Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ. 5
Актуальность проблемы. 5
Цель и задачи работы. 6
Научная новизна и практическая значимость. 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 8
I .Окислительная ветвь пентозофосфатного пути. 9
Роль пентозофосфатного пути в центральном метаболизме. 10
Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа (Zwf). 12
6-фосфоглюконолактоназа (6-PGL) 15
6-фосфоглюконат дегидрогеназа (Gnd, 6PGDH). 17
Источники NADPH в клетке. 18
Распределение метаболических потоков в Е.соН. Роль окислительной ветви пентозофосфатного пути. 19
Окислительный стресс. 27
II. Современные методы модификации хромосомы. 33
Неспецифическая Ми-зависимая интеграция. 33
Сайт-специфическая рекомбинация. 37
Гомологичная рекомбинация в Е. coli. 42
Модификация хромосомы линейными ДНК. 45
Методы получения точечных мутаций. 50
Селективные маркеры. 51
Краткое заключение. 52
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды. 53
2. Генно-инженерные методики. 55
3. Р1 -зависимая трансдукция. 5 8
4. Модификация хромосомы с использованием Red системы рекомбинации бактериофага X. 59
5. Удаление маркера устойчивости из хромосомы. 60
6. Maltose-blu тест. 61
7. Определение активности 6-фосфоглюконолактоназы. 62
8. Экспрессия и очистка белка (His)6-YbhE. 62
9. Интеграция экспрессионной кассеты. 63
10. Определение точек интеграции. 65
11. Штаммы-продуценты L-аминокислот, культивирование. 74
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 76
1. Идентификация структурной части генаpgl E.coli. 76
1.1. Штамм AybhE проявляет свойства pgl мутанта. 76
1.2. pgl ген из P.putida комплементирует Mal-Blu фенотип AybhE штамма. 78
1.3. Очистка белка YbhE с His-tag и определение его 6PGL активности. 83
1.4. Поиск белков гомологичных YbhE в других организмах. 85
2. Увеличенная экспрессия YbhE приводит к увеличению продуктивности штаммов-продуцентов ароматических аминокислот. 86
ВЫВОДЫ 90
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 92
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Создание штаммов-продуцентов биологически активных веществ требует фундаментальных знаний о метаболических процессах происходящих в живой клетке наряду с обладанием генно-инженерным инструментарием для модификации генетической информации штамма. Наиболее изученным молекулярно-биологическим объектом является бактерия Escherichia coli, поэтому неудивительно, что большинство промышленных продуцентов создано именно на ее основе. Несмотря на обширные знания о метаболизме и регуляции экспрессии генов в E.coli, приведшие к современным исследованиям в области метаболической инженерии, тем не менее, даже на карте центрального метаболизма этого организма остаются «белые пятна».
Хорошо известно, что метаболизм E.coli организован таким образом, чтобы быстро утилизировать глюкозу через гликолиз и путь трикарбоновых кислот. Альтернативой гликолизу служит окислительная ветвь пентозофосфатного пути и затем либо через неокислительную ветвь обратно в гликолиз, либо через путь Ентнера-Дудорфа. В окислительной ветке происходит восстановление энергии за счет синтеза NADPH, а образующиеся в реакциях пентозофосфатного пути (РРР) метаболиты используются в биосинтезе нуклеотидов, ароматических аминокислот и витаминов. Мутанты по окислительной ветке РРР практически не отличаются по ростовым характеристикам от штаммов дикого типа при стандартном культивировании, так как необходимые предшественники могут синтезироваться и через неокислительную ветку РРР.
Современные исследования распределения потоков углерода в центральном метаболизме, как и более ранние, показывают, что в окислительную ветку РРР поступает 15-20% углерода исходной глюкозы, а остальная, существенно большая часть -непосредственно в гликолиз. Однако даже поток в 15-20% для использования образующихся в РРР метаболических интермедиатов как доноров углерода в дальнейшем биосинтезе излишен, и часть структурного углерода возвращается в гликолиз через неокислительную ветку.
Окислительная ветвь представляет собой три последовательные реакции, первая и третья из которых катализируются хорошо известными ферментами. Хотя мутация по второй стадии РРР - Pgl была описана для E.coli более 30 лет назад, тем не менее, рамка считывания, кодирующая 6-фосфоглюконолактоназу (6PGL) не идентифицирована до сих пор, и охарактеризованы для большого ряда организмов. Они принадлежат к одному довольно обширному семейству, и можно выделить консервативные области их аминокислотных последовательностей. Однако, в E.coli нет гомологов данного семейства белков, и так как известно, что вторая реакция может протекать спонтанно, то существование данного фермента в E.coli даже подвергалось сомнению рядом исследователей.
Наш интерес к окислительной ветви РРР также был обусловлен значимостью увеличения синтеза метаболических предшественников при создании промышленных штамммов-продуцентов ароматических аминокислот. В отличие от большинства аминокислот, предшественниками которых являются метаболиты гликолиза и цикла трикарбоновьгх кислот, в синтез ароматических аминокислот структурно вовлечены соединения, образующиеся в РРР. Обычной стратегией усиления потока через какую-либо ветвь метаболизма, является увеличение экспрессии всех генов, кодирующих ферменты данного пути. Однако то, что гену pgl не сопоставлена открытая рамка считывания, делает реализацию данной стратегии невозможной. Следует отметить, что в большинстве стран действует ограничения «self-cloning» на промышленные штаммы-продуценты. При этом ограничении никакой гетерологичной информации не должно содержаться в штамме, и, поэтому, ввести чужеродный ген pgl и оптимизировать его экспрессию не представляется возможным. В связи с этим, актуальным представлялась идентификация pgl Е. coli.
Цель и задачи работы.
Диссертационная работа посвящена идентификации структурной части гена, кодирующего 6PGL E.coli - фермент окислительной ветви пентозо-фосфатного пути метаболизма, и практическому применению усиления экспрессии этого гена в клетке для создания штаммов продуцентов ароматических аминокислот.
В процессе работы решались следующие задачи:
• идентификация рамки считывания, кодирующей 6PGL E.coli.
• исследование влияния усиленной экспрессии идентифицированного гена на продукцию ароматических аминокислот модельными штаммами продуцентами.
Научная новизна и практическая значимость.
В ходе работы на хромосоме E.coli была идентифицирована открытая рамка считывания, кодирующая б-фосфоглюконолактоназу. Доказательство, что данная рамка действительно кодирует 6PGL, было основано как на фенотипическом айализе делеционного мутанта и комплементации мутантного фенотипа введением охарактеризованной 6-фосфоглюконолактоназы из другого организма, так и очисткой соответствующего белкового продукта и определением его активности in vitro.
Обнаружение гомологичных белков в других организмах позволяет утверждать, что охарактеризованный фермент является первым членом нового семейства 6-фосфоглюконолактоназ.
Были созданы хромосомные модификации, связанные с введением перед идентифицированной рамкой считывания ґас-подобньгх промоторов, приводящие к усилению транскрипции и увеличению активности 6-фосфоглюконолактоназы в клетках модифицированных штаммов E.coli. Данные модификации при введении в модельные штаммы-продуценты фенилаланина и триптофана приводили к значимому увеличению накопления целевых аминокислот.
Похожие диссертации на Открытая рамка считывания ybhE Escherichia coli кодирует ранее неизвестную 6-фосфоглюконолактоназу (Pgl)
