Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 6
1.1. Основные способы связывания низкомолекулярных органических соединений
с двухцепочечной ДНК. 6
1.2. Внешнее связывание. 6
1.3. Интеркаляция. 7
1.4 Связывание лигандов по узкой или широкой бороздкам ДНК. 13
1.4.1. Широкобороздочные лиганды. 14
1.4.2. Узкобороздочные лиганды. 15
1.4.2.1. АТ-специфичные лиганды. 15
1.4.2.2. GC-специфичные лиганды. 43 ГЛАВА 2. Обсуждение результатов. 46
2.1. Требования к ДНК-сайт-специфичным соединениям. 46
2.2. Молекулярное моделирование. 47
2.3. Синтез димерных бисбензимидазолов - бис-ХТ и ДББИ. 51
2.3.1. Серия бис-ХТ(5,7,8) и 6nc-XT(NMe). 52
2.3.2. Серия ДББИ(5,7,8). 55
2.4. Результаты оптических исследований комплексов бис-ХТ и ДББИ с ДНК . 57
2.4.1. Исследование комплексов 6HC-XT(NMe) с ДНК. 58
2.4.1.1. Первый тип комплекса 6HC-XT(NMe) с ДНК. 61
2.4.1.2. Второй тип комплекса 6nc-XT(NMe) с ДНК. 67
2.4.1.3. Третий тип комплекса 6nc-XT(NMe) с ДНК. 69
2.4.1.4. Исследования комплексов ДББИ с ДНК. 73
2.5. Биохимические исследования бис-ХТ и ДББИ. 78
2.6. Цитологические исследования бис-ХТ(5,7,8). 80
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть. 82
3.1. Материалы. 82
3.2. Синтез димерных бисбензимидазолов бис-ХТ и ДББИ . 83
3.2.1. Синтез бис-ХТ(5,7,8). 86
3.2.2. Синтез бис-ХТ(МУ1е). 90
3.2.3. Синтез ДББИ(5,7,8). 93
3.3. Оптические методы исследования комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe)
и ДББИ с ДНК. 97
3.3.1. Приборы. 97
3.3.2. Приготовление комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe) и ДББИ с ДНК. 97
3.4. Ингибирование реакции З'-процессинга ДНК-интегразы ВИЧ-1. 99
3.5. Исследование способности бис-ХТ(5,7,8) дифференциально окрашивать хромосомы и проникать в живые клетки. 100
Выводы 102
Литература
- Связывание лигандов по узкой или широкой бороздкам ДНК.
- Результаты оптических исследований комплексов бис-ХТ и ДББИ с ДНК
- Синтез димерных бисбензимидазолов бис-ХТ и ДББИ
- Приготовление комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe) и ДББИ с ДНК.
Введение к работе
В настоящее время активно развивается область исследований, посвященная изучению взаимодействия с двухцепочечной ДНК низкомолекулярных органических соединений: антибиотиков, красителей, олигопептидов и других биологически активных соединений, взаимодействующих преимущественно с узкой бороздкой ДНК. Эти соединения являются не только объектами самостоятельного изучения, но и находят широкое применение в противоопухолевой и противовирусной терапии, а также в качестве ДНК-специфичных молекулярных зондов в медицинских и научных исследованиях.
Перспективность развития исследований в области ДНК-специфичной фармакологии связана с возможностью создания низкомолекулярных соединений, способных проникать внутрь клетки и выполнять сложные биологические функции регуляторных белков: избирательно связываться с определенными последовательностями пар оснований ДНК и оказывать направленное воздействие на функционирование генома и клетки в целом. При этом важно отметить, что низкомолекулярные соединения обычно легко выводятся из организма и не вызывают нежелательных реакций иммунного ответа.
В последнее время в химиотерапии рака и противовирусной терапии наблюдается тенденция замены традиционных лекарств на основе интеркаляторов и алкилирующих агентов, повреждающих ДНК неселективным способом, новыми агентами, нековалентно взаимодействующими с ДНК и влияющими на процессы ее репликации и транскрипции. Поэтому большой интерес представляет конструирование и синтез низкомолекулярных органических соединений, которые могли бы нековалентно и сайт-специфично связываться с узкой бороздкой ДНК.
Связывание лигандов по узкой или широкой бороздкам ДНК.
Азиномицины А и В. Антибиотики азиномицины А и В (рис. 9) относятся к редкой группе низкомолекулярных органических соединений, взаимодействующих при связывании с ДНК со стороны широкой бороздки. При этом за счёт алкилирования они
Структурная формула азиномицинов А и В. образуют внутримолекулярную сшивку между атомами азота N7 пуриновых остатков, находящихся на 5 -концах последовательностей, состоящих из трёх пар оснований: 5 -d(PuNPy)-3 , где і-любой пуклеотид [33а, б] и электрофильными атомами углерода СЮ и С21 азиномицинов [33б,в]. Таким образом, азиномицины является бифункциональным алкилирующим агентом, образующим ковалентные сшивки между нитями ДНК со стороны широкой бороздки, приводящими in vivo к повреждению ДНК на транскрипционном уровне [ ЗЗг ].
В узкой бороздке могут связываться или нейтральные или положительно заряженные низкомолекулярные соединения. Силы, которые участвуют при их взаимодействии с узкой бороздкой, включают в себя электростатические, ван-дер-ваальсовы, водородные связи и гидрофобные взаимодействия. Главное структурное требование к молекуле лиганда - это его серповидная форма, комплементарная узкой бороздке ДНК. Существенную роль в сиквенс-специфичности играют водородные связи, образуемые между молекулой лиганда и гетероатомами оснований ДНК. Часто такие молекулы демонстрируют АТ-селективность. Этому способствует отрицательный электростатический потенциал в АТ-богатом участке узкой бороздки, существенно больший, чем в районе GC-тракта. Электростатический фактор играет важную роль в селективности к узкой бороздке катионных молекул [34, 35]. Широкая бороздка, как следует из названия, намного шире, чем узкая бороздка. Средняя ширина широки бороздки - 11.7 А, а узкой бороздки - 5.7 А. Благодаря этому узкая бороздка легче обеспечивает более прочные ван-дер-ваальсовы контакты с низкомолекулярными лигандами. Обычно узкая бороздка в районе АТ-богатых последовательностей уже, чем в случае GC-последовательностей [36,37]. Более того, 2-аминогруппы гуанинов в GC-napax направлены внутрь узкой бороздки, тем самым пространственно препятствуя ван-дер-ваальсовым контактам лиганда со стенками бороздки [38].
Наиболее интенсивно изучены такие узкобороздочные лиганды как природные антибиотики нетропсин, дистамицин А и синтетические соединения беренил, пентамидин и красители DAPI, Хёхст 33258 и Хёхст 33342 (рис. 10). нЧ Химические структуры некоторых узкобороздочных АТ-специфичных лигандов.
Наиболее типичными представителями АТ-специфичных соединений, располагающихся в узкой бороздке В-формы ДНК, являются нетропсин и дистамицин А. В настоящее время известно, что эти соединения имеют в растворе «серповидную» форму, изогеометричную внутреннему пространству узкой бороздки двойной спирали ДНК. Оба соединения связываются с высокой константой (10"8 - ІСГ М"1) с В-формой ДНК [39а ]. Связывание нетропсина с А- или Z-формами ДНК вызывает переход двойной спирали в В-форму [45].
Следует отметить, что нетропсин и дистамицин А взаимодействуют также с двуспиральными РНК. Однако такое взаимодействие является более слабым, не специфичным и наблюдается лишь при высоких концентрациях лигандов и низкой ионной силе. Обнаружен одиночный сайт связывания нетропсина и дистамицина А с тРНК [396].
На основании физико-химических исследований Заседателевым и соавторами в 1976 г. была предложена модель для комплексов антибиотиков нетропсина и дистамицина А с двухцепочечной ДНК [40]. Эта модель, явившаяся первым пространственным решением структуры комплекса протяжённого лиганда с ДНК, была основана на полученных этими авторами экспериментальных данных, согласно которым нетропсин и дистамицин А: (1) - не искажают структуру суперскрученной ДНК; (2) - не взаимодействуют с двуспиральной РНК; (3) - связываются с ДНК Т-чётных фагов (у которых широкая бороздка занята остатками моно- и дисахаридов)[41]; (4) - защищают от метилирования атомы N3 аденинов в комплексах с ДНК [42]; (5) - имеют ярко выраженную специфичность связывания с последовательностями из 3-х или 4-х подряд расположенных АТ-пар в двойной спирали ДНК [43].
Согласно модели, молекула дистамицина А или нетропсина располагается при связывании в узкой бороздке ДНК и накрывает 5 пар оснований, образуя водородные связи между атомами азота амидных групп молекулы лиганда и атомами N3 аденинов и/или атомами 02 тиминов, выходящими в узкую бороздку.
Спустя 10 лет методом рентгеноструктурного анализа была определена структура комплекса нетропсина с двуспиральным додеконуклеотидом d(CGCGAATTCGCG)2 [44], подтвердившая основные положения представленной выше модели В этой работе было показано, что нетропсин, проявляя специфичность к АТ-последовательностям, действительно локализуется в узкой бороздке ДНК, вытесняя оттуда молекулы воды «гидратационного хребта».
Результаты оптических исследований комплексов бис-ХТ и ДББИ с ДНК
Химический синтез димерных бисбензимидазолов (ДББИ) представлен на схеме 3. В процессе синтеза ДББИ, как и ранее при синтезе серии бис-ХТ, ключевым моментом является конденсация о-фенилендиамина (XI) с дихлоргидратами диимидоэфиров (Vllla в), полученными по схеме 3. о-Фенилендиамин (XI) синтезировали по схеме 2,4 ацетилированисм уксусным ангидридом коммерческого 4-аминобензонитрила и последующим нитрованием 4-ацетамидобензонитрила смесью KNO3/H2SO4 [175]. Полученный 4-ацетамидо-З-нитробензонитрил деацетилировали разбавленной H2SO4, затем 4-амино-З-нитробензонитрил по реакции Пиннера превращали в соответствующий хлоргидрат имидоэфира (II). При кипячении последнего в метаноле с 3,4-диаминобензой ной кислотой образуется 2-(4-амино-3-нитрофенил)-1/7-бензимидазол-6-карбоновая кислота (IX). Затем с помощью 1 ,Г-карбонилдиимидазола она была введена в конденсацию с З-диметиламино-1-пропиламином с образованием 2-(4-амино-3 нитрофенил)-Л -[3-(диметиламино)пропил]-1Я-бензимидазол-6-карбоксамида (X). После гидрирования последнего над палладием на угле полученный о-фенилендиамин (XI) конденсировали с дихлоргидратами диимидоэфиров (VIIIa-в) кипячением в ледяной АсОН в инертной атмосфере. Синтезированные ДББИ(5), ДББИ(7) и ДББИ(8) представляли собой гексахлоргидраты, выходы на последней стадии составили 9.5, 19.0 и 20.3 %, соответственно. Из синтезированной соединений серии бис-ХТ наибольшей растворимостью в воде при нейтральных рН обладал 6iic-XT(NMe). Его взаимодействие с ДНК при нескольких концентрациях красителя было исследовано с помощью оптической спектроскопии. На рис. 44 приведено семейство спектров флуоресценции 6iic-XT(NMe) в отсутствие и присутствии меняющейся концентрации ДНК. Из приведенного семейства кривых следует, что краситель взаимодействует с ДНК и интенсивность его флуоресценции в присутствии избытка ДНК возрастает 350 раз (максимумум эмиссии при 475 нм, максимумум возбуждения при 365 нм). На рис. 45 представлено семейство спектров поглощения 6nc-XT(NMe) в присутствии меняющейся концентрации ДНК. По мере увеличения концентрации ДНК оптическая плотность при 338 нм вначале падает по сравнению с оптической плотностью свободного красителя, а затем возрастает. Следовательно, 6nc-XT(NMe) образует с дцДНК, по крайней мере, два типа комплекса.
Также, об образовании, по крайней мере, двух типов комплексов 6nc-XT(NMe) с ДНК свидетельствуют результаты измерения ЛД ДНК при 360 и 270 нм в присутствии меняющейся концентрации красителя, представленные на рис. 46. Действительно, по мере увеличения концентрации 6nc-XT(NMe) величина ЛД при 360 нм (кривая 1) в начале растет, а затем падает и становится отрицательной. Изменение величины ЛД при 360 нм с — 2иО w 0О— -2 XО чО d -46-і К положительной на отрицательную, по мере роста концентрации красителя, коррелирует с уменьшением амплитуды ЛД при 270 нм (кривая 2). Однако, наиболее чувствительным к комплексообразованию 6nc-XT(NMe) с ДНК оказался метод КД. Так на рис. 47 приведено семейство спектров КД, полученных при титровании 6Hc-XT(NMe) молекулами ДНК. При низких концентрациях добавленной ДНК длинноволновый максимум КД находился при 360 нм, по мере увеличения концентрации полимера он смещался к 335 нм, а при ещё больших концентрациях дцДНК он оказывался при 370 нм. Такое разнонаправленное движение максимума КД в зависимости от концентрации добавленной ДНК говорит об образовании в растворе при разных соотношениях краситель/ДНК трех спектрально различных типов комплексов бис-ХТ(ММе) - ДНК.
Синтез димерных бисбензимидазолов бис-ХТ и ДББИ
4-(4-метилшшеразин-1-ил)бензол-1,2-диамин (I). К 0.95 г катализатора Адамса, предварительно восстановленного в 15 мл ледяной АсОН (до прекращения поглощения водорода), прибавляли 5.61 г (23.76 ммоль) 5-(4-метшшиперазин-1-ил)-2-нитрофенил-амина [75] в 30 мл ледяной АсОН. Гидрирование продолжали 3.5 ч, до прекращения поглощения водорода, при этом раствор почти полностью обесцвечивался. Катализатор отфильтровывали, промывали ледяной АсОН, абс. EtOH. Фильтрат упаривали в вакууме и дважды переупаривали с абс. EtOH. Выход 4-(4-метшшиперазин-1-ил)бензол-1,2-диамина (І) в виде твёрдого легко окисляющегося продукта - количественный и его сразу использовали в синтезе диамина (III).
Хлоргидрат этилового эфира 4-амино-З-нитрофенилимидовой кислоты (II). 4.0 г (24.5 ммоль) 4-амино-З-нитробензонитрила [175а] суспендировали в 40 мл абс. EtOH, охлаждали льдом и при перемешивании пропускали интенсивный ток НС1 до насыщения, при этом суспензия постепенно растворялась, а затем снова выпадал осадок. Реакционную колбу закрывали хлоркальциевой трубкой и оставляли на 4-5 суток при 4-8С. Растворитель упаривали в вакууме, прибавляли 40 мл абс. эфира и твердый осадок отфильтровали (без отсасывания) и высушили в вакууме над NaOH/PiOs- Выход хлоргидрата этилового эфира 4-амино-З-нитрофенилкарбоксимидата 5.83 г(96.4%), т. пл. 232-233С (лит. [175а]: т. пл. 233-234С). 4-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)-Ш-бенз[ ]имидазол-2-ил]-2-нитрофениламин. К 4.89 г (23.7 ммоль) 4-(4-метилпиперазин-1-ил)бензол-1,2-диамина (I) добавляли 5.83 г (23.7 ммоль) хлоргидрата этилового эфира 4-амино-З-нитрофенилимидовой кислоты (II) и 50 мл ледяной АсОН. Реакционную смесь нагревали 1 ч в атмосфере азота на масляной бане при 90, постоянно перемешивая суспензию до полного растворения всех компонентов, после чего из раствора быстро выпадал оранжевый кристаллический продукт. Растворители упаривали в вакууме, остаток растворяли в горячей НгО и осаждали вещество избытком конц. NH4OH. Выпавший красно-черный смолообразный осадок оставляли на ночь при комнатной температуре. Закристаллизовавшийся осадок отфильтровывали, промывали Н О, растворяли в смеси 50 мл МеОН с 4 мл АсОН и при кипячении обрабатывали 5 г активированного угля. После удаления угля целевой продукт осаждали из кипящего раствора добавлением конц. NH4OH до начала помутнения раствора и затем оставляли на несколько часов при комнатной температуре. Выпавший продукт оранжевого цвета отфильтровывали, промывали несколько раз Н2О и трижды ацетоном. После высушивания в вакууме выход 4-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Я бенз[ /]имидазол-2-ил]-2-нитрофениламина 6.05 г (72.4%), т. пл. 181-183С (лит. [75]: т. пл. 183-185С). 4-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Дг-бенз[ /]имидазол-2-ил]бензол-1,2-диамин (III). К 0.60 г катализатора Адамса, предварительно восстановленного в 9 мл ледяной АсОН (до прекращения поглощения водорода), прибавляли 3.0 г (8.52 ммоль) 4-[6-(4 метилпиперазин-1-ил)-1Я-бенз[с1]имидазол-2-ил]-2-нитрофениламина [75] и 15 мл ледяной АсОН. Гидрирование продолжали 4,5 ч до прекращения поглощения водорода. Катализатор отфильтровывали, промывали его ледяной АсОН, изопропанолом, и фильтрат упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 10 мл АсОН, доводили до кипения, прибавляли 4 мл конц. НС1 за 1 приём и оставляли на ночь при комнатной температуре. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре ледяной АсОН до исчезновения окраски фильтрата, и высушивали. Выход голубоватых кристаллов 2.67 г. Их растворяли в НгО, обесцвечивали активир. углём и после удаления угля к фильтрату добавляли конц. NH4OH до прекращения помутнения раствора при добавлении очередной порции конц. NH4OH. Выпавший осадок офильтровывали, промывали НгО и высушили в вакууме. Получали порошок светло-бурого цвета, если эти операции повторить ещё раз, то можно получить вещество белого цвета. Выход 4[б-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Я-бенз[ аГ] имидазол-2-ил]фенил-1,2-диамина 1.10 г (40.1%), т. пл. 160-163С (лит. [75]: т. пл. 268С). Общий метод синтеза диальдегидов (IVa-r). Получение диальдегидов было осуществлено по методике синтеза динитрилов (VII) (см. ниже) с использованием соответствующих а,ю-дибромалканов (1,5-дибромпентана для (VI а); 1,2-дибромэтана для (VI б); 1,3-Дибромпропана для (VI в) и 1,4-дибромбутана для (VI г)) и 4 гидроксибензальдегида вместо 4-гидроксибензонитрила. Реакцию алкилирования проводили 1 ч при 80С. Целевые продукты после окончания реакции высаживали водой, отделяли, промывали водой и после высушивания использовали в дальнейшем без дополнительной очистки. Аналитические образцы диальдегидов были получены после перекристаллизации из смеси бензол-гексан. 4-[5-(4-Формилфенокси)пентилокси]бензальдегид (IVa). Выход 94.6% , т. пл. 80-820С,-Д/ 0.15 (А). -ЯМР: 1.58 (2 Н, м, ОСН2СН2СН2); 1.82 (4 Н, м, ОСН2СН2); 4.11 (4 Н, т, J 6.5, ОСН2); 7.12 (4 Н, д, J 8.7, Н(2,6)); 7.85 (4 Н, д, J 8.7, Н(3,5)); 9.86 (2 Н, с, СНО). Масс-спектр (MS-890), m/z: 312.0 [М]+\ расчитано М312.4 (С19Н20О4). 4-[2-(4-Формилфенокси)этокси]бензальдегид (IV6). Выход 23.0 %, т. пл. 118-120С, Rf 0.14 (А). Н-ЯМР: 4.49 (4 Н, с, СН2СН2); 7.19 (4 Н, д, J 8.5, Н(2, 6)); 7.88 (4 Н, д, J 8.5, Н(3,5)); 9.88 (2 Н, с, СНО). Масс-спектр (MS-890), m/z: 270.0 [Щ+\ рассчитано М 270.28 (Сі6Н1404). 4-[3-(4-Формилфенокси)пропокси]бензальдегид (IVB). Выход 88.1 %, т. пл. 125-126.5С, Rf 0.16 (А). Н-ЯМР: 2.25 (2 Н, м, СН2СН2СН2); 4.27(4 Н, т, J 6.2, ОСН2); 7.15 (4 Н, д, J 8.5, Н(2,б)); 7.86 (4 Н, д, J 8.5, Н(3,5)); 9.84 (2 Н, с, СНО). Масс-спектр (MS-890), m/z: 284.0 [М]+ , рассчитано М284.30 (Сі7Н1604).
Приготовление комплексов бис-ХТ, 6nc-XT(NMe) и ДББИ с ДНК.
Определение антиинтегразной активности бис-ХТ и ДББИ проводилось совместно с М.Б. Готтих и СП. Королёвым (НИИ физико-химичечской биологии им. А.Н. Белозерского) согласно стандартной методике [191]. В работе использовалась рекомбинантная интеграза ВИЧ-1 [191], а в качестве ДНК-субстрата - 21-звенный радиоактивно меченный ДНК-дуплекс U5B/U5A. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотид U5B, синтезированный по стандартной методике амидофосфитным методом , проводили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва) (25 ед. акт. на 10 пмоль олигонуклеотида) в течение 60 мин при 37С в 10 мкл буфера (50 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотреит), содержащего 2 пмоль [у-32Р] АТР. Фермент инактивировали нагреванием при 65С в течение 10 мин в присутствии 1 мкл 0.5 М EDTA. После этого к олигонуклеотиду U5B добавляли эквимольное количество комплементарного олигонуклеотида U5A. Дуплекс U5B/U5A формировали медленным охлаждением смеси от 90С до комнатной температуры в присутствии 100 мМ NaCl. Полученный дуплекс U5B/U5A затем очищали от [у- Р] АТР на колонках Micro Bio-Spin 6 (Amersham Biosciences, Англия). Этот дуплекс (2.5 нМ) инкубировали в присутствии интегразы (100 нМ) и возрастающих концентраций ингибитора (1 нМ - 100 мкМ) в 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ Hepes (рН 7.2), 1 мМ дитиотреит, 7.5 мМ MgCb и 10% DMSO, при 37C в течение 2 ч. Реакцию останавливали добавлением 80 мкл раствора, содержащего 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.5), 0.3 М ацетат натрия, 1 мМ EDTA и 0.125 мкг/мкл гликогена. Интегразу экстрагировали фенолом, продукты реакции осаждали этанолом и ресуспендировали в 80% водном растворе формамида. Продукты разделяли электрофоретически в 20% ПААГ в денатурирующих условиях (7 М мочевина) с последующим анализом геля на приборе Phospholmager (Molecular Dynamics, США). О степени ингибирующего действия соединений на реакцию З -концевого процессинга судили по изменению интенсивности полосы, соответствующей укороченной на два нуклеотида процессируемой цепи дуплекса (19-звенный продукт). По результатам исследований строили кривые зависимости эффективности протекания реакций от концентрации ингибитора, по ним определяли значения ICso как концентрацию ингибитора, при которой реакция подавляется на 50%. Цитологическое исследования синтезированных красителей проводилось совместно с К.В. Поповым и Е.И. Егоровой (ИМБ РАН) [192].
Способность дифференциально окрашивать хромосомы. Хромосомные препараты были приготовлены из клеток промоноцитарной лейкимии человека HL60 (АТСС, USA). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 40 мкг/мл гентамицина (Акрихин, Россия) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, USA), при 37С, 5% СО2 и 95% влажности воздуха. Препараты готовили по стандартной методике [193] без накопления клеток в стадии митозов с помощью колхицина. Клетки в стадии логарифмического роста подвергали гипотонии в растворе 75 мМ КС1 при 37 С в течении 30 минут. Фиксировали в смеси МеОН-АсОН (3:1). Полученную суспензию раскапывали на мокрые стекла. Стекла высушивали и хранили при комнатной температуре. Препараты окрашивали 1мкМ растворами красителей в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0,1 М NaCl, в течении 30 минут и наблюдали в этом же растворе. Изображение регистрировали ПЗС- камерой CoolSnap (Roper Scientific, USA), установленной на флуоресцентном микроскопе Leitz с использованием объектива PlanApo64x NA1.4 и комбинации фильтров для DAPI (Ех 358/Ет 461). Изображение редактировали в программе ImageJ 1.3 (National Insitute of Health, USA, http://rsh.info.nih.gov/ii ).
Способность проникать в живые клетки. Для проверки способности красителей проникать в живые клетки использовали нормальные фибробласты человека. Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 40 мкг/мл гентамицина (Акрихин, Россия) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, USA), при 37С, 5% СС 2 и 95% влажности воздуха. Клетки высаживали на покровные стекла находящиеся в отдельных чашках Петри. Для каждого красителя использовали два стекла. Тест выполняли через двое суток после пересадки. Одно стекло из каждой пары чашек фиксировали в 70% этаноле, окрашивали 1мкМ раствором красителя в фосфатно солевом буфере (PBS) в течении 30 мин. Трижды отмывали в PBS и заключали в PBS. Во вторую чашку в культуральную среду добавляли красители до концентрации 1мкМ. Через 2 часа клетки отмывали от красителя в PBS и в нем же заключали препарат, после чего немедленно проводили микроскопическое изучение препаратов на том же микроскопе и с той же комбинацией фильтров, что и в случае изучения дифференциальной окраски хромосом. Яркости флуоресценции ядер фиксированных и живых клеток сравнивали визуально.
![Синтез и каталитические свойства дифосфиновых лигандов на основе 2,3-дигидроиндено[2,1-b]фосфолов и дитиофенов](/i/i/4307/436754.png "Синтез и каталитические свойства дифосфиновых лигандов на основе 2,3-дигидроиндено[2,1-b]фосфолов и дитиофенов Чевыкалова Марина Николаевна")
