NRTI -нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы

PMSF - фенилметансульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

TRITC - тетраметил(родамин)изотиоцианат

Введение к работе

Деградация белков - один из важнейших механизмов регуляции клеточных процессов. Известно, что большинство внутриклеточных белков разрушается на 26S протеасоме. Протеасомная деградация вовлечена в контроль таких клеточных процессов как дифференцировка, онкогенез, апоптоз, клеточный цикл, деление, репарация ДНК, реакция на стрессовые воздействия и иммунный ответ.

Важная роль протеасомы состоит в образовании эпитопов, представляемых на поверхности клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I. Такие комплексы распознаются CD8+ Т-клетками, которые участвуют в образовании клеточного иммунного ответа. Именно эта функция протеасомы привлекает большое внимание исследователей, создающих вакцины нового поколения.

В настоящее время активно разрабатывается стратегия вакцинации против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на основе белков вируса и их генов. Одним из них является обратная транскриптаза ВИЧ, синтезирующая ДНК-копию одноцепочечного РНК-генома вируса. Синтез ДНК-копии генома ВИЧ - один из ключевых этапов жизненного цикла вируса, что делает обратную транскриптазу одной из основных мишеней действия антиретровирусных препаратов и вакцин. Применение антиретровирусных препаратов приводит к появлению штаммов вирусов, устойчивых к лекарствам, прежде всего за счет мутаций в гене обратной транскриптазы. В совокупности это указывает на необходимость создания вакцин, индуцирующих иммунный ответ, направленный на обратную транскриптазу как диких, так и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ.

Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против ВИЧ весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. В самом простом варианте ДНК-вакцина представляет собой плазмидный вектор, содержащий ген белка патогена и элементы, необходимые для транскрипции этого гена. При введении ДНК-вакцины реципиенту в клетках происходит синтез закодированного белка, который активирует иммунную систему.

Несмотря на то, что обратная транскриптаза является столь привлекательной мишенью для индукции ВИЧ-специфического иммунного ответа, ее экспрессия и деградация в клетке до сих пор мало изучены. Данные о протеолизе обратной транскриптазы ВИЧ, имеющиеся в литературе, косвенные и противоречивые. Поэтому для разработки ДНК-вакцин на основе генов обратной транскриптазы диких и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ особенно необходима информация о синтезе и деградации этого белка в клетке.

Используемые на сегодняшний день ДНК-вакцины имеют сравнительно низкую иммуногенность, в связи с чем ведется разработка различных подходов по повышению их эффективности. Одним из таких молекулярно-биологических подходов является модификация генов ДНК-вакцины, направляющая кодируемый этим геном белок в протеасому. Благодаря ускорению деградации на протеасоме, возможно увеличение презентации эпитопов и повышение уровня Т-клеточного ответа. Таким путем были успешно модифицированы ДНК-вакцины, несущие антигены некоторых патогенов. До сих пор подобные исследования для обратной транскриптазы ВИЧ не проводились. Следует отметить, что наличие специфического Т-клеточного ответа на обратную транскриптазу обнаружено у пациентов с длительным периодом непрогрессирующей ВИЧ-инфекции. Поэтому повышение иммуногеніюсти ДНК-вакцины на основе гена обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ представляет большой теоретический и практический интерес.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования было изучение деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 и направление обратной транскриптазы по протеасомному пути деградации для повышения иммуногенности ДНК-вакцинной конструкции, созданной на основе ее гена. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: - определить время полужизни обратной транскриптазы дикого и лекарственно- устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетке; установить участие различных протеаз клетки в деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1; увеличить скорость деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 на протеасоме; в опытах по ДНК-иммунизации мышей изучить иммуногенность ДНК-вакцинной конструкции, созданной на основе гена модифицированной обратной транскриптазы ВИЧ-1 с усиленной протеасомной деградацией.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Процесс деградации белков в клетке

Баланс синтеза и деградации белков необходим для нормальной жизнедеятельности клетки. Однако долгое время большее предпочтение отдавалось исследованиям, посвященным синтезу белков: его активации и эффективности. В регуляции клеточных процессов образование белка рассматривалось в качестве единственного определяющего фактора, тогда как деградация воспринималась как вспомогательный процесс. В течение многих лет, протеолиз считался неселективным процессом, затрагивающим, в основном, белковый обмен и элиминирование белков с нарушениями. Важность деградации белков как механизма, ответственного за регуляцию содержания белков в клетках, признали только в 90-е годы прошлого века (Hershko and Ciehanover, 1998). В настоящее время деградация белков в клетке активно изучается и появляется множество работ, демонстрирующих его роль в различных клеточных процессах (Ciehanover, 2005; Tardy et al., 2006).

В эукариотической клетке существуют две основные системы протеолиза белков - это энодосом-лизосомная и АТР- и убиквитин-зависимая протеасомная системы (Рис. 1). В общем случае, в лизосоме деградируют белки, поступившие в клетку экзогенным путем, а на протеасоме - эндогенные белки. Лизосомы были открыты в 1953-1955 г. Де Дюв и коллегами, за что он позже был награжден Нобелевской премией (De Duve et al., 1953; Gianetto and De Duve, 1955). Лизосомы являются цитоплазматическими органеллами, имеющими кислую среду (рН 4,5) и одинарную мембрану. Они присутствуют во всех типах клеток, за исключением эритроцитов. В лизосомах содержится более пятидесяти ферментов, которые способны разрушать белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Активация ферментов происходит в кислой среде. Лизосомные кислые гиролазы представляют собой различные протеазы, нуклеазы, гликозидазы, сульфотазы и липазы. Основной класс лизосомных

Рис. 1. Основные пути протеолиза в эукариотической клетке (Mayer, 2000)

Две основные системы деградации белков эукариотической клетки: эндосом-лизосомная и убиквитин-протеасомная. Преимущественно в лизосоме разрушаются экзогенные белки, а на протеасоме - эндогенные белки. протеаз - катепсины. По каталитически активному аминокислотному остатку в активном сайте они разделяются на три подгруппы: цистеиновые, аспартатные и сериновые. Субстраты поступают в лизосому при эндоцитозе и автофагии (Рис. 2). Бактерии и экзогенные белки при фаго- и пиноцитозе захватываются в вакуоли (эндосомы), которые затем сливаются с пузырьками, содержащими лизосомные ферменты (Stuart and Ezekowitz, 2005). Затем рН закисляется, что приводит к активации ферментов, которые расщепляют экзогенный субстрат. Для разрушения органелл клетки (макроавтофагии) мембрана, отделившаяся от эндоплазматического ретикулума, окружает органеллу и формирует пузырек, который затем сливается с лизосомой (Dunn et al., 1994). Лизосомой могут захватываться также и некоторые внутриклеточные белки (микроавтофагия) и разрушаться в ней (Henell et al., 1987). Показано, что лизосома играет важную роль в таких клеточных процессах, как презентация эпитопов в составе главного комплекса гистосовместимости класса II, ресорбция в костной ткани, прогрессия опухолей и программированная клеточная смерть (Dell'Angelica et al., 2000).

Большинство белков ядра и цитоплазмы эукариотических клеток деградирует по АТР- и убиквитин-зависимому протеасомному пути (Rock et al., 1994). Первые сообщения об обнаружении АТР-зависимой протеазы относятся к концу 70-х гг (Ciechanover et al., 1978; DeMartino and Goldberg, 1979). В конце 80-х годов был выделен комплекс, обладающей АТР-зависимой протеолитической активностью (Hough et al., 1986, 1987), для которого позже Танака и Голдберг предложили термин «протеасома» (Arrigo et al., 1988). В это же время появлялись работы, в которых было описано обнаружение убиквитина (Schlessinger et al., 1975). Гершко и Цихановером было показано, что присоединение молекул убиквитина к белку-субстрату способствует деградации этого субстрата. Был выявлен каскад реакций и ферменты, присоединяющие убиквитин (Hershko et al, 1983), а затем показана специфическая деградация убиквитинированных субстратов АТР-зависимой протеазой (Hershko et al., 1984). В 2004 г Цихановер, Гершко и Роуз были экзогенные белок комплекс рецептор-лиганд плазматическая мембрана ! _ "в *

Цігтозоль і с о , V о о і \эндвцнтоз о* Пинвцнтоз

ПОЗДНЯЯ эндосома митохондрия

Рис. 2. Лизосомная система деградации (Ciehanover, 2005)

Лизосомная система представляет собой вакуолярную систему, содержащую различные гидролизующие ферменты, которые функционально активны только в кислой среде. Ее мембрана отделяет ферменты от цитоплазмы, что необходимо для защиты клеточных белков от их действия. Экзогенные белки направляются в лизосому рецептор-опосредованным пиноцитозом, экзогенные частицы фагоцитозом (гетерофагия). Эндогенные белки и клеточные органеллы поступают при микро- и макроавтофагии. удостоены Нобелевской премии по химии за «открытие опосредованной убиквитином деградации белков». Убиквитин-протеасомный путь деградации белков включает в себя сложную систему узнавания и направления белков-субстратов в протеасому и специфическую деградацию. Все компоненты этой системы могут тонко регулироваться. На протеасомном пути есть два ключевых этапа. Первый - это узнавание и мечение белка-субстрата. Сигналом направления белка в протеасому является присоединение молекул убиквитина. Эту функцию в клетке осуществляет сложная система убиквитинирования (Hershko and Ciechanover, 1998). Второй этап, это собственно протеолиз субстрата. В эукариотических клетках его осуществляет 26S протеасома -огромный мультисубъединичный комплекс с несколькими каталитическими активностями (Coux et al., 1996). Протеасомная система деградации вовлечена в регуляцию транскрипции, контроля качества синтезируемых белков, передачи сигнала, представления антигенов, клеточного цикла, апоптоза и опухолевых заболеваний (Mayer R.J., 2000).

При изучении двух путей деградации исследовали их соотношение для белков клетки. С помощью ингибиторов было показано, что в клетках млекопитающих 80-90% белков деградирует по протеасомному пути, тогда как блокирование лизосомы действует только на 10-20% белков (Rock and Goldberg, 1999). Поэтому при изучении внутриклеточных белков особое внимание необходимо уделять именно протеасомному пути деградации.

Роль протеасомной деградации в процессах клетки активно изучается. Проведены исследования, позволившие количественно определить общий баланс синтеза и протеасомной деградации внутриклеточных белков. Очевидно, что синтез белка и деградация должны быть сбалансированы в клетке. Были изучены скорости синтеза и деградации белков, содержание рибосом и протеасом в L-K^b клетках мыши (Таблица). Показано, что для поддержания уровня белков в клетке (2.6 х 10⁹ белков) 6 х 10⁶ рибосом синтезирует 4 х 10 белков в мин. Каждая из 8 х 10⁵ протеасом клетки деградирует 2.5 субстрата в мин.

Таблица. Баланс синтеза и деградации внутриклеточных белков в L-K клетках мыши (Princiotta et al., 2003)

Таким образом, процессы деградации белков не менее важны для клетки, чем процесс синтеза. В этой связи необходимы исследования деградации белков, в особенности протеасомной, дополняющие и расширяющие недостаточные знания о свойствах, функционировании и роли этого жизненно важного внутриклеточного процесса.

2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков

2.1. Система убиквитинирования

Для правильного узнавания белка для деградации на протеасоме в эукариотической клетке существует специальная убиквитин-конъюгирующая система (Hershko and Ciehanover, 1998). Для направления в протеасому белок должен получить специальную метку - молекулу убиквитина. Убиквитин - это небольшой полипептид, состоящий из 76 аминокислотных остатков (Wilkinson et al., 1980). Присоединение убиквитина осуществляется в каскаде реакции (Рис. 3). В нем принимают участие три основных типа ферментов - это убиквитин-активирующий (Е1), убиквитин-конъюгирующие (Е2) и убиквитин-лигазы (ЕЗ) (Pickart, 2001). Кроме того, существуют и деубиквитинирующие ферменты.

Высокая специфичность и селективность системы убиквитинирования достигается за счет строгой иерархичности действия ферментов. На первом шаге Е1 фермент осуществляет присоединение 76-го остатка глицина молекулы убиквитина к остатку цистеина убиквитин-активирующего фермента с образование тиоэфирной связи, при этом затрачивается энергия молекулы АТР (Ciechanover et al., 1981). Следует отметить, что в клетке существует только один фермент класса El (Zacksenhaus and Sheinin, 1990).

На втором шаге активированный убиквитин переносится на цистеиновый остаток активного сайта убиквитин-конъюгирующего фермента (Hershko et al., 1983). В отличие от Е1, ферменты Е2 в клетке не единичны. Так, у дрожжей имеется 13 генов, кодирующих Е2-белки, а у высших эукариот их число значительно выше. Ферменты Е2 имеют ядро из 150 аминокислот и специализированный N- или С-концевой домены, отвечающие за специфичность взаимодействия с ЕЗ ферментами (Pickart, 2001).

Третий шаг катализируется убиквитин-лигазами ЕЗ и представляет собой перенос убиквитина с Е2 на белок-мишень. В этом процессе происходит образование изопептидной связи между С-концевым глицином убиквитина и е-

,,Г ЇЖ Пептиды

Деградация «Ц~*_э « * / Деубнквитнннровамие

1 <^^,V'^,V*"'VS ' f ^ о _/ ^W ATT ADP ГІЬ О L*bQ AT? MP

26S протеасомз ф ^ .В.

Присоединение Ub j&.-O

Активация Ub

Белок-мишень _4,

Рис. 3. Схема ATP- и убиквитин-зависимого протеасомного пути деградации белков (Voges et al., 1999) аминогруппой лизина субстрата (Hershko et al., 1983). Именно ферменты ЕЗ ответственны за специфическое узнавание белка-мишени. ЕЗ-ферменты представляют собой как индивидуальные белки, так и комплексы. Соединение ЕЗ с субстратом может происходить как непосредственно, так и через вспомогательный белок. В клетке существует большое число ферментов этого класса. На основании структуры их каталитических доменов среди них можно выделить три основных семейства: содержащие RING-finger (Really Interesting New Gene), HECT (Homologous to Txe E6-AP COOH Terminus) и U-box домены (Glickman and Ciechanover, 2002). Однако молекулярные механизмы работы убиквитин-лигаз еще сравнительно мало изучен (Pickart, 2001).

После присоединения первой молекулы убиквитина к белку-субстрату цепь из молекул убиквитина последовательно наращивается. Присоединение следующих активированных молекул убиквитина происходит при образовании связи между С-концевым глицином нового убиквитина и 48-мым лизином предыдущего (Chau et al., 1989). Такие полиубиквитинированные белки являются основными субстратами 26S протеасомы.

В клетке находится большой пул убиквитина, который присоединяется к белкам-мишеням для их направления в протеасому. После присоединения субстрата к протеасоме, полиубиквитиновые цепи не деградируют вместе с ним, а рециклизуются (Weissman, 2001). Так, в клетке существуют специальные деубиквитинирующие ферменты (DUBs) (Wilkinson, 1997). DUB - это цистеиновые протеазы, разрушающие эфирную, тиоэфирную и амидную связи, образованные С-концевым глицином убиквитина. Деубиквитинирующие ферменты, действующие на связь между Б-аминогруппой лизина белка и убиквитином, называются также изопептидазами. Деубиквитинирующие ферменты представлены двумя семействами: UCH (Ub carboxyl-terminal hydrolases) и UBP (Ub-specific processing proteases). Деубиквитинирующие активности ферментов можно разделить на несколько типов (D'Andrea and Pellman, 1998), Первый тип отвечает за укорочение полиубиквитиновой цепи, связанной с белком-субстратом, с дистального конца. Второй тип вызывает освобождение полиубиквитиновой цепи от белка-субстрата во время или после его деградации. Третий тип связан с расщеплением свободной полиубиквитиновой цепи до мономерных молекул убиквитина. Деубиквитинирующей активностью обладают компоненты 19S регуляторного комплекса и индивидуальные ферменты, которые могут быть ассоциированы с протеасомои или находиться в свободном состоянии. Следует отметить, что деубиквитинирующая активность необходима не только для рециклизации молекул убиквитина, но и для в контроля направления белков в протеасому. Ошибочно убиквитинированный субстрат может быть деубиквитинирован и тем самым спасен от разрушения (Glickman and Adir, 2004),

2.2. Убиквитин-независимое направление белков в протеасому

Интересно отметить, что для деградации некоторых белков не требуется убиквитинирование (Orlowski and Wilk, 2003). Первым найденным белком такого типа была орнитиндекарбоксилаза (ОДК). Ее деградация зависит от АТР и белка-антизима (Rosenberg-Hasson, et al 1989; Murakami et al., 1992). С-конец антизима осуществляет связывание с N-концевой частью ОДК, при этом ОДК направляется в протеасому, а сам антизим не разрушается. Помимо сайта связывания антизима, находящегося на N-конце ОДК, в С-концевой части находятся два сигнала деградации (PEST-сигнал) (Hayashi et al., 1996). PEST-сигнал представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности, обогащенной пролином (Р), глутаминовой кислотой (Е), серином (S) и треонином (Т) (Rogers et al., 1986). В экспериментах на делиционных мутантах ОДК установлено, что 37 концевых а. о. особенно необходимы для быстрой деградации ОДК на протеасоме (Muracami et al., 2000). Показано, что связывание ОДК с протеасомои осуществляется за счет этого региона.

Помимо ОДК убиквитин-независимая протеасомная деградация показана для белка c-Jun (Jariel-Encontre et al., 1995), кальмодулина (Tarcsa et al., 2000), тропонина С (Benaroudj et al., 2001), ингибитора циклинзависимой киназы p21^CipI (Sheaff et al., 2000) и опухолевого супрессора р53 (Asher et al., 2002).

2.3. 26S протсасома

Центральное место в системе деградации по эндогенному пути занимает 26S протеасома, которая осуществляет специфическую АТР-зависимую деградацию полиубиквитинированных субстратов (Coux et al,,1996; Voges et al., 1999). В эукариотических клетках протеасома представляет собой 2,5 МДа мультибелковый комплекс, состоящий из - 31 различных субъединиц. С помощью электронной микроскопии было показано, что этот комплекс имеет гантелеобразную симметричную структуру длиной около 45 нм и шириной 20 нм (Рис. 4). 26S частица состоит из центральной коровой 20S субчастицы, обладающей протеолитической активностью, и двух регуляторных 19S субчастиц (19S-20S-19S).

2,3,1. 20S протеасома

2.3.1.1. Структура и сборка коровой субчастицы

По данным рентгеноструктурного анализа 20S протеасома представляет собой полый цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм (Рис. 5) (Groll et al., 1997). Эта структура построена их четырех колец, лежащих друг на друге, каждое из которых образовано семью белковыми субъединицами с молекулярной массой от 20 до 35 кДа. Полная масса 20S частицы составляет около 750 кДа (Bochetler et al, 1999). Внешние кольца сформированы субъединицами а-типа, а внутренние - р. Внутренний канал коровой частицы имеет три расширения - камеры: большую - центральную камеру, сформированную р-субъединицами, и две меньшие - между а- и Р-кольцами, расположенные по краям частицы.

890kD«a 720 kDa

Регуляторний І Іроч'солитический WQkDa

КОМШИЖ основание крышки

комплекс крышка основание ^а*

15 nm

Рис. 4. Схематическое изображение трехмерной структуры 26S протеасомы дрозофилы (Walz et al., 1998)

26S протеасома состоит из 20S протеолитического комплекса и двух 19S регуляторных комплексов. В структуре 19S комплексов вьщеляют основание и крышку.

A.

-148 A -75-115 A

Рис. 5. Строение 20S протеасомы (А). Поверхность протеасомы, изображенная с разрешением 1нм, аир субъединицы составляют внешние и внутренние кольца соответственно (Voges et al., 1999). (Б). Продольный срез протеасомы, демонстрирующий внутренний канал с тремя полостями (Groll et al., 1997). Кружками отмечены активные центры.

Похожие диссертации на Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации

Молекулярно-эпидемиологический анализ вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), циркулирующих в России, 1987-2003 гг. Казеннова Елена Валерьевна

Механизмы активации и регуляции инозитол (1,4,5) - трисфосфат - активируемых кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431Киселев, Кирилл Игоревич

Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии ДюшеннаКиселев Антон Вячеславович

Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна Киселёв Антон Вячеславович

Исследование стабильности ДНК и ее комплексообразования с остаточными примесными белками с целью создания эффективных методов выделенияЕгорова, Валентина Петровна

Роль цитокинов в репликации ВИЧ - 1 и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ - инфекцииДунаев Павел Дмитриевич

Эпидемиологическое маркирование изоляторов ВИЧБочкова, Марина Сергеевна

Гинекологические заболевания у вич-инфицированных больных (клинико-лабораторные особенности, принципы диагностики и лечения)Гафуров Юсиф Тофикович

Особенности функционирования и регуляции Ca#22+#1-активируемых калиевых каналов эритроцитов у больных сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензиейКремено Светлана Владимировна

Регуляция плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина в плазматической мембране фибробластов человекаЧернюк, Наталья Николаевна