Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы «Пост-транскрипционное редактирование мРНК» 12
1.1. Виды редактирования 12
1.2. Трипаносомы - возбудители сонной болезни 15
1.3. Особенности клеточной структуры и генома трипаносом 19
1.4. Эволюция редактирования РНК 21
1.5. РНК, направляющие редактирование мРНК 22
1.6. Механизм редактирования - модели ранние и модель современная 24
1.7. Ферменты, катализирущие редактирование мРНК в трипаносомах, образуют комплекс 29
1.8. Идентификация компонентов ферментативного комплекса редактирования 32
1.9. Циклы U-делеции и U-вставки 34
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Реактивы 37
2.2. Ферменты 39
2.3. Изотопы 40
2.4. Материалы 40
2.5. Матрицы, использованные в реакциях ПЦР 40
2.6. Олигонуклеотиды и олигорибонуклеотиды 41
2.7. Линия трипаносом 42
2.8. Среда и условия выращивания Т. brucei 43
2.9. Антитела для иммуноблотинга 44
2.10. Растворы 44
2.11. Методы 45
2.11.1. Выделение митохондриального экстракта из Т. brucei и его дальнейшая очистка 45
2.11.2. Конструирование плазмид для трансформации 45
2.11.3. Проведение трансформации 46
2.11.4. Характеристика экстрактов с помощью Норзерн и Вестерн блот анализов 47
2.11.5. Получение мРНК и гРНК 48
2.11.6. Мечение и секвенирование полученных РНК 49
2.11.7. Полный цикл реакций редактирования 50
2.11.8. Анализ «затравленного» удлинения праймера 51
2.11.9. Анализ двух первых стадий в обоих циклах редактирования 51
2.11.10. Подтверждение формирования дуплекса между мРНК и гРНК 52
2.11.11. Предрасщепленный анализ редактирования 52
2.11.12. Проведение анализа аденилирования 53
2.11.13. Количественный анализ 54 Глава 3. Результаты и обсуждения 55
3.1. Критичные элементы гРНК для редактирования мРНК 57
3.2. Функции РНК-лигаз комплекса редактирования 65
3.3. Ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования 73
3.3.1. DREL может функционировать в процессе U-вставки 73
3.3.2. Фермент U-вставки (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении UTP 76
3.4. Заключение 90
Выводы 94
Список публикаций 95
Благодарности 97
Список цитируемой литературы 98
- Особенности клеточной структуры и генома трипаносом
- Ферменты, катализирущие редактирование мРНК в трипаносомах, образуют комплекс
- Характеристика экстрактов с помощью Норзерн и Вестерн блот анализов
- Фермент U-вставки (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении UTP
Введение к работе
Открытие в конце 80-х годов редактирования РНК еще раз заставило изменить наши взгляды на реализацию генетической информации в клетке, постулированной Уотсоном и Криком, где закодированная в ДНК информация транскрибируется в РНК, которая в свою очередь транслируется в функциональный белок. Редактированием РНК (editing) называются изменения в последовательности РНК на посттранскрипционном уровне. В настоящее время, РНК-редактирование рассматривается, как сложный процесс генной экспрессии, с помощью которого организм может увеличить число синтезируемых белков без увеличения числа генов в геноме (Simpson, L. и Shaw,J., 1989).
При изучении экспрессии гена цитохром оксидазы, а именно субъединицы II в трипаносомах, было впервые замечено, что последовательность РНК, соответствующая этому гену, не совпадает с кодирующей ее ДНК (Benne et al., 1986). С тех пор процессы редактирования были обнаружены у разных эукариот. Редактированию подвергаются РНК разного типа: матричные, транспортные, рибосомальные (Backus et al, 1992; Stuart et al., 1997; Одинцова M.C., Юрина Н.П., 2000; Masanori Kugita et al, 2003; Flomen et al, 2004). Те гены, РНК которых проходят через процесс редактирования, называются криптогенами (Simpson, L. и Shaw, J., 1989). Некоторые транскрипты криптогенов подвергаются лимитирующей модификации последовательности, другие - подвергаются такому массивному изменению, что их кодирующая последовательность становится очевидной только после редактирования.
Целью настоящей работы являлось исследование пост-транскрипционного механизма редактирования мРНК в митохондриях Т. brucei на примере
редактирования пре-мРНК субъединицы-6 аденозинтрифосфатазы (А6). В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
Изучить, какие элементы гРНК являются критичными для эффективности процессов редактирования мРНК.
Определить роль белков IV и V основного ферментативного комплекса в обоих циклах редактирования пре-мРНК как при вставке так и при удалении U-нуклеотидов.
3. Выяснить состоит ли комплекс редактирования из двух физически
отдельных субкомплексов, ответственных за катализ либо U-вставки, либо U-
делеции, и происходит ли перекрывание ферментативных активностей между
двумя отдельными активными центрами комплекса, если таковые существуют.
Актуальность представленной работы, прежде всего, заключается в том, что изучение процесса редактирования мРНК поможет прояснить тонкие механизмы созревания РНК в клетке.
Особенности клеточной структуры и генома трипаносом
Несмотря на то, что Leishmania и трипаносомы являются эукариотами, эти организмы проявляют некоторые характеристики прокариот, например: гены без интронов или полицистронная организация генов (Decker, Sollner-Webb, (1990). Интересно то, что регуляция экспрессии генов у трипаносом в основном происходит постгранскрипционно, что в течение длительного времени затрудняло обнаружение промоторов для РНК-полимеразы II (Gilinger, Bellofatto, 2001; Das, Bellofatto, 2003).
В ядре эукариот пре-мРНК проходят через цис-сплайсинг, когда интроны удаляются, а два экзона, расположенные на одной цепочке пре-мРНК, сшиваются, образуя функциональный транскрипт. В трипаносомах механизм цис-сплайсинга используется очень редко (Mair et al., 2000), в этих огранизмах получение зрелой мРНК происходит путем транс-сплайсинг. В этом случае функциональная мРНК также состоит из двух экзонов, но они закодированы в разных генах (Borst, 1986). Первый экзон является идентичным для всех РНК и называется сплайсирующим лидером (spliced leader, SL) или миниэкзоном (Milhausen et al., 1984; McNally, Agabian, 1992).
20 больших хромосом и около 100 минихромосом составляют ядерный геном Т. brucei (Hajduk et al., 1992). Большинство кодирующей информации расположено на больших хромосомах, тогда как минихромосомы играют роль доноров VSG белков (Alsford et al., 2001). Количество хромосом у Т. brucei остается неизменным как в проциклической форме, так и в кровяной форме развития. Тем не менее, существуют специфические различия между этими двумя жизненными формами трипаносоматидов. Например, одной из важных характеристик трипаносом, развивающихся в крови млекопитающего, являются маленькие, связанные с мембраной, органеллы, называемые гликосомами, в которых находятся ферменты гликолиза и происходит производство энергии (Fairlamb, 1990). Митохондрии в этой форме трипаносом слабо развиты, цикл Кребса отсутствует. Тогда как в проциклической форме этих организмов цикл Кребса активируется, митохондрии увеличиваются в размерах, распространяются по всей клетке принимая сложную форму (Vickerman etal., 1988). Митохондриальный геном всех членов подотряда трипаносоматид имеет необычную и сложную структуру, которая состоит из большого количества маленьких и больших кольцевидных ДНК (миниколец и максиколец), переплетенных между собой в большую сетчатую систему (в виде кольчуги), устойчивую к механическим воздействиям и называемую кинетопластной ДНК или кДНК (Bhat et al, 1990; Shapiro, Englund 1995). Сам кинетопласт расположен у основания жгутика. Максикольца варьируют в размерах от 20 до 40 kb в зависимости от вида организма, кодируют рРНК и некоторые митохондриальные белки. Структура и генетическая функция максиколец похожа на митохондриальную ДНК других эукариот, но транскрибируются они полицистронно в отличии от ДНК других эукариот (Koslowsky, Yahampath, 1997; Read et al., 1992). Многие транскрипты максиколец подвергаются редактированию до того, как они становятся функционально готовы к трансляции. В кинетопласте существует до десяти тысяч миниколец размером от 0.7 kb (Trypanosoma vivax) до 2.5 kb (Crithidia fasciculate) (Hajduk et al., 1992). В миникольцах закодированы последовательности гид РНК (гРНК), которые несут информацию о вставке и удалении U нуклеотида во время редактирования пре-мРНК (Blum et al., 1990а; Sturm, Simpson, 1990). Вопрос о возникновении редактирования мРНК в митохондриях трипаносом, его развитии и взаимосвязи процесса редактирования с паразитическим образом существования этих организмов весьма интересен. Предполагалось, что механизм редактирования возник как адаптация к паразитизму (Simpson, Maslov, 1994). Однако, позже было обнаружено, что в свободно живущих простейших Bodo saltans РНК редактирование тоже существует, и если рассматривать бодониды, как прародителей трипаносоматид, то механизм редактирования возник независимо от паразитизма (Blom et al., 1998).
Как уже упоминалось выше, транскрипты одних и тех же криптогенов в разных организмах подвергаются разной степени редактирования: например, оба домена мРНК NADH дегидрогеназы 7 (ND7) проходят через массивное редактирование (пэн-редактирование) в Т. brucei, тогда как в L. tarentolae редактирование ограничивается коррекцией только 5 концов у каждого домена (Simpson, Maslov, 1999). Считается, что изначально имелись гены, подвергающиеся пэн-редактированию, а потом, в процессе эволюции, такой тип криптогенов был заменен на гены с частичным редактированнием (Simpson, Maslov, 1994). Предполагается, что в этом случае комплементарная ДНК (сДНК), полученная из частично редактированной мРНК с помощью обратной транскриптазы, заменяет первоначальный криптоген через механизм, напоминающий гомологичную рекомбинацию в дрожжах (Landweber, 1992). А толчком для перехода от пэн-редактирования к частичному редактированию, по-видимому, могла служить потеря целого класса гРНК, характерная трипаносомам при неравномерном распределении миниколец во время делении клетки (Simpson, Maslov, 1994). Таким образом, в настоящее время доминирует точка зрения, что пэн-редактирование является примитивной формой данного процесса (Landweber, Gilbert, 1994).
В течение долгого времени источник поступления информации о коррекции последовательности пре-мРНК в процессе редактирования не был известен, пока в 1990 году Блум со своими коллегами не обнаружил короткие РНК молекулы, которые он назвал гид-РНК (гРНК) или ведущими РНК (Blum et al, 1990а). Эти молекулы содержат в своей последовательности информацию, которая используется механизмом редактирования для правильной вставки или удаления U нуклеотидов в определенных участках пре-мРНК, в следствии чего получается фукциональный транскрипт. Размеры гРНК варьируются от 55 до 70 нуклеотидов и, например, в L. tarentolae, они транскрибируются как с максиколец, так и с миниколец кДНК (Sturm, Simpson, 1990; Estevez, Simpson 1999). Интересно, что число классов миниколец, кодирующих гРНК, отличается от вида к виду организмов в таком же масштабе, как и РНК редактирование. Например, известно, что в большей степени редактированию подвергаются пре-мРНК в Т. brucei, чем в L. tarentolae, и также известно, что Т. brucei имеет большее количество миниколец (Hajdukeftf/., 1992).
Ферменты, катализирущие редактирование мРНК в трипаносомах, образуют комплекс
Из литературы известны гены для нескольких основных компонентов выделенных комплексов, но только для некоторых белков были определены функции. Попытки изучить индивидуальные белки ферментативного комплекса редактирования начались с лигаз, которые были обозначены IV и V в стержневом комплексе (Rusche et al., 1997), и, соответственно, ТЬМР52 и TbMP48 (Panigrahi et al., 2001), р52 и р48 (McManus et al, 2001). Названия белкам были приписаны исходя из размера изначально транслируемого продукта до его укорачивания при импортировании в митохондрию. Изначально эти белки были названы, как 57 и 52 kDa (Sabatini, Hajduk, 1995; Rusche et al, 1997), или 54 и 47 Ша (Corell et al., 1996), соответственно. Эти гены были клонированы первыми (McManus et al., 2001;Panigrahi et al, 2001; Rusche et al, 2001; Schnaufer et al., 2001), а генетический нок-аут лигазы IV показал, что этот белок является незаменимым как в проциклической (Rusche et al., 2001), так и в кровяной формах Т. brucei (Schnaufer et al., 2001). Последующие работы позволили выяснить роль обеих лигаз в редактировании. Было показано, что лигаза IV важна для цикла U-делеции и репарации РНК в процессе редактирования (Huang et al., 2001), а лигаза V функционирует в цикле U-вставки (Cruz-Reyes, et al., 2002). В связи с этим лигаза IV была названа DREL (Deletion RNA Editing Ligase), а лигаза V - IREL (Insertion RNA Editing Ligase) (Cruz-Reyes, et ai, 2002). Было также показано, что при инактивировании лигазы V (IREL) с помощью РНК-интерференции проциклическая форма трипаносом оставалась жизнеспособной, а выделенный экстракт из этих трипаносом катализировал цикл U-вставки на одном уровне с контрольным экстрактом, в котором уровень лигазы V (IREL) был нормальным (О Неагп et al.y 2003). Это означает, что лигаза IV (DREL) может замещать лигазу V (IREL) в процессе U-вставки.
Другие белки комплекса редактирования также были исследованы с помощью РНК-интерференции. Было показано, что белок III (другое название ТЬМРбЗ) является необходимым структурным элементом, который также важен для сохранения лигазы DREL (Huang et ah, 2002) и оказывает эффект на эндонуклеазное расщепление в обоих циклах редактирования, но не влияет на добавление или удаление уридинов. Анализ последовательности белка III не выявил в нем нуклеазного мотива, что говорит о структурной роли этого белка, а не о ферментативной. Возможно, что это непрямые эффекты, связанные с уменьшением седиментации комплекса редактирования. Другой белок - II (ТЬМР81) - влияет на жизнеспособность проциклических трипаносом и критически важен для поддержания структуры комплекса редактирования, более того - белок II необходим для сохранения лигазы IREL (О Неагп et ah, 2003).
Также был выявлен белок, ответствененный за активность TUTase, которая добавляет U нуклеотиды в цикле вставки - это ТЬМР57. Было показано, что ТЬМР57 имеет нуклеотидилтрансферазный и поли(А) мотивы, причем, рекомбинантный белок (Ernst et ah, 2003; Aphasizhev et ah, 2003b) добавлял один U нуклеотид к 3 -ОН концу одноцепочечного субстрата РНК. Этот белок был назван RET2. Снижение количества этого белка в проциклической форме T.brucei приводило к нежизнеспособности трипаносом и полному ингибированию предрасщепленного процесса U-вставки in vitro. Второй белок - 108 kDa (TUTase) важен для редактирования (Aphasizhev et al., 2002), но стабильно не связан с комплексом редактирования (Ernst et al., 2003; Aphasizhev et al., 2003a) и ответственен за созревание олиго-ІІ-хвоста у гРНК (Aphasizhev et al., 2003b). Белок получил название RET1.
Было высказано предположение о том, что и другие ферментативные активности вовлечены в процесс редактирования. Несколько белков были выделены из митохондриальных экстрактов T.brucei, L.tarentolae, С. faciculata и в разной степени охарактеризованы. Так, например, был выделен РНК-геликазный белок mHEL61, содержащий характерный DEAD-мотив (Missel et al., 1997), а также были описаны РНК-связывающие белки, ответственные за связывание гРНК и/или мРНК in vitro: RBP16, gBP21, gBP25, REAP-1, TBRGG1. (Vanhamme et al., 1998; Pelletier et al, 2000; Muller et ah, 2001; Madison-Antenucci, Hajduk, 2001; Blom et al, 2001). Однако, до сих пор неясно в какой мере эти белки вовлечены в процесс редактирования и как они связаны с эдитосомой.
Исходя из того, что вышеописанный ферментативный комплекс катализирует оба цикла редактирования, была предложена довольно простая модель для механизма процесса редактирования. По этой модели расщепление как при U-делеции так и при U-вставке катализируется одной и той же эндонуклеазой; добавление уридина или его удаление осуществляется одним и тем же ферментом (TUTase); и одна и та же лигаза сшивает субстрат в обоих циклах редактирования (Hajduk, 1997; Stuart et al, 1997). В то же время, эндонуклеазные активности для U-делеции и U-вставки по-разному реагируют на наличие аденозин-нуклеотидов (Cruz-Reyes et al, 1998а), а именно: они стимулируют расщепление мРНК в участке U-делеции и ингибируют эту стадию в участке U-вставки. Более того, циклы U- делеции и U-вставки имеют разные требования к характеристикам гРНК (Cruz-Reyes et al., 2001; Igo et al., 2002a), которые влияют на стадии расщепления и сшивания. Также, во второй стадии редактирования TUTase и З -и-экзонуклеаза используют разные каталические центры: для первого необходимо UTP, а после действия второго выделяется UMP (Cruz-Reyes, Sollner-Webb, 1996; Rusche et al., 1997). И наконец, изучение обеих лигаз показало, что одна из них катализирует в цикле U-делеции - DREL, а другая - в цикле U-вставки - IREL (Huang et al., 2001; Cruz-Reyes et al., 2002). Таким образом, эти данные дают основания предполагать, что все три стадии редактирования в U-делеции и в U-вставке используют разные ферментативные активности, и, следовательно, разный набор белков может функционировать в обоих типах редактирования (Cruz-Reyes et al., 1998b, 2001, 2002; Drozdz et al, 2002; O Hearn et al, 2003).
В 2003 году были определены два субкомплекса в пределах эдитосомы, которые состоят из двух разных наборов белков (Schnaufer et al., 2003). Один субкомплекс включает в себя DREL (белок IV), белок III (ТЬМРбЗ), белок I (ТЬМР99) и, возможно, белок VII (ТЬМР18) и катализирует пред-расщепленный процесс U-делеции, т.е. без первой стадии расщепления. Второй субкомплекс, состоящий из IREL (белок V), белок II (ТЬМР81) и TbMP57 TUTase, катализирует пред-расщепленный процесс U-вставки. Однако, ни один из этих субкомплексов не обеспечивал полный цикл U-делеции или вставки. Более того, нужно отметить, что некоторые активности, которым приписаны функции в одном типе редактирования, могут также функционировать и в другом типе редактирования. Например, РНК-лигаза, необходимая для U-делеции - DREL - также сшивает редактированную мРНК в цикле U-вставки, при инактивировании второй лигазы - IREL (O Hearn et al., 2003). Но до сих пор неизвестно, участвует ли лигаза DREL во вставочном редактировании вместе с лигазой IREL, когда комплекс неповрежден, или только в случае, когда лигаза IREL является неактивной.
Характеристика экстрактов с помощью Норзерн и Вестерн блот анализов
Мечение РНК или праймеров проводили либо с 3 -конца с использованием [32Р]рСр и РНК-лигазы Т4, либо с 5 -конца с помощью [у-32Р]АТР и полинуклеотид-киназы Т4.
Для мечения 3 -конца реакционная смесь содержала: 4 мкл 10Х буфера для работы РНК-лигазы Т4, 4 мкл РНК-лигазы Т4, 0.1% БСА, 10% ДМСО, 10 pmol субстрата и 20 мкл [32Р]рСр. Реакцию проводили в течение 24 ч при 4С.
Для мечения с 5 -конца субстрат сначала дефосфорилировали с 5 -конца, при этом реакционная смесь содержала: 10 pmol субстрата, 10 мкл 10Х буфера, 1 мкл Щелочной Фосфатазы (ЩФ). Смесь инкубировали при 37С в течение 10 мин; затем инактивировали ЩФ при 65С в течение 10 мин; субстрат экстрагировали с помощью раствора фенол/хлороформа. После этого проводили реакцию мечения субстрата с 5 -конца. Для этого к 10 пмолям дефосфорилированного субстрата добавляли 10 мкл 10Х буфера, 1 мкл полинуклеотид-киназы Т4 и 11 мкл [у-32Р]АТР.
Меченые РНК затем очищали на 9% акриламидном геле с добавлением 8 М мочевины (Cruz-Reyes, Sollner-Webb 1996). В качестве маркеров на геле использовали 3 - или 5 - меченые мРНК, секвенирование которых проводили РНКазой ТІ или Р1 согласно описанию компании производителя. Также использовали 25 тМ фосфат натрия, рН 12 для нуклеотидного расщепления.
Для анализа полного цикла U-делеции или U-вставки in vitro были использованы 30 finol 3 -меченой мРНК и 1.2 pmol соответствующей гРНК, которые сначала предгабридизировали в буфере ТЕ при 37С в течение 10 мин, а затем 10 мин при 25С до добавления реакционной смеси. Разделение продуктов реакции с шагом в 1 нуклеотид проводили на 9% денатурирующем полиакриламидном геле длинной в 1 метр при 1600 V в течение 14 ч.
Реакцию редактирования проводили в 20 рЛ финального объема с буфером IX MRB-10mM КС1 с добавлением 20-100 нг/мкл носителя-белка: БСА или гексокиназы. Реакционные смеси также содержали указанное количество АТФ и PPi. К реакционной смеси для U-делеции добавляли 1 тМ АМР-Ср для поддержания первой стадии редактирования - расщепления, тогда как в реакции U-вставки добавляли 150 uM UTP; в общих реакционных условиях использовали оба нуклеотида. Реакционные смеси с очищенным комплексом редактирования содержали 2 мкл пик-фракции ( 108 эквивалент по клеткам), реакции с митохондриальным экстрактом содержали 0.5 мкл экстракта ( 10 эквивалент по клеткам). Инкубацию реакционных смесей с очищенным комплексом редактирования проводили в течение 1 ч при 28С, тогда как реакцию с митохондриальным экстрактом проводили в течение 45 мин и с добавлением 15 единиц RNAsin и 10 тМ DTT. РІЖ субстрат экстрагировали из реакционных смесей раствором фенол/хлороформа с последующим осаждением 2.5 объёмами спирта с добавлением 20 мкг гликогена в качестве носителя.
Результаты подтверждали количественным анализом при сканировании авторадиограмм с помощью системы FluorChem 8000 Advanced Fluorescence, Chemiluminescence and Visible Light Imaging System с использованием программного обеспечения AlphaEaseFC.
Для этого анализа сначала проводили цикл U-делеции с использованием 30 fmol немеченой мРНК А6. После проведения реакции, фенол-хлороформной экстракции и осаждения этанолом продукты реакции инкубировали в течение 10 мин при 70С с 0.08 pmol 5 - меченым праймером A6-RT. Затем реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 48С с 200 ед. обратной транскриптазы Superscript II RNase Н" в буфере, содержащем 10 mM DTT, 0.4 тМ dATP, 0.4 тМ dCTP и 0.1 тМ ddTTP. Продукты реакции разделяли на 20% полиакриламидном геле с добавлением 8 М мочевины. Результаты анализировали с помощью авторадиограммы.
Для проведения анализа двух первых стадий в обоих циклах редактиртования 30 fmol 5 -меченой мРНК и 1.2 pmol соответствующей гРНК инкубировали в течение 10 мин при 37С, а затем 10 мин при 25С. После чего добавляли оптимальный буфер в цикле U-делеции для экзонуклеазного анализа или оптимальный буфер в цикле U-вставки для специфического анализа активности TUTase. В обеих реакциях стадию сшивания ингибировали с помощью инкубирования ферментативного экстракта с 10 тМ РРІ, концентрацию которого потом разбавляли до финального значения 1.5 тМ в 20 мкл объема. Реакцию проводили при 28С в течение 45 мин. Продукты реакции наносили на 9% акриламидный денатурирующий гель длинной в 43 см. Гель высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку.
Образование комплементарных связей между мРНК и гРНК подтверждали с помощью трипаносомальной нуклеазы специфичной к 5 -концу дуплекса между мРНК и гРНК. Существование якорного дуплекса и его 5 -конца на мРНК показали с помощью комплекса редактирования при расщеплении мРНК в участке редактирования и дальнейшем сравнении размера полученного РНК участка с фрагментами РНК-маркера (Cruz-Reyes et al., 1998с). Существование хвостовых дуплексов и их 5 концов на мРНК подтвердили с помощью расщепления для всех гРНК, которые оканчиваются на С. С этой целью использовали трипаносомальную структурно-специфическую эндонуклеазу. Между якорным и хвостовым дуплексами существует только несколько промежуточных остатков, которые не имеют явных партнеров. Образование связей между мРНК и гидовой частью гРНК не исследовали, поэтому для тех случаев, где эта часть гРНК существует, указали только последовательность.
Фермент U-вставки (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении UTP
Наблюдаемый эффект UTP был продемонстрирован нами как с очищенным комплексом редактирования (Рис. 17-19С), так и с клеточным лизатом (Рис. 19D; Law et al, 2005), а также с митохондриальным экстрактом (Рис. 20С). Таким образом, действие TUTase в цикле U-делеции не является результатом нарушения комплекса редактирования в процессе его очистки. Более того, влияние UTP на U-делецию не различается как при использовании очищенного комплекса (Рис. 17А,С; 18), который обогащен в сто раз, так и клеточного экстракта (Рис. 19D). Это говорит о том, что эффект UTP вовлекает TUTase комплекса редактирования, а не другую TUTase-активность (см. ниже и Рис. 20В).
Известно, что в митохондриях трипаносом находятся два белка TUTase: один -57 Ша (Aphasizhev et al, 2003b; Ernst et al, 2003), ответственный за U-вставку при редактировании мРНК и являющийся частью комплекса редактирования; и второй - 108 Ша (Aphasizhev et al, 2002, 2003b; Ernst et al, 2003; O Hearn et al, 2003), ответственный за созревание олиго-и-хвоста гРНК и неявляющийся частью комплекса редактирования (Рис. 20А). Поэтому следующей нашей задачей было выяснить, какая TUTase вовлечена в катализ наблюдаемого изменения накопления продуктов U-делеции при добавлении UTP в реакционные смеси.
Основная часть TUTase р108 из митохондриального экстракта седиментирует при 8S (Aphasizhev et al, 2002, O Hearn et al, 2003, Zhelonkina et al, 2006), в этой же фракции находится свободная от комплекса редактирования З -и-экзонуклеаза, тогда как сам комплекс редактирования седиментирует при 20S (Rusche et al, 1997). При использовании 8S фракции для катализа предрасщепленной реакции U-делеции с добавлением UTP никакого эффекта UTP не наблюдалось (Рис. 20В). Этот результат, во-первых, подтверждает заключение, что UTP в реакции U делеции не способствует ингибированию З -и-экзонуклеазы, а, во-вторых, указывает на то, что TUTase р 108 не поддерживает эффект, связанный с UTP. Более того, когда катализ U-делеции проходил с митохондриальным экстрактом, в котором белок р108 был инактивирован с помощью РНК-интерференции (Aphasizhev et al, 2002), то эффект, связанный с UTP, наблюдался (Рис. 20С). Таким образом, митохондриальный экстракт, содержащий нормальный комплекс редактирования с TUTase р57, но без TUTase р108, проявляет эффект UTP в реакции U-делеции.
Было замечено, что комплекс редактирования, очищенный до 7 основных белков (Рис. 6А; см. также Rusche et al., 1997), содержит существенно меньше TUTase р57, чем других белков комплекса (Рис. 21 А, В). Несмотря на это, комплекс редактирования катализирует реакции U-вставки очень эффективно (Рис. 10, 11, 13; Cruz-Reyes et al., 2001). Для того чтобы определить, была ли TUTase р57 потеряна в процессе очистки ферментативного комплекса, был проведен Вестерн блот анализ выделенных экстрактов разной степени очистки с использованием антител к белку TUTase р57 и белку-Ш. Этот анализ показал, что соотношение р57 TUTase и белка-III одинаково как в комплексе, так и в митохондриальном экстракте и клеточном лизате (Рис. 21С). Исходя из того, что белок-Ш остается в постоянном соотношении с другими белками комплекса в процессе его очистки (Huang et al., 2002), можно заключить, что количество TUTase р57 в процессе очистки по отношению к другим белкам также не уменьшается.
Таким образом, полученные нами результаты дают возможность заключить, что TUTase р57 комплекса редактирования ответственна за добавление U в цикле U-делеции при добавлении UTP. Во-первых, этот эффект UTP наблюдается при катализе реакций как очищенным комплексом (Рис. 17-19), так и митохондриальным экстрактом (Cruz-Reyes, Sollner-Webb, 1996, Рис. 20С) или клеточным лизатом (Рис. 19D). Это говорит о том, что активность, ответственная за добавление U, очищается вместе с другими белками комплекса редактирования. Таким образом, в результате очистки мы добиваемся обогащения белков редактирования, в том числе и TUTase (Рис. 21С), в несколько сотен раз (О Неагп et al, 2003). Тогда как белки, не относящиеся к редактированию, удаляются в процессе очистки более чем на 99%. Во-вторых, дополнительное доказательство того, что белок TUTase действует в реакциях U-делеции, вытекает из экспериментов, в которых TUTase р57 была инактивирована с помощью РНК-интеференции. С помощью Норзерн блот анализа мы показали, что in vivo мРНК, кодирующая TUTase р57 деградирует с момента образования двухцепочечной РНК (Рис. 22А), и тем самым подтвердили ранее опубликованные данные (Aphasizhev et al, 2003b). Эта манипуляция явилась летальной для клеток, рост которых остановливался примерно через 48 часов после индукции клеток тетрациклином, т.е. запуском РНК-интерференции (Zhelonkina et al, 2006). В этих клетках уровень белка TUTase р57 уменьшился на 50% (Рис. 22В). В полном цикле U-делеции, катализируемого экстрактом из индуцированных клеток, наблюдалось уменьшение эффекта UTP относительно контрольных клеток (Рис. 22С). Это означает, что вставочная TUTase р57 играет важную роль в добавлении U в процессе U-делеции, при добавлении UTP к реакциям.
Следующий вопрос, который нам было интересно выяснить - какова роль TUTase в реакции U-делеции: специфическая или неспецифическая? В случае специфического действия, TUTase будет узнавать делеционный субстрат также как и в реакции U-вставки, тогда как в случае неспецифического действия, TUTase будет добавлять нуклеотиды к 3 -концу любой РНК молекулы. (Bakalara et al, 1989)?
