Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
Понятие о хромосомных территориях 7
Позиционирование и границы хромосомных территорий 8
Механизмы формирования хромосомных территорий 14
Позиционирование генов внутри XT 21
Компьютерное моделирование XT 28
Общая картина функциональной архитектуры ядра 29
Заключение 32
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
Культивирование клеточных линий 33
Выделение ДНК из клеток человека 33
Полимеразная цепная реакция 34
Клонирование продуктов ПЦР 35
Лигирование 36
Получение компетентных клеток E.coli 36
Трансформация компетентных клеток E.Coli. и скрининг колоний 37
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) 37
Приготовление препаратов фиксированных клеток 37
Приготовление препаратов ядерных матриксов in situ 38
Синтез пробы 39
Гибридизация с центромерными пробами 39
Гибридизация с пробой к Xist РНК 41
Совместная гибридизация с пробой к Xist РНК и к центромере Х-хромосомы 41
Компьютерная обработка изображений 42
Статистический анализ данных 43
Анализ способности фрагментов а-сателлитных повторов связываться с
ядерным матриксом in vitro 45
Выделение ядерного матрикса 45
Получение радиоактивно меченых фрагментов ДНК 46
Анализ связывания фрагментов с ядерным матриксом 47
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48
1. Роль ядерного матрикса в поддержании специфической пространственной
организации хромосом в интерфазе клеточного цикла 48
Специфичные а-сателлитные повторы в центромерных участках хромосом - удобный маркер хромосомной территории 50
Анализ расположения центромер хромосом X и 19 в ядрах первичных фибробластов человека 51
Получение препаратов ядер, частично лишенных ДНК 54
Характерные радиальные позиции центромер хромосом X, 19 и 1 поддерживаются ядерным матриксом 57
Дополнительное удаление РНК не влияет на радиальные позиции центромерных участков в препаратах ядерного матрикса 61
Альфоидные сателлиты, специфичные для хромосом X и 19,
не являются участками прикрепления к ядерному матриксу 64
2. Анализ пространственного распределения хромосом в ядрах первичных
фибробластов человека с полисомией по Х-хромосоме 68
2.1. Положение Х-хромосом внутри ядра изменяется при появлении
дополнительных копий этой хромосомы 69
Хромосомные территории активных и неактивных копий Х-хромосомы характеризуются разными радиальным позициями в генотипом XXXXY
Сравнение локализации хромосомы 1 в ядрах нормальных фибробластов и фибробластов с полисомией по Х-хромосоме
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол
DMEM модифицированная Дульбекко среда Игла
(Dulbecco's modified Eagles medium)
FISH флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescent in situ hybridization)
FITC флуоресцинизотиоцианат (fluorescinisothiocyanat)
FRAP восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания
(fluorescence recovery after photo bleaching)
GFP зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein)
ICD межхроматиновый домен (interchromatin domain)
MAR участок прикрепления к ядерному матриксу (matrix attached region)
PBS фосфатно-солевой буфер
PMSF фенилметилсульфонилфторид
Xist специфичный для неактивной Х-хромосомы транскрипт
(X (inactive)-specific transcript)
БСА бычий сывороточный альбумин
ДМСО диметилсульфооксид
МН микрококковая нулеаза
МНС главный комплекс гистосовместимости
(major histocompatibility complex)
о.е оптические единицы
п.н., т.п.н пар нуклеотидов, тысяч пар нуклеотидов
ГЩР полимеразная цепная реакция
Ха/Хн активная/неактивная Х-хромосома
XT хромосомная территория
ЯМ ядерный матрикс
Введение к работе
В последнее время фокус исследований, посвященных принципам регуляции экспрессии генов, смещается от детального анализа молекулярных механизмов, контролирующих активность отдельных генов, к глобальному изучению общей картины структурно-функциональной организации генома в пространственном и временном отношении. Становится все более и более очевидным, что слаженное и оперативное функционирование генома не может обеспечиваться только регуляторными элементами, присутствующими в линейной ДНК. Огромную роль в регуляции экспрессии генов и реализации генетических программ играют эпигенетические механизмы (метилирование ДНК, модификации гистонов, замещение нормальных гистонов на их вариантные формы) и пространственная организация клеточного ядра. Активное развитие микроскопии и усовершенствование экспериментальных подходов позволили установигь, что внутреннее пространство ядра - это не беспорядочная смесь различных составляющих, а четко структурированная система, отдельные компоненты которой связаны друг с другом сложными иерархическими взаимоотношениями.
Хромосомы на любой стадии клеточного цикла представляют собой более или менее компактные структуры, занимающие отдельные не перекрывающиеся друг с другом области ядерного пространства, получившие название хромосомных территорий (XT). Хромосомные территории - не просто способ компактной упаковки больших объемов хроматина в ограниченном ядерном пространстве, но и, главным образом, аппарат, наилучшим образом приспособленный для обеспечения слаженного функционирования генома. Динамичная структура хромосомных
территорий обеспечивает доставку нужных генов к системам транскрипции, репарации и сплайсинга, в то время как неактивные гены остаются компактно упакованными во внутреннем пространстве хромосомной территории. Локализация генов внутри хромосомной территории, взаимное расположение хромосомных территорий и позиционирование их относительно центра ядра имеют важное значения для проявления активности тех или иных генов.
Хотя последние в последние 15 лет принципы организации хромосомных территорий очень активно изучались, многое еще остается непонятным. Так, согласно многочисленным наблюдениям локализация XT внутри ядра определенным образом связана с генной плотностью. Но общие закономерности, определяющие позицию каждой XT, пока остаются мало понятными. Да и сами структуры и механизмы, обеспечивающие целостность и надлежащую организацию хромосомных территорий, неизвестны до сих пор.
Настоящая работа посвящена исследованию роли ядерного матрикса в поддержании упорядоченной пространственной организации хромосом в интерфазе клеточного цикла, а также изучению нарушений этой организации, возникающих при появлении дополнительных копий Х-хромосомы.
