Содержание к диссертации
Оглавление 2
Список сокращений 5
ВВЕДЕНИЕ 6
Литературный обзор. ФУНКЦИИ БЕЛКА MTS1(S100A4) В
НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ 10
Связь экспрессии белка S100A4(MTS1) с метастазированием
опухолей 10
Белок S100A4(MTS 1)- представитель семейства S100 12
Структура гена S100A4 и регуляция его экспрессии 14
Тканевая....локализация....S100A4 19
S100А4 в гладкомышечных клетках артерий 19
Роль S100A4 в прогрессии артрита 21
S100A4 в клетках нервной ткани 23
Роль S100A4 в ремоделировании внеклеточного матрикса 25
Влияние S100А4 на минерализацию костной ткани 29
Внутриклеточные взаимодействия S100A4.
S100A4np53 30
Взаимодействие ТЦНМ ПА и S100A4 34
Другие внутриклеточные взаимодействияя S100А4 35
Заключение 37
Материалы и методы 43
Ферменты и реактивы 43
Плазмидные векторы 43
Штаммы бактерий 43
Агарозный гель-электрофорез ДНК 43
Трансформация клеток Е. coli с использованием СаСЬ 43
Трансформация клеток Е. coli электропорацией 44
Выделение плазмидной ДНК 45
Получение поликлональной антисыворотки к белку S100А4 46
Культивирование клеточных линий, CSML-100 и CSML-0 47
Электрофорез в ДСН/ПААГ 47
Электроперенос белков на мембрану 48
Иммуноблотинг 48
Выделение рекомбинантного белка S100A4 с помощью
металлохелатной хроматографии 49
Выделение септинов Sept6 и Sept7 на Ni-NTA сефарозе 50
Приготовление аффинного сорбента, 8100А4-сефарозы 51
Очистка поликлональных антител к S100A4 на аффинном
сорбенте 51
Проведение аффинной хроматографии с цитоплазматической
фракцией клеточного лизата 52
Идентификация белков методом пептидного фингер-принта 53
Аффинная хроматография с использованием Ni-NTA сефарозы 53
Результаты и обсуждение 55
Поиск новых белков-мишений для S100A4(MTS1) методом аффинной хроматографии
Предпосылки. Получение аффинного сорбента 55
Аффинная хроматография на 8100А4-сефарозе 57
Идентификация элюированных с аффинного сорбента белков 60
Взаимодействие эндогенного S100A4 с рекомбинантными септинами Sept6, Sept7.
Свойства молекул исследуемых септинов 68
Выделение рекомбинантных септинов, Sept6 и Sept7, с
использованием бицистронного вектора 69
Поликлональные кроличьи антитела к S100А4 (MTS1) 70
Проведение аффинной хроматографии на Sept6/Sept7-Ni-NTA-
агарозе 71
Аффинная хроматография с использованием очищенных
рекомбинантных белков: S100A4, Sept6/7 73
Дальнейшие перспективы 74
Выводы 78
Список литературы 79
Список сокращений.
ГТФ/ГДФ- гуанозинтрифосфат/гуанозиндифосфат
ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецил сульфат натрия
GPSR - от G-Protein Coupled Receptor (рецептор, сопряженный с G-
белком)
GST — глутатион-трансфераза
ЕГТА - этиленгликольтетраацетат
EMSA - от ElectroMobility Shift Assay
FGF1 - фактор роста фибробластов первого типа
FRET - флуоресцентная резонансная передача энергии
IPTG - изопропил-І-тио-р-О-галактопиранозид
MAP - белок, ассоциированный с микротрубочками
MEF - мышиные эмбриональные фибробласты
MMPs- металлопротеазы внеклеточного матрикса
Msbp - белок, связывающий мини-сателитную последовательность
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЭГ — полиэтиленгликоль
PAI-1 - активатор плазминогена урокиназного типа
PDGF - ростовой фактор тромбоцитарного происхождения
PLC — фосфолипаза
РКС - пртеинкиназа С
СК II - протеиновая казеин-киназа второго типа .
РНК - рибонуклеиновая кислота
RAGE - от Reseptor for Advansed Glycosilation End products
ROS - реактивные формы кислорода
ТАЕ - трис-асетатный электрофорезный буффер
ТВЕ - трис-боратный электрофорезный буфер
TIMP- тканевой ингибитор для MMPs
t-PA - тканевой активатор плазминогена
ТЦНМ ПА- тяжелая цепь не мышечного миозина типа ПА
ЭДТА- этилендиаминтетраацетат
Введение к работе
Сегодня известно, что в основе некоторых, фенотипически не похожих друг на друга/ патологических, изменений; тканей млекопитающих, лежат нарушения в однихи тех же молекулярных механизмах и сигнальных путях. Обнаружение таких сигнальных путей помогает пролить свет на роль некоторых молекул, участие которых в развитии той или иной патологии на- фенотипическом уровне было давно и достоверно показано; Один из таких примеров — это; белок S100A4(MTS I); известный; маркер и индуктор инвазивности опухолевых клеток. Сегодня; активно изучается; его: роль в* развитии таких патологий, как артрит, гипертрофия миокарда, гипертрофия гладкомышечного: слоя легочных артерий; почечный фиброз и др. В основе всех перечисленных патологий' лежит ненормальное ремоделирование тканей в ответ на внешние воздействия; и молекулярные механизмы регуляции?клеточной подвижности играют здесь не последнюю роль. Множество экспериментов достоверно: показали, что белок S100A4(MTS1) увеличивает клеточную подвижность, и инвазию опухолевых клеток, но; по-видимому, через те же молекулярные механизмы > он может быть вовлечен в развитие указанных выше патологий, не связанных с развитием опухолей.
Две наиболее обоснованные; экспериментально; гипотезы о механизме влияния S100A4 на увеличение инвазивностш клеток основаны на- его способности, во-первых, регулировать, динамику сборки-разборки миозиновых филаментов in vitro и, во-вторых, индуцировать экспрессию и секрецию активных форм; некоторых разрушающих внеклеточный матрикс металлопротеаз, как через взаимодействие с гипотетическими мембранными рецепторами; так и
через активацию тканевого активатора плазминогена непосредственно на клеточной поверхности. Однако, обе эти гипотезы недостаточны для объяснения феномена индукции белком S100A4 инвазивности опухолевых клеток. К тому же, эти гипотезы не объясняют, каким образом S100A4(MTS1) влияет на уровень экспрессии некоторых важных с точки зрения онкологии генов: Е-кадгерина и ВпірЗ (белок семейства bcl-2). На наш взгляд, для S100A4 существует, как минимум, еще один (или несколько) сигнальный путь, в котором задействованы малые ГТФазы семейств Cdc42 и Racl, или другие белки.
В настоящей работе мы попытались выявить новые внутриклеточные взаимодействия белка S100A4(MTS1), которые могли бы пролить свет на его роль в указанных выше явлениях на молекулярном уровне.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было обнаружение новых
внутриклеточных взаимодействий белка S100A4(MTS1),
потенциально способных влиять на увеличение инвазивности опухолевых клеток.
В работе были поставлены следующие задачи:
Разработать протокол проведения аффинной хроматографии с ковалентно иммобилизованным белком S100A4(MTS1), позволяющей выявить его возможные «мишени» среди цитоплазматических белков опухолевых клеток.
Обнаружить и идентифицировать белки, способные селективно связываться с данным аффинным сорбентом в физиологических условиях.
3. Для наиболее интересных, с точки зрения цели исследования, белков провести дополнительные эксперименты, подтверждающие возможность их взаимодействия с белком S100A4(MTS1).
Научная новизна и практическая ценность работы
В ходе выполнения работы были получены совершенно новые и
оригинальные результаты. Впервые (среди опубликованных работ)
была налажена методика поиска новых взаимодействий для S100A4
на аффинном сорбенте, что позволило обойти ряд принципиальных
ограничений, характерных для других методов обнаружения
межбелковых взаимодействий. С помощью этого метода было
обнаружено селективное взаимодействие белка S100A4 с
септиновыми олигомерами из цитоплазматической фракции
клеточного лизата высокоинвазивной опухолевой линии CSML-100
(карциносаркома молочной железы мыши, метастазирующая в
легкие). Это взаимодействие происходит в присутствии кальция, что
характерно для взаимодействия S100A4(MTS1) с его другими
известными мишенями, например, тяжелой цепью не мышечного
миозина типа ПА (ТЦНМ-ІІА). На аффинном сорбенте выделяется
олигомер (филамент) состава Sept2/7/l 1 в примерном соотношении
мономеров как 1:1:1, что согласуется с другими работами по
межбелковым взаимодействиям септинов. Необходимым и
достаточным для взаимодействия с S100A4 является наличие септина 7 в составе олигомера Sept2/7/ll, что подтверждается в других экспериментах. Интересно, что при использовании лизата неинвазивной клеточной линии того же происхождения, CSML-0 (карциносаркома молочной железы мыши, не образующая метастазов), паттерн аффинно выделяемых белков изменяется. При
этом ТЦНМ-ІІА присутствует в обоих случаях. Клетки указанных линий отличаются не только по своему метастатическому потенциалу, но и по морфологии при выращивании в культуре. Различия в паттерне выделяемых на аффинном матриксе септинов могут отражать различия в структуре и динамике септиновых филаментов состава Sept2/7/l 1 для клеток указанных линий.
Практическая ценность данной работы состоит в том, что она выявляет новую мишень для белка S100A4 внутри клетки, предполагая его участие в совершенно новых сигнальных путях, что позволяет составить более полную картину влияния данного белка на метастатический потенциал опухолевых клеток на молекулярном уровне и точнее выявить его роль в таких процессах, как прогрессия опухолей и развитие некоторых других патологий (артрит, почечный фиброз, гипертрофия миокарда и артерий).
Литературный обзор.
ФУНКЦИИ БЕЛКА MTS1(S100A4) В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ.
Связь экспрессии белка MTS1 с метастазированием опухолей.
Сегодня осталось не так много белков, играющих ключевые роли в канцерогенезе, для которых не выявлены молекулярные механизмы их участия в этом процессе. Один из таких примеров представлен в этом обзоре - это белок MTS1 (S100A4), являющийся одним из маркеров и индукторов метастатического фенотипа опухолевых клеток. Около 20 лет назад кДНК гена, кодирующего белок S100A4, из различных видов млекопитающих была независимо клонирована несколькими научными группами, как следствие, сам ген и белок имеют несколько названий: метастазин 1 (MTS1), pEL98, р9Ка, 42А, S100A4, CAPL и кальваскулин [1-9].
Экспрессия нового гена интенсивно изучалась в контексте его влияния на метастатический потенциал опухолевых клеток, и, как оказалось, по прошествии десятка' лет, первоначальное название, метастазин-1 (MTS1), было дано в лаборатории Г.П. Георгиева очень удачно [1]. Многочисленные иммуногистохимические исследования уровня экспрессии S100A4 достоверно показали его увеличение в различных видах опухолей человека и прямую связь высокого уровня экспрессии этого гена с частотой метастазирования таких опухолей и низким процентом выживших пациентов. Так, например, при исследовании 350 первичных опухолей на 1-ой и 2-ой стадиях рака легкого на наличие в них белка S100A4 [10,11] была установлена
высокая степень корреляции (Р<0.0001) между наличием в опухолях данного белка и смертностью пациентов в течение 19 лет. Выживали 80% пациентов, чьи опухоли не экспрессировали S100A4, и лишь 11% пациентов при наличии S100A4. Связь экспрессии белка S100A4 и метастазирования была показано для не мелкоклеточного рака легкого [12], рака предстательной железы [13], рака мочевого пузыря [14], аденокарциномы поджелудочной железы [15], первичного рака желудка [16], для некоторых меланом [17] и др.
При анализе изменений уровня генной экспрессии в клетках аденокарциномы поджелудочной железы были проскринированы кДНК 7 746 генов[18], и был обнаружен существенно (в 40 раз) более высокий уровень экспрессии гена S100A4 относительно нормальных клеток. Аналогичные результаты были получены в эксперименте по скринингу 9 932 различных кДНК из клеточных линий агрессивных метастазирующих опухолей поджелудочной железы [19], а также в аналогичных экспериментах с опухолями иного происхождения [20]. Наконец, используя протеомный подход, был выявлен более высокий уровень экспрессии белка S100A4 в метастазирующих линиях гепатокарциномы, по сравнению с неметастазирующими линиями того же происхождения [21].
Опыты с использованием генно-инженерных конструкций на опухолевых клеточных линиях также показали связь между экспрессией S100A4 и приобретением метастатического фенотипа раковыми клетками. Введение конструкций, экспрессирующих S100A4 в клетки неметастазирующей опухоли молочной железы крысы, приводило к формированию такими клетками метастазов при подкожных инъекциях их в здоровое животное [22]. В экспериментах с клетками легочной карциномы Льюиса, обладающими высокой
способностью давать метастазы, было обнаружено резкое снижение их инвазивности in vitro после введения в них конструкции, экспрессирующей РНК, ингибирующую трансляцию S100A4 [23].
Эксперименты с трансгенными мышами также дают подтверждающие рассматриваемую гипотезу результаты. У мышей с введенной в геном конструкцией, экспрессирующей S100A4 под контролем специфического для молочной железы вирусного промотора, наблюдался нормальный фенотип, но при скрещивании их со штаммом GRS/A, для особей которого характерна высокая частота образования опухолей молочной железы, редко дающих метастазы, получалось потомство, страдающее метастазирующими опухолями молочной железы [24].
Приведенные факты убедительно доказывают, что белок метастазин-1 (MTS 1), обозначаемый так же, как S100A4, CAPL, pEL98, 18А2, р9Ка, 42А, CAPL, кальваскулин, является одним из индукторов формирования метастатического фенотипа опухолевых клеток.
Белок S100A4(MTS1) - представитель семейства S100.
Белки семейства S100 представляют собой маленькие (10-12 кДа), связывающие ионы кальция молекулы, существующие в виде не ковалентных параллельных (для членов семейства, чья трехмерная структура была установлена) гомодимеров (S100A4) [25]. Полипептид S100A4 состоит из 101 а. о. (аминокислотного остатка). Некоторые представители семейства могут образовывать гетеродимеры: S100A4/S100A1, S100A8/S100A9, S100A6/S100B, S100A1/S100P и т.д.). Вторичная структура для всех членов семейства однотипна и сформирована четырьмя ос-спиралям, соединенными петлями сравнимой длины. Главная особенность,
і*
присущая только этому семейству калыщй-связывающих белков, состоит в наличие двух связывающих ионы кальция доменов (на мономер) типа EF-руки, одна из которых типична для ряда других семейств и состоит из 12 аминокислотных остатков (KD = 10-50 jaM) [25], располагаясь ближе к С-концу мономера, а другая, находящаяся на N-конце, состоит из 14 аминокислотных остатков и считается псевдо EF-рукой, связывающей ионы кальция гораздо менее прочно (KD = 200-500 |дМ). Псевдо EF-рука сформирована петлей между а-спиралями 1 и 2, а каноническая EF-рука - петлей между ос-спиралями 3 и 4 (Рис.1) [25]. Первичная последовательность белков семейства S100 идентична на 25-65%, в зависимости от сравниваемой пары белков. Основная масса различий находится в линкере, соединяющем EF-руки и на протяженном С-конце. Связывание ионов кальция псевдо EF-рукой приводит лишь к незначительным конформационным изменениям в структуре молекулы S100, тогда как связывание ионов кальция канонической EF-рукой приводит к повороту спирали 3 относительно спирали 4 и делает более доступными гидрофобные аминокислотные остатки спирали 3 и 4, а также протяженного С-концевого региона. Гидрофобные остатки в петле 4, особенно F72 , Y75, F78 и L79 важны для формирования интерфейса димеризации, которая происходит in vitro с Kd = 1-2 мкМ [26]. Для S100A4 С-концевой регион существенно отличается по первичной последовательности от такового у других членов семейства S100, и, по-видимому, имеет наибольшее значение для узнавания специфического для S100A4 набора белков-мишений [27].
Рис.1 Вторичная структура димера белка S100A4 по данным спектроскопии ЯМР [25].
Структура гена S100A4 и регуляция его экспрессии.
Из 25 обнаруженных на сегодня у человека генов семейства S100, 21 (S100A1-S100A18, trichohylin, filaggrin и repetin) образуют кластер, находящийся в хромосомном локусе lq21. В геноме мыши аналогичный кластер генов находится в локусе 3f3. Ген S100A4 находится между генами S100A3 и S100A5. Секвенирование гена mtsl человека показало, что он состоит из трех интронов и четырех экзонов, из которых первые два не кодируют аминокислотной последовательности, а у мыши ген mtsl состоит из трех экзонов и двух интронов [28]. Первый экзон гена mtsl у мыши мал и тоже не
кодирует транслируемой последовательности, а все цис-регуляторные элементы были найдены в первом интроне (Рис.2). Среди них оказались как хорошо известные негативные и позитивные регуляторы, так и новые регуляторные элементы [29-31].
NFkB + p200/KRC
ЕЭ І " \ t t ц
New Арі Msbp CBF API (Fra/JunD)
Рис.2 Расположение регуляторных элементов в первом интроне mtsl. Оказалось, что первый элемент АР-1 метилирован в клетках неметастазирующей линии CSML-0, не экспрессирующих MTS-1, и представляет собой в метилированном состоянии негативный регуляторный элемент умеренной силы, связывающий белки семейства Jun и Fos [30]. В клетках линии CSML-100, обладающих высокой способностью давать метастазы и высоким уровнем экспрессии MTS-1, этот сайт не метилирован и не активен [30]. Непосредственно перед сайтом АР-1 был обнаружен защищенный в клетках линии CSML-100, но не в клетках линии CSML-0, участок длиной в 16 пар нуклеотидов, обладающий энхансерной активностью [29]. Однако, связывающиеся с этим участком белки не были идентифицированы.
Основной регуляторный элемент, в 40 раз повышающий уровень экспрессии репортерного гена, находящийся в первом интроне между нуклеотидами +780 и +916, представляет собой сложную мозаику сайтов, обладающих разнонаправленным влиянием на уровень эксперссии гена mtsl (рис. 3) [32].
кВ Sa SpH AP2 Sp1-H
«адстаамттттДи: ііииі тотстосстсгсхххаїоосїїассхосаіі^^ чзхат
І і І II І І І Г І І
«та '» ?* ііі мі і» і«і «*» мі > ««
CBF Spl-lll АР1
І III І І І І
НІ МЗ II* tM 103 in »01 .*-.«
Рис. 3. Строение основной части регуляторного элемента, расположенного в первом интроне гена mta/(Cohn 2001) [32].
Первым на этом участке расположен элемент, подобный по своей последовательности сайту для NF-kB. Этот сайт действительно связывает гетеродимеры белков NF-kB/ Rel: р50/р50 и р50/р65, а также белок р200 [31]. Однако, введение точечных замен в этот сайт, отменяющих связывание белков NF-kB/Rel: р50/р50 и р50/р65, не влияло на активность энхансера, тогда как мутации, отменяющие связывание белка р200, лишали этот элемент энхансерной активности, причем in vivo данный сайт был защищен только в клетках линии CSML-100, но не в клетках линии CSML-0, не экспрессирующих MTS1 [31]. Позднее было показано, что р200 представляет собой ДНК-связывающий белок, KRC, из семейства ZAS [33].
Через 10 пар нуклеотидов от сайта связывания KRC расположен участок +810-839, обозначенный как Sa, защищенный от метилирования в обеих упоминавшихся выше клеточных линиях. С этой последовательностью могут взаимодействовать белки семейства Msbp. В экспериментах с репортерными конструкциями, в которых область +801-830 была удалена, не было замечено каких-либо значимых изменений уровня экспрессии гена-репортера при
транзиторных трансфекциях, но было обнаружено уменьшение этого уровня в стабильно трансфицированных клонах [34]. Каким образом эта последовательность влияет на активность целого энхансера, не препятствуя связыванию КРС [32], остается невыясненным.
Все три сайта Spl, несмотря на наличие одной замены относительно консенсусной последовательности, связывают белки Spl и Sp3 из ядерных белковых экстрактов обеих клеточных линий, однако, при транзиторных трансфекциях репортерных конструкций на энхансерную активность в клетках линии CSML-100 существенное влияние (в 6 раз) оказывает лишь сайт Spl-I, а в клеточной линии CSML-0 — сайт8р1-11 [32]. По данным тех же авторов, сайт АР-2 не вносит заметного вклада в активацию транскрипции гена mtsl в указанных клеточных линиях, так как уровень экспрессии белков-активаторов, связывающихся с этим сайтом, там очень низкий.
В положении +880-891 находится сайт связывания белка CBF, представляющего гетеродимер, состоящий из повсеместно представленной Р-субъединицы и набора различных а-субъединиц, кодируемых тремя различными генами, CBFA1, CBFA2 и CBFA3 [35]. В клетках линии CSML-100 с этим регуляторным элементом взаимодействует гетеродимер CBFAl-CBFp, повышая на 50% энхансерную активность участка +782-916, тогда как в клетках линии CSML-0 субъединицы CBFA1 и CBFA2 не экспрессируются на детектируемом уровне, и данный регуляторный элемент не работает [32]. Последним в данном энхансере является сайт АР-1 в положении +902-908. Он активно работает в клетках линии CSML-100, где высок уровень экспрессии белков Fra-1, Fra-2 и Jun-D, в отличие от клеток линии CSML-0, где уровень экспрессии указанных белков низок, причем синхронная экспрессия белков CBFA1 и Fra-І в
клетках линии CSML-0 при* их оптимальном соотношении в 6 раз увеличивает уровень экспрессии репортерного гена в конструкции, содержащей участок энхансера +782-916 [32].
Наконец, следует упомянуть о белке-репрессоре Каизо, связывающем симметрично метилированные цитозины в последовательности CGCGCCCAACG, находящейся в положении +837-847 в энхансере гена mtsl [36]. Поскольку его связывание в данном случае опосредованно метилированием, прямого влияния на экспрессию он, очевидно, не оказывает.
Совсем недавно появились неоспоримые доказательства
влияния сигнального пути через комплекс, связанный с Е-
кадгерином, на репрессию гена mtsl, которое давно предполагалось, исходя* из работы японских авторов [37], показавших семикратное уменьшение количества мРНК гена mtsl в клетках опухолевой линии G-415 GB (рак мочевого пузыря) после трансфекции в них экспрессирущей Е-кадгерин конструкции. Был обнаружен новый регуляторный элемент, находящийся в положении —671- -673 (TTTTGTT), связывающий комплекс Р-катенина с TCF, что приводит к резкому увеличению уровня экспрессии S100A4 и, как следствие, к увеличению подвижности in vitro и инвазивности in vivo опухолевых клеток [38]. Эта работа настолько корректная и ясная, что выводы, сделанные в ней, не вызывают никаких сомнений.
Интерес представляет также влияние транскрипционного фактора CBFA-1, отвечающего за дифференцировку остеобластов и уровень минерализации соединительной ткани [39]. В периодонтальном лигаменте экспрессия S100A4 через неустановленный молекулярный механизм предотвращает минерализацию этой ткани [40], но при этом уровень экспрессии
таких генов как CBFA-1 и Osx, необходимых для минерализации, остается неизменным [41]. Как согласуется активирующее экспрессию S100A4 действие CBFA-1 с ингибирующим минерализацию влиянием самого S100A4, остается непонятным. Очевидно, что потребуется целый ряд экспериментов, чтобы понять в деталях, через какие молекулярные механизмы внешние сигналы управляют в разных тканях уровнем экспрессии гена mtsl, и как сам S100A4 способен регулировать экспрессию других генов.
Тканевая локализация S100A4.
Сегодня о тканевой специфичности экспрессии гена mtsl
известно, если не все то очень многое: Пожалуй, самым логичным
выглядит его высокий уровень экспрессии в клетках способных к
активному перемещению в организме: Т-лимфоцитах, макрофагах,
гранулоцитах [42, 43]. S100A4 обнаружен в астроцитах белого
вещества [44], фибробластах периодонтального лигамента [40];
кератиноцитах различных эипдермальных тканей [45, 46],
гладкомышечных клетках [47], дифференцирующихся
мезенхимальных клетках [41, 46, 48]. Главной задачей в каждом из перечисленных случаев является обнаружение сигнальных путей с участием S100A4.
S100A4b гладкомышечных клетках артерий.
S100A4 был обнаружен во внеклеточном пространстве гладкомышечного слоя стенки аорты быка, где он был распределен вдоль фибрилл тропоэластина, взаимодействуя с гликопротеином MAGP-36 [47]. Данный' гликопротеин гомологичен порцину и взаимодействует с S100A4 in vitro в присутствии ионов кальция [47]. Гладкомышечные клетки аорты в культуре проявляли
способность конститутивно секретировать S100A4 [47]. Какое биологическое значение:в,данной ткани имеет секреция S100A4 до настоящего времени не известно.
Экспрессия S100A4 была обнаружена в. гладкомышечном* слое легочной артерии, а также внутренних артерий? легких в. ответ на длительную гипоксию, которая сопровождалась утолщением интимы артерий за счет гиперплазии гладкомышечных клеток [49]. Ранее было показано, что такого рода патологические изменения в стенках артерий, вызванные хроническим воспалением, различной этиологии, можно существенно уменьшить, блокируя сигнальный путь через: RAGE [50]. Развитию подобной патологии в легочной артерии приводит также чрезмерная активация сигнального пути через серотониновый рецептор и транспортер серотонина (SERT) [51] которые в норме экспрессируются в гладкомышечных клетках артерий. Было установлено; что стимуляция культивируемых клеток PDGF (10 нг/мл), либо рекомбинантным S100A4 (500нг/мл или 25 нМ), либо серотонином (10 мМ) приводит к семикратному увеличению скорости пролиферации клеток и к двукратному увеличению их подвижности in vitro относительно контроля. При этом добавление серотонина (10 мМ) приводит к повышению концентрации внеклеточного S100A4 в 2 раза; а уровень мРНК S100A4 увеличивается в 3;5 раза относительно контроля. Активность серотонинового транспортера также необходима для увеличения уровня экспрессии S100A4. Авторы, полагают, что> секретируемый: S100A4 действует на RAGE (Reseptor for Advanced Glycasion End products); аутокринно или паракринно, что приводит к повышенной: пролиферации и подвижности гладкомышечных клеток [51]: Однако' следует учесть, что в норме гладкомышечные клетки артерий
экспрессируют другой лиганд RAGE, относящийся к семейству белков S100, - белок S100B, и уровень его экспрессии возрастает по мере прогрессии патологического разрастания гладкомышечного слоя стенок артерий, причем это разрастание ингибируется выключением тем или иным способом сигналов через RAGE [50]. В культуре гладкомышечных клеток S100B сходным образом влияет на их миграцию и пролиферацию [50]. Возможность действия S100A4 на сигнальный путь через RAGE была показана при исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе развития артрита.
Роль S100A4 в прогрессии артрита.
Было обнаружено, что S100А4 экспрессируется в синовиальных фибробластах больных ревматоидным артритом, детектируется в их синовиальной жидкости [52], а также в хондроцитах хряща больных остеопоритом, причем уровень его экспрессии возрастает по мере прогрессии патологии, но не детектируется в норме [48]. Исследования, выполненные на культуре синовиальных фибробластов, выделенных из биопсийного материала больных ревматоидным артритом, показали, что при добавлении в культуральную среду олигомерной формы рекомбинантного S100A4 в концентрациях 1-4 мкг/мл происходит увеличение в 4-8 раз уровня мРНК металлопротеаз ММР-1, ММР-3, ММР-9, ММР-13 [52].
В культуре таких хондроцитов внеклеточный рекомбинантный S100A4 стимулировал увеличение уровня экспрессии активной металлопротеазы ММР-13 [48]. Действие S100A4 почти полностью блокировалось добавлением в среду 10 мкг/мл растворимой формы RAGE (sRAGE) или МпТВАР (250 мкМ), ингибитора активных форм кислорода (ROS) [48]. Стимулирование хондроцитов белком S100A4
приводило к быстрому, детектируемому уже через 15-30 минут, повышению уровня фосфорилирования таких киназ, как. ERK 1/2, р38, Рук2 и JNK , а позднее белка; NE-kB- [48]. Интересно, что фосфорилирование киназы Pyk2, ERK 1/2, белка NF-kB (р65), а.также индуцированный белком S100A4 синтез ММР-13 блокировались ингибитором высвобождения внутриклеточного кальция, ВАРТА-AM^ но не нифедипином, блокатором потенциалзависимых кальциевых каналов [48]. Индукция ММР-13 блокировалась также ингибиторами МАР-киназ PD 98059 и SP-600125. Эти факты могут свидетельствовать о более сложном, чем только через активацию RAGE, сигнальном» пути, задействованном в данной системе, где пресекаются- сигналы, приводящие к образованию ROS, выходу внутриклеточного кальция и активации МАР-киназ.
Методом ко-преципитации было показано, что RAGE изшизата описанных выше хондроцитов может взаимодействовать с .S100A4; и это взаимодействие блокируется добавлением в среду избытка растворимой формы рецептора, sRAGE [48]
Єледует особенно подчеркнуть, что в данной работе использовались хондроциты больных остеопоритом: людей, и не ставился параллельный эксперимент с хондроцитами здоровых. Дело в том, что противоречия, наблюдаемые при использовании разных модельных систем; где либо выявлено непосредственное взаимодействие S100A4 с RAGE на фоне активации данного сигнального* пути, либо - нет, можно объяснить наличием полиморфизма данного рецептора в сайте,.связывающем лиганд, как это показанодля S100A12, уровень экспрессии которого повышен в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, но не обнаруживается у больных остеоартритом, причем уровень
экспрессии этого белка хорошо корелирует со степенью развития
патологии [53]. У данных больных обнаруживается вариант RAGE с
заменой G82S в сайте, связывающем лиганд, что приводит к
повышению аффинности взаимодействия S100A12 с таким
вариантом рецептора и увеличивает воспалительный ответ, а
индивиды с таким генетическим вариантом RAGE являются
предрасположенными к развитию ревматоидного артрита [54].
Возможно, что S100A4 эффективно взаимодействует лишь с
некоторыми полиморфными вариантами этого рецептора,
способствуя развитию патологии, но не оказывает влияния в норме.
S100A4 в клетках нервной ткани.
Экспрессия S100A4 была детектирована
иммуногистохимическими методами в астроцитах белого вещества
спинного мозга, и уровень этой экспрессии мог существенно
повышаться после повреждения спинных отростков [55]. В
экспериментах на культурах астроцитов белого вещества было
установлено, что снижение уровня экспрессии S100A4 методом
РНК-интерференции повышает скорость миграции астроцитов и
уровень экспрессии металлопротеаз МТ1-ММР и ММР-9 [56]. При
создании механическим способом участка свободного от
культивируемых клеток, быстрая миграция и восполнение клеточного монослоя происходит лишь в случае подавления экспрессии данного белка, тогда как исходные клетки, экспрессирующие S100A4, не заполняют свободную область, образуя лишь гипертрофированные выросты в ее направлении [57]. Снижение уровня экспрессии S100A4 с использованием ингибиторной РНК в астроцитах при совместном культивировании с ними нейронов дорсальных ганглиев
приводит к более быстрому росту нейритов, чем в случае с использованием исходных астроцитов, экспрессирующих S100A4 [58]. Положительное влияние S100A4 на дифференцировку нейронов гиппокампа и рост их аксонов в культуре было показано в работе [59], где использовались димерная и олигомерная фракции S100A4 в концентрациях 5-10 мкМоль. По невыясненным причинам только олигомерная фракция оказывала стимулирующий рост аксонов эффект. В более поздней работе, выполненной в той же научной группе под руководством Е.М. Луканидина, было показано, что положительное влияние олигомерной формы S100A4 на рост аксонов в культуре нейронов гиппокампа происходит через рецептор, сопряженный с белком класса Gq/11, который активирует PLC-P, что приводит к быстрой активации неселективных катионных каналов и потенциал-зависимых кальциевых каналов Т - и L - типа, быстрому входу ионов кальция внутрь клетки и, в конечном итоге, к запуску механизмов, осуществляющих изменение формы нейрона [60]. Было также показано, что связывание с гепарансульфатом, являющимся полисахаридной частью мембранных протеогликанов, необходимо для активации данного сигнального пути и роста аксонов.
Таким образом, в данной работе показано, что рецептором для S100A4 может являться один из членов семейства GPCR (G-Protein Coupled Receptor}, передающий сигнал через белок класса Gq/11.
Однако, остается невыясненным один очень важный вопрос: «Что представляют собой олигомерные формы S100A4, и существуют ли они в тканях и клетках млекопитающих?» В самом деле, гиперэкспрессия эукариотического белка в бактериальной клетке может приводить к образованию агрегатов с неправильно
сформированной третичной структурой. В случае S100A4 образуется большое количество растворимого белка, но при этом около 10-20% от его общей массы оказывается в высокомолекулярной (250' кДа) фракции после гель-фильтрации, и именно эта фракция, а не та, что соответсвует димерной* форме характерной для нативного S100A4, обладает описанным биологическим эффектом [59]. Следует отметить, что в последней работе [60] под сомнение ставится возможность S100A4 выступать в роли лиганда RAGE в отсутствии патологии. Амфотерин и S100A12, известные лиганды RAGE, оказывали на рост нейронов гиппокампа такое же влияние, как и S100A4, однако, их эффект ингибировался антителами к внеклеточной части RAGE для обоих лигандов, но не для S100A4, а действие S100A4 строго ингибировалось блокаторами сигнального пути через GPCRs. S100A12 in vitro легко блокировал связывание олигомерной и димерной форм S100A4 с иммобилизованным RAGE, и по данным плазменного резонанса связывание обеих форм S100A4 с RAGE давало идентичные сигналы. Все это заставляет критически относиться к данным результатам, ставя под сомнения некоторые выводы и воспринимая «биологические эффекты» олигомерных форм S100A4 скорее как артефакт, чем явление живой природы.
Роль S100A4 в ремоделировании внеклеточного матрикса.
Выше уже было сказано о влиянии внеклеточного S100A4 на уровень экспрессии ММР-13 в хондроцитах и уровень экспрессии ММР-9 в нейронах. Неудивительно, что немало работ было посвящено изучению влияния S100A4 на экспрессию MMPs (металлопротеазы вне клеточного матрикса) и их тканевых ингибиторов (TIMPs) и привязке выявленных изменений к
способности опухолевых клеток к метастазированию. Например, ингибирование экспрессии S100A4 методом РНК-интерференции в клетках нейробластомы приводило к снижению уровня мРНК ММР-2 и уменьшению подвижности и инвазивности данных клеток [61]. Осуществляемое тем же методом уменьшение изначально высокого уровня экспрессии S100A4 в клетках линии РС-3 аденокарциномы предстательной железы приводило к значительному снижению пролиферативного уровня, и высокой инвазивности этих клеток. Параллельно наблюдалось значительное уменьшение исходно высокого уровня экспрессии ММР-9, которое являлось, по данным из экспериментов с использованием репортерных конструкций, следствием уменьшения активности промотора соответствующего гена [62]. Эксперименты на клеточных культурах не всегда давали однозначные результаты. Так при репрессии S100A4 с помощью специфического к его мРНК рибозима в клетках остеосаркомы в фазе экспоненциального роста резко снижался уровень экспрессии TIMP-1 и МТ1-ММР, тогда как в состоянии клеточного монослоя никакой кореляции не наблюдалось. Более того, уровень экспрессии ММР-2 не зависел в пределах ошибки метода детекции от уровня экспрессии S100A4 на любой фазе роста, но наблюдалось снижение протеолитической активности ММР-2 в культуральной среде [63]. Во всех клонах при снижении уровня экспрессии S100A4 увеличивался уровень мРНК TIMP-2; а инвазивность клеток, измеренная при прохождении их через фильтр, покрытый Матригелем в камере Бойдена, снижалась на 25-60 % относительно контроля.
Некоторые авторы склонны интерпретировать подобного рода результаты как доказательство того, что S100A4 увеличивает метастатическую способность опухолевых клеток именно через
повышение активности металлопротеаз, разрушающих матрикс, но, в зависимости от условий и происхождения клеточных линий, такая связь не всегда существует. Например, стабильно трансфицированные конструкциями, экспрессирующими S100A4, клоны из опухоли молочной железы мыши не проявляют корреляции между уровнем экспрессии ММР-2 , ММР-9 и инвазивностью, как in vitro при прохождении через Матригель, так и in vivo после инъекции в молочную железу «голых» мышей [64]. Однако, в этих экспериментах обнаруживается прямая кореляция между уровнем экспрессии S100A4 и инвазивностью, как in vitro, в камере Бойдена, так и in vivo. Особенно важно то, что лишь клоны с умеренным или высоким уровнем экспрессии S100A4 дают метастазы в легкие, несмотря на то, что уровень эксперссии в них ММР-2 и ММР-9, примерно, такой же, как в клонах, экспрессирующих малые количества S100A4 [64]. Очевидно, что S100A4 регулирует еще какие-то важные для метастазирования процессы.
Добавление олигомерной, но не димерной формы S100A4 к культуре эндотэлиальных клеток SVEC 4-10 приводит к повышению уровня экспрессии ММР-13 (коллагеназа-3) и ММР-11, при этом повышается уровень экспрессии тканевых ингибиторов металлопротеаз, ТГМР1 и TIMP2, но резко понижается уровень экспрессии ингибитора активатора плазминогена урокиназноготипа, PAI-1 [65]. Повышение уровня активности ММР-13 во внеклеточной среде относительно контроля, где не было внеклеточного S100A4, было достоверно показано методом зимограции. Опять же вызывает сомнение активность только олигомерных форм S100A4..
Весьма интригующей оказалась способность внеклеточного S100A4 участвовать в активации тканевого активатора плазминогена
[66]. Работа была выполнена с использованием клеточной линии эпителиального происхождения НСЕС и рекомбинатных белков, тестированных на способность активировать плазминоген in vitro. Предпосылкой к ней явились данные о том, что S100A10, единственный член семейства S100, не способный связывать ионы кальция, взаимодействует на цитоплазматической мембране клеток с аннексином II, и образование этого гетеротетрамера приводит к активации тканевого активатора плазминогена (t-PA). Ко-иммунопреципитация in vitro рекомбинантных белков S100A4 и аннексина II показала, что взаимодействие происходит в присутствии ЕГТА, и для него важны первые 26 а.о. аннексина, где содержатся сайты для фосфорилирования S25 протеинкиназой С (РКС) и Y23 тирозинкиназой pp60src [66]. Использованные в работе клетки экспрессировали, но не секретировали S100A4 и ко-преципитировать указанные два белка из клеточного лизата авторам не удалось. Однако добавление в среду 1мкМ рекомбинантного S100A4 не только приводило к резкому изменению формы клеток, но и позволяло в присутствии ЕГТА ко-преципитировать из культуральной среды аннексии II. Эффект S100A4 на форму клеток проявлялся уже при концентрациях 10 нМ, а активация плазминогена на клеточной поверхности становилась заметной при добавлении S100A4 в концентрации 50-100 нМ, сопровождавшемся двумя отмывками клеток перед измерением активности. В бесклеточной системе S100A4 (1 мкМ) в присутствии ЕГТА и тканевого активатора плазминогена (t-PA) увеличивал скорость конверсии плазминогена в плазмин в 11 раз, понижая Km в 10 раз и увеличивая каталитическую эффективность t-PA, определяемую как Vmax/Km, в 7.6 раза [66].
Примерно, такие же значения указанных величин наблюдались в случае замены S100A4 на S100A10.
Эффект S100A4 полностью блокировался добавлением избытка 6-аминокапроновой кислоты или заменой двух лизинов на С-конце на остатки лейцина, свидетельствуя о том, что этот участок последовательности S100A4 ответственен за связывание плазминогена. В культуре клеток активация t-PA блокировалась добавлением избытка пептида из 15 а. о., соответствующих первым 15 а. о., в молекуле аннексина II [66]
Остаются без ответа некоторые вопросы, возникающие при анализе приводимых в статье фактов, поэтому данную работу следует рассматривать как начальный этап в изучении данного взаимодействия. Молекулярный механизм влияния S100A4 на регуляцию экспрессии и активации металлопротеаз пока остается не выясненным до конца, как и вопрос о значимости такой регуляции для повышения метастатического потенциала опухолевых клеток.
Влияние S100A4 на минерализацию костной ткани.
Неожиданный и интересный эффект экспрессии белка S100A4 наблюдается в периодонтальном лигаменте; который представляет собой тонкий слой неминерализованной соединительной ткани между эмалью зуба и алвеолярной костной тканью челюсти. Клетки периодонтального лигамента обнаруживают самый высокий в челюстных тканях уровень экспрессии S100A4, который во внеклеточном пространстве располагается вдоль фибрилл внеклеточного матрикса, возможно, в комплексе с белком MAP массой 36 кДа [40], как это было ранее обнаружено в гладкомышечном слое стенки аорты. В челюстных тканях мРНК
S100A4 детектируеся также в одонтобластах, гладкомышечных
клетках мелких артерий пульпы и остеобластах, непосредственно
прилегающих к периодонтальному лигаменту [40]. В культуре
клетки периодонтального лигамента секретируют S100A4. При
добавлении рекомбинантного S100A4 в культуру клеток костного
мозга в концентрации 50мкг/мл (2.5 мкМ) происходит существенное
снижение количества очагов минерализации, а при увеличении его
концентрации до 100 мкг/мл, наблюдается полное блокирование
минерализации внеклеточного матрикса [40]. На сколько точно
отражает ситуацию в периодонтальном лигаменте in vivo действие
высоких концентраций S100A4 на культуру клеток, остается
непонятным. В культуре клеток периодонтального лигамента при
ингибировании экспрессии S100A4 методом введения малых
ингибиторных РНК, специфичных к мРНК S100A4, наблюдается
увеличение экспрессии остеопонина, остекальцина,
транскрипционных факторов Runx2/Cbfal и Osterix - маркеров характерных для остеобластов [67]. При дифференцировке остеобластов в клеточной культуре уровень экспрессии S100A4 устойчиво снижается, достигая к 21-му дню уровня, не детектируемого с помощью антител, а уровень минерализации внеклеточного матрикса, наоборот, возрастает, достигая максимума, к концу указанного временного интервала [41]. Таким образом, есть основания полагать, что S100A4 может участвовать в сигнальном пути, регулирующем степень дифференцировки остеобластов и, как следствие, уровень минерализации ткани.
Внутриклеточные взаимодействия S100A4. S100A4 и р53.
Было известно, что S100B, член семейства S100, in vitro
способен связывать р53 и предотвращать его агрегацию в тетрамеры
[68]. В группе Е. М. Луканидина попытались исследовать
взаимодействие S100A4 и р53 in vivo и in vitro. В отличие от не
давшей положительного результата ко-иммунопреципитации этих
белков из лизата клеток, помеченных радиоактивным метионином,
было обнаружено взаимодействие S100A4 и р53 при ко-
иммунопреципитации рекомбинантных белков in vitro, в которой
кроме полноразмерного р53 использовались его- домены. Методом
иммуноблотинга было обнаружено, что S100A4 ко-
преципитировался с полноразмерным р53 и с его С-концевым фрагментом (289-390* а. о.). Идентичный результат был получен с использованием технологии overlay, где S100A4, связавшийся с р53 и его фрагментами, детектировался на мембране соответствующими антителами. При использовании хроматрографии- на глутатион-сефарозе, где в качестве сорбированого белка выступал GST-p53, а растворимым являлся S100A4, в отсутствии какого-либо неспецифического конкурента и отмывок высокосолевым буфером оказалось, что полноразмерный р53 взаимодействует с S100A4 в несколько раз сильнее, чем усеченная форма, без остатков 364-393, представляющих собой домен негативной регуляции данного белка, в котором находятся сайты фосфорилирования, по S392 для киназы GK II и S371, S376, S378 для- PKG. In vitro рекомбинантный S100A4 ингибирует фосфорилирование р53 киназой РКС, но не GK П. Ингибирование фосфорилирования р53 в этом сайте может иметь регуляторное значение, хотя in vivo этот вопрос не изучался [69].
Однако, при изучении взаимодействия S100A4 и фрагментов
р53 методом измерения флуоресцентной анизотропии и с
использованием аналитического > ультрацентрифугирования
оказалось, что взаимодействие с фрагментом 367-393 обладает очень высокой константой' диссоциации (Kd = 0.001), тогда как взаимодействие с фрагментами 325-355 (домен, ответственный, за" тетрамеризацию р53) и 293-393 имеют Kd = 17 мкМи Kd = 10 мкМ, соответственно [70]. Для более корректного сравнения результатов этих, двух независимых экспериментов не хватает исследования констант диссоциации с участием небольшого участка аминокислотной последовательности, 355-367 а. о. , чтобы сделать окончательные выводы о том, с каким участком р53 связыается S100A4, но на основании того, что избыток пептида 325-355 в 6 раз повышает Kd его комплекса с S100A4', а мутантный пептид L344P, не способный тетрамеризоваться, не изменяет Kd комплекса при увеличении концентрации этого пептида (Kd = 35 мкМ), авторы предполагают взаимодействие S100A4 с доменом, ответственным за тетрамеризацию р53 (325-355), а не с регуляторным доменом (377-393).
Неожиданной оказалась способность S100A4 ингибировать связывание р53 с участком- промотора гена р21 в EMSA (ElectroMobility Shift Assay), так как нет опубликованных достоверных данных об ядерной локализации S100A4, причем действие S100A4 полностью, блокировалось, добавлением ЕГТА. В' клетках линии CSML-0, не экспрессирующих S100A4, активность люциферазы под промотором гена р21 снижалась на 60% относительно контроля (без экзогенного S100A4) при ко-трансфекции данной репортерной конструкции с вектором,
экспрессирующим S100A4, а в клетках линии VMR-liv активность
люциферазы снижалась только на 35% в аналогичном эксперименте.
При использовании промотора гена Вах активность люциферазы
повышалась на 40% (CSML-0) и 25% (VMR-liv) [69]. Интересно, что в
этой же работе авторы вызывали апоптоз при трансфекции в
указанные клеточные линии вектора, экспрессирующего S100A4.
Авторы проводят идею о том, что S100A4 выступает вместе с р53 в
качестве проапоптотического фактора и, кроме приведенных здесь
экспериментов, подтверждают свою мысль, давая подборку из 2 5-ти
опухолевых клеточных линий, в которых не наблюдается совместной
экспрессии wt-p53 и S100A4 - только порознь [69].
Эксперименты с генетическим нокаутом mtsl показали, что в ответ
на гамма-облучение уровень экспрессии р21 в селезенке был в 2.5
раза выше, а гена Ьах в 2 раза выше, у мышей дикого типа по
сравнению с нокаутными по mtsl мышами [71]. В тимусе уровень
экспрессии упомянутых генов был примерно одинаков у нокаутных
по mtsl и нормальных мышей, а процент апоптотических ядер в
селезенке после облучения был в 1.5 раза выше у мышей дикого типа
[71]. Интересно, что у нокаутных мышей в 10% случаев наблюдались
спонтанные неметастазирующие опухоли, в которых р53 был
нефункционален, несмотря на отсутствие S100A4 у данных
животных. К сожалению, ни в» лаборатории Е.М. Луканидина, ни в
какой-либо другой лаборатории за последние пять лет не было
получено опубликованных результатов исследований,
подтверждающих достоверность наблюдаемых in vitro молекулярных взаимодействий, описанных выше, в ситуации in vivo, поэтому остается под вопросом сам факт прямого взаимодействия р53 и S100A4 в клетке и биологическое значение этого взаимодействия.
Эксперименты с трансфицированными клеточными линиями и генетическим нокаутом mtsl дали противоречивые результаты, которые могут быть интерпретированы по-разному, в том числе, с помощью совершенно не связанных с прямым взаимодействием указанных белков схем передачи сигналов в клетке, приводящих к активации или ингибированию транскрипционной функции р53. Дальнейшего развития тема о взаимодействии S100A4 с р53 не получила, несмотря- на' огромное количество работ и прогресс в изучении этого важнейшего (р53) белка.
Взаимодействие тяжелой цепи не мышечного миозина ПА и S100A4.
Самым первым из, обнаруженных белков-партнеров S100A4 оказался не мышечный миозин второго типа, точнее его тяжелая цепь, обозначаемая в дальнейшем как ТЦНМ-ПА. Этот белок ко-преципитировался антителами к S100A4 в присутствии і ионов кальция из клеточного лизата линии CSML100, ко-мигрировал в сахарозном градиенте и обнаруживал ко-локализацию в клетке [72].
Сайт связывания S100A4 с ТЦНМ-ПА расположен на С-конце в области 1909-1924 а. о. и содержит внутри себя сайт связывания РКС, при этом S100A4 ингибирует фосфорилирование Serl917 этой киназой [73, 74], а также ингибирует фосфорилирование Serl944 киназой СК II [75]. Фосфорилирование по этим сайтам ингибирует сборку миозиновых филаментов, образованных как ТЦНМ-ПА, так;и ТЦНМ-ІІВ, причем фосфорилирование Serl917 не влияет на взаимодействие с S100A4, несмотря на его нахождение внутри сайта связывание, а вот фосфорилирование Ser 1944 уменьшает аффинность взаимодействия с S100A4 в 6.5 раз [76]. S100A4
проявляет на порядок большее сродство к олигомеру ТЦНМ-ПА, чем к олигомеру ТЦНМ-ПВ, повышая критическую концентрацию полимеризации ТЦНМ-ПА в 11 раз [74]. S100A4 способен in vitro почти полностью деполимеризовывать фосфорилированные РКС филаменты ТЦНМ-ПА, ингибируя их сборку и ускоряя разборку, но* не влияет на динамику сборки-разборки ТЦНМ-ПА, фосфорилированных по Ser 1944 киназой СК II [76]. Таким способом может осуществляться тонкая- регуляция динамики миозиновых филаментов в клетке, зависимая, в том числе, и от внутриклеточной концентрации ионов кальция и магния [76]. Мутантные формы S100A4, содержащие замены Asp 66 Asn , Glu 33 Gin и не способные связывать ионы кальция, перестают in vivo связывать ТЦНМ-ПА, хотя остаются способными димеризоваться и сохранять характерную внутриклеточную локализацию [77].
Другие внутриклеточные взаимодействияя S100A4.
Общеизвестно, что возможность физического взаимодействия двух белков in vitro, либо в двугибридной системе еще не означает их биологически значимого взаимодействия in vivo, но на первоначальном этапе исследования эти данные, несомненно, представляют интерес. Для S100A4 на сегодняшний день существует ряд подобных фактов, пока не получивших дальнейшего подтверждения своей биологической значимости.
S100A4 взаимодействует с S100A1 в двугибридной системе [78], а также in vivo по данным, полученным с использованием метода FRET [79]. Константа диссоциации комплекса S100A4/S100A1, измеренная in vitro, равна 0.3 мкМ, и она в два раза меньше, чем константа диссоциации комплекса S100A4/S100A4 [79].
При эквимолярных концентрациях эти два белка в растворе образуют
гетеродимер, который не способен диссоциировать филаменты,
образованные ТЦНМ-ІІА и существенно снижать степень
фосфорилирования ТЦНМ-ІІА in vitro протеин-киназой! С [79].
Эффект S100A1 проявлялся in vivo. Когда клетки линии Rama 37,
изначально экспрессирующие только S100A4, были
трансфицированы вектором, экспрессирующим S100A1, частота образования метастаз после их инъекции сингенным мышам снижалась в четыре раза, а частота метастазирования в мышцы в два раза по сравнению с таковыми при инъекции клеток исходной, не трансфицированной, линии Rama 37 [79]. Существует ли в норме в клетках организма такой гетеродимер, и может ли он играть какую-то роль, как, например, гетородимер S100A8/S100A9, на данный момент неизвестно.
S100A4 был ко-преципитирован с липрином-рЧ из клеточных лизатов линии CSML100, экспрессирующей высокий уровень, S100A4, или из клеточной линии VMR-liv с индуцируемой тетрациклином системой экспрессии. S100A4 [80]. В этих линиях S100A4 мог быть ко-преципитирован антителами к липрину-|31, и их внутриклеточная ко-локализация хорошо обнаруживалась с помощью соответствующих антител [80]. S100A4 связывается с С-концевым участком в районе 938-1005 а.о. и способен ингибировать in vitro фосфорилирование липрина-рЧ на этом участке протеин-киназами С и СК II [80]. Интересно; что при этом происходило интенсивное фосфорилирование самогоі S100A4, что вызывает некоторые подозрения на артефакт. Липрин-pl способен взаимодействовать с трансмембранной тирозин-фосфатазой LAR, которая, в свою очередь, формирует комплекс с белком Trio,
содержащим домены, регулирующие обмен гуаниновых нуклеотидов в ГТФ-азах семейства Rac и Rho, хорошо известных регуляторов клеточной формы и подвижности [81]. К сожалению, дальнейшего развития эта работа не получила.
В двугибридной системе- было обнаружено взаимодействие S100A4 с интересным белком CCN3/NOV [82], представителем группы CCN, состоящей из 6-ти гомологичных членов, которые участвуют в таких фундаментальных процессах, как ангиогенез, хондрогенез и заживление ран.
Наконец, методом аффинной хроматографии из клеточного лизата линии NIH ЗТЗ на матриксе с GST-тропомиозином 2 был выделен S100A4, который в присутствии ионов кальция связывается с участком 39-107 тропомиозина-2 [83]. Дальнейшего развития эта работа не получила.
Заключение.
За последние 10 лет исследований были накоплены факты, опираясь на которые можно сегодня более-менее обоснованно предполагать, через какие молекулярные механизмы S100A4 мог бы способствовать формированию метастатического потенциала опухолевых клеток. Очевидно, что для этого белка существует не только внутриклеточная роль и соответствующий ей набор белков-партнеров, но и внеклеточная, предусматривающая наличие для него рецепторов на клеточной поверхности и белков-партнеров из внеклеточного пространства, представляющих собой либо компоненты внеклеточного матрикса, либо некие растворимые лиганды, как например, CCN3. Не имея классического сигнала внеклеточной локализации, S100A4 мог бы секретироваться неканоническим путем, в
котором задействованы комплексы, содержащие аннексии II и S10013,
как показано в случае секреции FGF-1 и IL-la (Mandinova 2003).
Наиболее вероятным кандидатом на роль рецептора для S100A4, по
крайней мере, при таких описанных выше патологиях, как
ревматоидный артрит, является RAGE. Не исключено, что
рецептором для S100A4 может быть один (или несколько) из представителей огромного семейства рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCRs). Как S100A4 осуществляет регуляторные функции внутри клетки, изменяя, например, уровень экспрессии Е-кадгерина или некоторых металлопротеаз и их ингибиторов, и имеются ли таковые в отношении экспрессии других белков, на сегодняшний день точно неизвестно. Среди эффекторных механизмов, имеющих непосредственное отношение к клеточной подвижности, в которых задействован' S100A4, известен лишь один: регуляция сборки-разборки филаментов немышечного миозина ПА. Представляется весьма вероятным, что для индукции метастатического фенотипа необходимо участие S100A4 в нескольких различных регуляторных и эффекторных процессах. Когда эти процессы будут изучены на молекулярном уровне, и роль S100A4 в них будет достоверно установлена, тогда, наверное, можно будет точно ответить на вопрос о том, как S100A4 способствует повышению инвазивности опухолевых клеток.
Интересно, нокаутные по mtsl мыши живут и размножаются, не проявляя каких-то заметных отклонений от нормы, за исключением аномального соотношения самцов и самок в потомстве (2:1 против 1.09: 1 в норме), что может свидетельствовать либо об избыточности функции S100A4 в организме, либо об его участии в тонкой настройке каких-то свойств клеток определенных типов (84). К сожалению, данные о каких-то тонких различиях клеток из мышей дикого типа и из
нокаутных мышей пока не опубликованы, если они имеются вообще, но эксперименты с иммортализованными фибробластами нокаутных мышей в культуре и in vivo вывели исследования на новый уровень, на котором главным предметом изучения стало взаимодействие опухолевых клеток с клетками опухолевой стромы и клетками микроокружения опухоли. Оказалось, что при подкожных инъекциях нокаутным мышам клеток карциносаркомы молочной железы мыши, CSML-100, дающих метастазы в легкие в 100% случаев в организме мышей дикого типа, первичные опухоли развиваются лишь у 45% нокаутных по mtsl животных, а метастазов не наблюдается вообще. (Naaman С 2004). Не исключая возможности иммунного ответа организма нокаутных мышей на S100A4, присутствующий в клетках CSML-100, следует отметить, что подобные эксперименты с клетками CSML-0, не обладающими способностью метастазировать в мышах дикого типа и экспрессировать S100A4, но образующими в них первичные опухоли в 100% случаев, выявили снижение на 26% частоты опухолеобразования в нокаутных мышах [84]. Более того, подкожная ко-инъекция иммортализованных эмбриональных фибробластов дикого типа (mtsl +/+) с клетками CSML-100 в организм нокаутных мышей повышала частоту образования первичных опухолей до 67%, тогда как использование подобных фибробластов из эмбрионов нокаутных мышей - до 50% (против 45% в случае инъекции только клеток CSML-100). Гистологическое исследование опухолей, сформированных клетками линии CSML-100, выявило резкие отличия в расположении и обильности элементов опухолевой стромы в нокаутных мышах и мышах дикого типа. В мышах дикого типа опухоли были обильно инфильтрированы макрофагами, миофибробластами и имели хорошо развитую сеть капилляров, тогда
как в опухолях, сформировавшихся в нокаутных мышах, капилляры были редки, а макрофаги, лимфоциты, и миофибробласты концентрировались на периферии опухоли [84]. К сожалению, авторы не приводят данных о гистологическом исследовании опухолей, сформированных в нокаутных мышах и мышах дикого типа клетками линии CSML-0 и клетками CSML-100 при их ко-инъекции с иммортализованными эмбриональными фибробластами дикого типа (MEF), а также опухолей, сформированных клетками линии VMR , не экспрессирующими S100A4 и способными давать метастазы в легкие и печень в 100% случаев при их подкожной инъекции в организм мышей дикого типа. Клетки линии VMR интересны тем, что стимулируют резкое увеличение секреции S100A4 клетками MEF при совместном культивировании или добавлении их культуральной среды, к отдельно культивируемым клеткам MEF [85]. Совместное культивирование изменяет форму клеток VMR , придавая им более распластанный фенотип с большим количеством фокальных контактов и актиновых стресс-фибрил. Подобного рода изменения возникают при добавлении в культуральную среду клеток VMR рекомбинантного S100A4, приводя также к накоплению в среде через 24 часа активной формы ММР-13, но в случае использования высокомолекулярных агрегатов S100A4 [85]. Эти факты поднимают вопрос о причинах резкого уменьшения случаев опухолеобразования в нокаутных по mtsl мышах и роли S100A4, но ответить на этот вопрос коректно не представляется возможным, так как отсутствует ряд необходимых для этого экспериментов, часть из которых указана выше: Авторы приводят значения концентраций S100A4, вымываемого из удаленных опухолей при различных, но не всех необходимых для корректных выводов, вариантах их формирования. Разница концентраций S100A4 между
опухолями, сформированными клетками CSML-100 (100% животных с первичными опухолями и метастазами) в мышах дикого типа и нокаутных мышах при ко-инъекции клеток MEF составляет всего лишь 25% в пользу последних. При этом опухоли в нокаутных мышах при ко-инъекции клеток MEF дикого типа образуются в 67% случаев и. в 50% случаев, когда используются MEF из нокаутных мышей, и где концентрация S100A4 почти вдвое ниже [85]. При этом следует учесть, что клетки MEF дикого типа обладают гораздо большей подвижностью и инвазивностью in vitro, чем клетки MEF из нокаутных мышей [85]. Так что же повышает на 30% (67% по сравнению с 50%) частоту формирования первичных опухолей в нокаутных мышах: повышение в 2 раза концентрации S100A4 в опухоли или наличие в ней еще в процессе формирования, иммортализованных высокоинвазивных эмбриональных фибробластов, экспрессирующих S100A4? В данном случае можно лишь спекулировать на том, что клетки указанных типов у взрослых нокаутных мышей имеют пониженную пластичность и способность к проникновению в первичную опухоль, где изначально отсутствуют элементы стромы, и это не зависит от наличия внеклеточного S100A4 в первичной опухоли (опять же, нет гистологических данных по опухолям, сформированным клетками линии CSML-0 в нокаутных мышах и мышах дикого типа). Очень жаль, что эксперименты с нокаутными мышами носили спонтанный характер и не были доведены до логического конца.
На этапе эмбрионального развития, возможно, существует дублирование функций S100A4 за счет экспрессии каких-то других белков, может быть, из семейства S100, но во взрослом организме эти белки не экспрессируются или экспрессируются слабо, что снижает инвазивность определенных типов клеток, как внутри опухоли, так и в
нормальных тканях, а это влечет за собой образование редуцированной стромы внутри опухоли, пониженной инфильтрации ее макрофагами, основными источниками FGF1, который стимулирует ангиогенез в первичной опухоли.
Интересно, что клетки линии VMR, введенные внутривенно, не формируют метастазы в мышах дикого типа, но при трансфекции в них вектора, экспрессирующего S100A4, они приобретают способность давать множественные метастазы в легкие и печень в 100% случаев, хотя при подкожных инъекциях они это делают и без трансфекции в них указанного вектора [85].
Описанные в последней главе эксперименты, несмотря на их логическую незавершенность, позволяют предполагать, что для индуцируемого белком S100A4 метастазирования определенных типов опухолей необходимо его наличие как внутри, так и вне клетки, причем это может относиться не только к опухолевым клеткам, но и к определенным типам здоровых клеток организма, вступающих в сложные межклеточные взаимодействия друг с другом. Может быть, недалек тот день, когда ответы будут найдены.
Материалы и методы. Ферменты и реактивы.
В работе использовались ферменты, производимые фирмами Fermentas (Litvenia), Promega (USA), Gibco (USA) и реактивы производства фирм Sigma (USA) и Merck (Germany). Олигонуклеотиды были заказаны в фирме Syntol (Москва).
Плазмидные векторы.
В работе были использованы плазмидные векторы pQE30 (Qiagen) и pET30f (Novagen).
Штаммы бактерий.
Для амплификации рекомбинантных плазмид был использован штамм Е. coli XLl Blue MRF'. Для экспрессии белков использовался штамм Е. coli XLl Blue MRF' (в случае белка S100A4(MTS1), или штамм BL21 DE3 (в случае септинов).
Агарозный гель-электофорез ДНК.
Гель-электрофорез ДНК проводили в 0.4 - 1.5 % агарозном геле, содержащем буфер ТАЕ (Tris-Acetate-EDTA) с 0.5% бромистым этидием. ДНК детектировали с помощью трансиллюминатора в ультрафиолете (302 нм).
Трансформация клеток Б. coli с использованием СаСЬ.
Для трансформации с использованием СаСЬ компетентные клетки приготовляли как описано в [103]. Одной бактериальной колонией инокулировали 1-5 мл среды LB и растили в течение ночи.
Затем выросшей культурой инокулировали среду LB (при соотношении 1:100) и растили до ОБбоо 0.3-0.5 (-5x107 клеток/мл) при 37С с постоянным перемешиванием. По достижении культурой нужной плотности клеточную массу охлаждали во льду в течение 10 мин., клетки осаждали центрифугированием при 4000g, 4С в течение 5 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденного на льду раствора 50 мМ MgCb, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0. После центрифугирования (4000g, 4С, 5 мин.) клетки ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденном во льду раствора (50 мМ СаСЬ, ЮмМ Tris-HCl, рН8.0) и осаждали центифугированием при 4000g, 4С, 5 мин. Клетки ресуспендировали в 1/15 исходного объема (50 мМ СаС12, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для,трансформации к 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигированной смеси ДНК (1 мкг). Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду 60 мин. Пробирку быстро помещали в водяную баню при 42С на 90 сек. для теплового шока и обратно в лед. Затем добавляли 1 мл среды ЬВ и инкубировали на 37С в течение часа для экспрессии генов устойчивости к антибиотикам. Затем различные разведения клеток высевали на чашки с агаром и соответствующим антибиотиком и растили на 37С в течение ночи. Полученные колонии использовали для наращивания ночных культур и выделения плазмид.
Трансформация клеток Б. coli электропорацией.
Для приготовления компетентных клеток для электропорации одной колонией1 инокулировали 2.5 мл LB и растили в течение ночи. Затем ночной культурой инокулировали среду LB (1:100) и растили клетки до OD6oo=0.5-0.8. Клетки охлаждали во льду в течение 15-30 мин. и центрифугировали 5 мин. на 4000g, 4С. Клеточный осадок
ресуспендировали в 1 исходном объеме охлажденной стерильной воды (Mili-Q). После центрифугирования в том же режиме клетки ресуспендировали в S1/2 исходного объема воды, центрифугировали, ресуспендировали в охлажденном 10% глицерине и быстро замораживали в жидком азоте в виде аликвот по 40< мкл. Компетентные клетки хранили на -70 С. Перед трансформацией клетки оттаивали на льду и добавляли к ним' 1 мкл ДНК (10-100 нг). Смесь переносили в охлажденные кюветы (0.1 см) и помещали в электропоратор. Использовали следующие параметры: 2.4кВ, 25mkF, 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл среды SOC и качали клетки в среде при 37С в течение 1 часа без антибиотиков. После этого клетки высевали в различных разведениях на покрытые LB-агаром чашки Петри с соответствующим антибиотиком. Клетки растили в течение ночи.на 37С, отбирали колонии и выделяли из них плазмиды.
Выделение плазмидной ДНК.
Плазмидную ДНК выделяли по стандартной методике щелочным лизисом [103]. Полученный из 3-5 мл ночной культуры культуры клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 (25 мМ трис-HCl рН 8,0; 50 мМ глюкоза; 10 мМ ЭДТА), затем добавляли 400 мкл раствора 2 (0,2 М NaOH; 1% SDS), осторожно перемешивали и инкубировали 5 мин во льду. Добавляли 300 мкл З М ацетата калия рН 4,8, интенсивно перемешивали и инкубировали 30 мин. на льду. Плотную белую-массу (высоко молекулярная ДНК и клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин.. К супернатанту добавляли 400 мкл 40% (вес/вес) раствора ПЭГа, перемешивали и инкубировали во льду в течение 1 часа. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 5 мин.
осадок плазмидной ДІЖ растворяли в 100 мкл Н20. Примеси полисахаридов осаждали 200 мкл 7,5 М ацетата аммония, рН 7.5 в течение 5 мин при -70 С. После центрифугирования к супернатанту, содержащему плазмидную ДНК добавляли 0,6 объема изопропанола и инкубировали 1 минуту при комнатной температуре. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 10 минут осадок плазмидной ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в 50 мклНгО.
Получение поликлональной антисыворотки к белку S100A4(MTS1).
Раствор очищенного рекомбинантного белка MTS1 мыши был использован для иммунизации кролика. Первую иммунизацию животного проводили подкожно, с добавлением полного адъюванта Френда. Две следующие иммунизации проводились подкожно с интервалом в две недели, с добавлением неполного адъюванта Френда. Для каждой иммунизации использовалось 200 мкг рекомбинантного белка. Кровь для получения сыворотки брали из краевой вены уха спустя 1-2 недели после последней иммунизации. После выдержки при + 4 С в течение ночи свернувшуюся кровь центрифугировали (15 мин) при 3000 об/мин. К супернатанту добавляли сухой сульфат аммония до 50% от насыщения и оставляли на ночь на -20 С. Затем иммуноглобулины осаждали центрифугированием 20 минут при 3000 об/мин. Осадок растворяли в фосфатном буфере для дальнейшей аффинной очистки антител к S100A4.
Культивирование клеточных линий CSML-100 и CSML-0.
Клетки культивировали в инкубаторе с 5% С02 при 37С в 25 см и 75 см. пластиковых флаконах в среде DMEM (Gibco) с 10% FCS (Gibco) в присутствие 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл канамицина. При пересаживании на новый матрас клетки промывали и десорбировали с пластика раствором Версена (Gibco). Для проведения хроматографии и других экспериментов клетки замораживали в жидком азоте и хранили при - 70С.
Электрофорез в ДСН/ПААГ.
