Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 9
1.1. Систематика и экология рода Agaricus и вида Agaricus bisporus. 9
1.1.1. Систематика рода. 9
1.1.2. Экология рода. 13
1.1.3. Практическая значимость представителей рода . 14
1.2. Жизненный цикл агариковых грибов. 15
1.2.1. Общая характеристика. 15
1.2.2. Особенности жизненного цикла A.bisporus. 17
1.3. Характеристика ядерного аппарата видов рода Agaricus. 22
1.3.1. Вегетативный мицелий. 22
1.3.2. Плодовые тела (гимеиий и субгимепий). 24
1.3.3. Характеристика ядерных циклов вида A.bisporus. 27
1.4. Несовместимость у агариковых грибов. 29
1.4.1. Вегетативная несовместимость. 30
1.4.2. Половая несовместимость.
1.5. Методы и критерии отбора гомокарионов. 32
1.6. Использование изоферментов и метода электрофореза. 34
Глава 2. Материалы и методы. 37
2.1. Используемые в работе культуры. 37
2.2. Получение споровых отпечатков. 40
2.3. Питательные среды. 40
2.4. Поверхностное культивирование . 41
2.5. Глубинное культивирование. 41
2.6. Получение моноспоровых и мпогоспоровых культур. 42
2.7. Проведение гибридизации. 42
2.8. Получение плодовых тел Agaricus bisporus. 43
2.9. Микроскопия.
2.10. Электронная микроскопия. 44
2.11. Электрофорез. 44
Глава 3. Изучение свойств изолированных из природы штаммов шампиньона двуспорового (A.bisponis) и четырсхспорового штамма рода Agaricus .
3.1. Прорастание спор. 48
3.2. Скорость и характер роста мицелия 49
3.3. Определение ядерного статуса медленнорастущих культур. 52
3.4. Подтверждение ядерного статуса тестами на фертилыюсть . 53
3.5. Гибридизация.
3.5.1. Гибридизация на чашках с КГА. 54
3.5.2. Гибридизация на зерне.
3.6. Плодовые тела. 56
3.7. Изучение базидий и базидиоспор у плодовых тел исследуемых штаммов.
3.8. Исследование изоферментных спектров песпецифических эстераз методом электрофореза у штаммов рода Agaricus.
Заключение. 62
Иллюстрации к главе 3. 64
Глава 4. Особенности макро-, микроморфологии и ультраструктуры мицелия штаммов рода Agaricus при росте на разных типах сред .
4.1. Макроморфология колоний исследуемых штаммов при росте на агаризоваииых средах.
4.1.1. Макроморфология колоний штаммов рода Agaricus при росте на сусло-агаре .
4.1.2. Макроморфология колоний штаммов рода Agaricus при росте на картофельно-глюкозном агаре.
4.1.3. Макроморфология колоний штаммов рода Agaricus при 78 росте на голодном агаре.
4.2. Микроморфология мицелия штаммов рода Agaricus при росте на агаризованпых средах.
4.2.1. Микроморфология мицелия штаммов рода Agaricus при росте па сусло-агаре.
4.2.2. Микроморфология мицелия штаммов рода Agaricus при росте на картофельно-глюкозном агаре.
4.2.3. Микроморфология мицелия штаммов рода Agaricus при росте на голодном агаре.
4.3. Особенности роста исследуемых штаммов в глубинной культуре. 92
4.3.1. Макроморфология роста штаммов рода Agaricus в глубинной культуре (7-е сутки роста).
4.3.2. Микроморфология мицелия при росте в глубинной культуре.
4.4. Морфология митохондрий исследуемых штаммов при росте в поверхностной и глубинной культурах.
4.5. Особенности макро- и микроморфологии мицелия штаммов рода Pleutrotus.
4.5.1. Макроморфология колоний штаммов рода Pleurotus при росте на агаризованных средах.
4.5.2. Микроморфология мицелия штаммов рода Pleurotus на агаризованных средах.
4.5.3. Макроморфология роста штаммов рода Pleurotus в глубинной культуре.
4.5.4. Микроморфология роста штаммов рода Pleurotus в глубинной культуре.
4.5.5. Морфология митохондрий штаммов рода Pleurotus в поверхностной и глубинной культурах.
4.6. Влияние добавления порошкового агара и объема среды а колбе на рост мицелия исследуемых штаммов.
4.7. Поведение ядер в клетках мицелия штаммов рода Agaricus в поверхностной и глубинной культурах.
4.7.1. Размер интерфазных ядер. 112
4.7.2. Количество ядер в клетках мицелия.
4.7.2.1. Количество ядер в клетках мицелия возрастом 7 суток.
4.7.2.2. Количество ядер в клетках мицелия возрастом 28 суток.
4.7.2.3. Количество ядер в клетках глубинного мицелия (7-е сутки роста).
4.7.3. Ядерно-плазменное отношение. 124
4.8. Ультраструктура клеток видов рода Agaricus при росте в 127 поверхностной и глубинной культурах (7-е сутки роста).
4.9. Возврат к нормальному росту после глубинного культивирования.
4.10. Особенности роста штаммов рода Agaricus при разных температурах.
4.11. Влияние ингибиторов на рост штаммов Agaricus и Pleurotus в глубинной культуре.
Заключение. 149
Иллюстрации к главе 4. 153
Выводы. 178
Список литературы. 180
- Практическая значимость представителей рода
- Поверхностное культивирование
- Подтверждение ядерного статуса тестами на фертилыюсть
- Макроморфология колоний штаммов рода Agaricus при росте на сусло-агаре
Введение к работе
Актуальность темы.
Представители рода Agaricus являются объектом пристального внимания многих исследователей. Прежде всего, это вид Agaricus bisporus (Lange) Imbach - культивируемый шампиньон. По объему производства плодовых тел этот гриб занимает первое место в мире, его выращивают более чем в 80 странах (Xu et al., 1997; Chang, 1999). Одной из серьезных проблем в культивировании шампиньона является недостаток нового генетического материала для селекции сортов и штаммов (Дьяков и др., 1996; Гарибова, 2003). Во многих работах отмечен высокий уровень генетической гомологии коммерческих штаммов A.bisporus (Royse, May, 1982; Raper, 1987; Можина и др., 1993). Анализ диких популяций показывает, что они содержат большое количество новых генотипов, не представленных в коллекциях культивируемых линий (штаммов), и, соответственно, могут служить источником нового генетического материала, необходимого для селекции штаммов и сортов культивируемого шампиньона двуспо-рового (Raper, 1987; Kerrigan, Ross, 1989). Проблема использования диких штаммов в селекции заключается в том, что в природе они встречаются крайне редко (Гарибова, 1964; Гарибова, 2003). Поэтому поиск и идентификация дикорастущих штаммов шампиньона могут быть очень полезны в качестве источника нового генетического материала.
Ряд других видов рода также являются объектами промышленного культивирования или рассматриваются в качестве потенциально культивируемых видов (Elliott, 1978; Kerrigan et al., 1999; Calvo-Bado et al., 2000; Гарибова, 2003). Для некоторых представителей рода описана противо-микробная, противовирусная, противоаллергенная и противоопухолевая активность (Wasser, Weis, 1999; Mizuno et al., 1999; Ohno et al., 2001; Beel-man et al., 2004; Lin, Yang, 2006), в связи с чем особое внимание уделяется глубинному культивированию видов рода Agaricus.
Однако несмотря на отмеченную многими авторами практическую значимость видов рода Agaricus, имеются лишь единичные разрозненные работы, посвященные цитологическому анализу его представителей. Наиболее подробно исследована цитология вида A. bisporus (Evans, 1959; Степанова, Васильев, 1994; Камзолкина, 2005). Цитология и ультраструктура поверхностного мицелия других видов рода Agaricus практически не изучена, а исследования ядерного аппарата ограничены, как правило, подсчетом среднего числа ядер в клетке (Raper, 1976; Hou, Elliott, 1978; Raper, Кауе, 1978; Sonnenberg, Fritsche, 1989; Molitoris et al., 1996). Анализ роста глубинного мицелия ограничен биотехнологическими работами, в которых не уделяется внимание особенностям цитологии и биологии исследуемых объектов. В связи с возросшим научным и практическим интересом к агарикоидным грибам назрела необходимость провести подробное изучение морфологии, цитологии и ультраструктуры мицелия видов рода Agaricus.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: провести комплексное морфолого-цитологическое исследование 9 видов рода Agaricus, принадлежащих к разным экологическим группам.
Были поставлены следующие задачи:
Охарактеризовать критерии отбора дикорастущих штаммов вида А. bisporus.
Сравнить изоферментный набор неспецифических эстераз у д видов рода Agaricus, представителей гумусовых сапротрофов, подстилочных сапротрофов и сапротрофов - «гербофилов».
Исследовать макро- и микроморфологию мицелия д видов рода Agaricus в поверхностной культуре на разных средах и при разных температурах.
Исследовать макро- и микроморфологию мицелия д видов рода Agaricus в глубинной культуре.
Провести сравнительное описание ультраструктуры клеток мицелия видов рода Agaricus в поверхностной и глубинной культурах.
Исследовать влияние ингибиторов транскрипции и трансляции белков на рост глубинного мицелия видов рода Agaricus.
Научная новизна работы. Впервые проведено всестороннее цитологическое исследование 31 штамма из 9 видов рода Agaricus в условиях роста в поверхностной и глубинной культурах. Исследование микроморфологии мицелия показало общую для всех штаммов тенденцию к фрагментации мицелия и формированию хламидоспороподобных клеток при естественном старении мицелия, росте на несбалансированных средах, при повышенной температуре и в глубинной культуре.
Впервые для большинства штаммов рода Agaricus была описана дифференциация поверхностного мицелия на два структурно отличных типа: основной вегетативный мицелий и его производное - тонкий безъядерный мицелий. Подобную дифференциацию наблюдали только на среде сусло-агар у мицелия возрастом 7 суток и 28 суток.
Впервые проведено исследование ультраструктуры гетерокариотиче-ских штаммов 9 видов рода Agaricus, которое позволило выявить общую для всех исследуемых штаммов особенность структуры клеток мицелия при росте в глубинной культуре, заключающуюся в тесной ассоциации рибосом с внешней митохондриальной мембраной.
Продемонстрировано положительное влияние ингибиторов транскрипции и трансляции белков на рост глубинного мицелия штаммов рода Agaricus.
Охарактеризовано два типа распределения хондриома у видов рода Agaricus при росте на разных средах.
Практическая значимость. Охарактеризованы основные критерии отбора дикорастущих штаммов шампиньона двуспорового на примере трех выделенных из природы штаммов рода Agaricus. Данные исследования могут быть в дальнейшем использованы в грибоводческих хозяйствах,
а выделенные из природы и подробно исследованные штаммы вида А. bisporus могут представлять определенную ценность для последующей селекционной работы.
Проведенное исследование цитологии и ультраструктуры клеток мицелия штаммов рода Agaricus при росте в поверхностной и глубинной культурах имеет в основном фундаментальное значение и вносит вклад в понимание базовых процессов, контролирующих рост, развитие, старение и гибель грибной клетки. Практическое значение данного исследования обусловлено тем, что понимание ключевых этапов жизнедеятельности грибной клетки может помочь в решении ряда биотехнологических проблем, в частности, пролить свет на причины неудовлетворительного роста видов рода в глубинной культуре.
Штаммы рода Agaricus могут быть хорошим объектом для изучения феномена связи рибосом с внешней митохондриальной мембраной и процессов старения грибной клетки in vivo.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2003), Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С.Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л.Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005); Третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005); Международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» памяти профессора М.В.Гусева (Москва, 2006); Международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах - 2005», посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 2006); I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (2006), а также на заседаниях кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, 1 обзор сдан в печать.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения и четырех глав, посвященных обзору литературы, материалам и методам исследования, а также двух глав с описанием результатов, иллюстраций и заключений к каждой главе, выводов и списка литературы. Диссертация
Практическая значимость представителей рода
Жизненный цикл базидиальных грибов включает три фазы: гаплофазу, дикарио-фазу и диплофазу. Базидиоспора прорастает вегетативным мицелием, клетки которого содержат по одному ядру - моиокарион (первичный мицелий). У многих видов дальнейшее развитие нуждается в спаривании совместимых штаммов, которое ведет в образованию дикариона (вторичного мицелия). У таких видов гаплофаза может существовать неопределенно долгое время. Дикариофаза представлена клетками, содержащими по два ядра. Этот дикариотический мицелий может являться предпосылкой к половой репродукции, хотя и может существовать в вегетативном состоянии неопределенное время. На дикариотическом мицелии при определенных условиях могут образовываться плодовые тела, в гимениальном слое которых образуются базидии (КгЗЬпег, 1977). В базидиях происходит два основных этапа жизненного цикла - кариогамия, которая приводит к диплофазе, и мейоз, в результате которого образуются ядра, проходящие затем в споры.
Кариогамия может быть результатом слияния (Zakharov, 2005): 1. ядер из клеток мицелия, отличающихся по МАТ-локусу {аллогамия). 2. ядер из клеток одного мицелия, но образующегося в разных мейотических делениях (автогамия). 3. ядер из клеток одного мицелия и образовавшихся в результате одного мейотиче-ского деления (то есть внутритетрадное спаривание) (автомиксис). Мейоз происходит почти сразу после слияния ядер, постмейотические ядра поступают в базидиоспоры, которые образуются экзогенно на базидиях. У некоторых видов слияние ведет к стабильному диплоидному состоянию, образующему вегетативный мицелий. Таков жизненный цикл японских штаммов осеннего опенка Armillaria mellea (FT.) Karst. (Ota et al., 1998), у которого стадия дикариона утрачена и после слияния гиф первичного мицелия формируются клетки с одним диплоидным ядром без пряжек, то есть кариогамия протекает сразу после плазмогамии.
Переход от гаплофазы к дикариофазе и половому размножению может происходить по-разному у разных видов агариковых. Многим видам (например, Coprinus cinereus (Schaeff. ex Fr.)S.F.Gray, Pleurotus ostreatus (Jack.:Fr.) Kumm. и другим (Kuhner,1977)) для перехода к половому размножению необходимо слияние двух совместимых штаммов (гетероталлизм). Базидиоспора прорастает первичным стерильным мицелием. При слиянии разнокачественных первичных мицелиев образуется фер-тильный гетерокариотический мицелий.
Для базидиальных грибов характерен физиологический гетероталлизм, при котором скрещивающиеся штаммы лишены морфологического диморфизма, но отличаются типом половых феромонов. У базидиальных грибов в природе встречается много различных состояний локусов спаривания, обеспечивающих половую совместимость их носителей. Такой контроль совместимости назван диафоромиксисом. Различают одно-факторный, или биполярный диафоромиксис, при котором совместимые штаммы имеют различные состояния одного фактора, и двуфакторный, или тетраполярный диафоромиксис, при котором для протекания полового процесса необходима гетероаллель-ность по двум несцеплепным факторам (Дьяков, 1999).
Иногда, например, при недостаточно хорошей аэрации, вторичный мицелий может напоминать по морфологии первичный: он не содержит пряжек и терминальные клетки гиф такого мицелия многоядерны. Однако, при восстановлении нормальных ус ловий он становится типичным вторичным мицелием (например, Panellus serotinus (Pers. in Hoffman ex Fr.) KDhner, Phlebia radiata Fr. (Kuhner, 1977).
Некоторым видам (Typhula micans (Fr.) Berthicr, Sistonema niveocremea (Hohn et Litsch.) Donk (Kuhner,1977)) для перехода к половому размножению не нужно спаривания с другим совместимым мицелием (гомоталлизм). В этом случае спора сразу прорастает фертильным первичным мицелием, па котором и образуются плодовые тела.
Для ряда видов агариковых, например, для Coprinus bilanatus Kemp. (Ross, Margalith, 1987), Galera tenera (Schaeff. ex Fr.) Quel (KDhncr, 1977), и в том числе для A.bisporus (Raper ct al., 1972), характерен вторичный гомоталлизм или псевдогомотал-лизм. В его основе лежит образование не одно-, а двуядерных мейоспор, причем вследствие неслучайной ориентации веретена в одну спору попадают ядра, гетероаллельные по типам спаривания, т.е. сразу из спор образуется гетерокарион (Дьяков, 1999). Ряд фактов свидетельствует в пользу того, что в природе отбор на поддержание подобного типа гомоталлизма:
1. В процессе мейотических делений вследствие кроссинговера между локусом спаривания и центромерой возможна рекомбинация локусов спаривания и восстановление гетероталлизма. У грибов описаны механизмы снижения рекомбинации (Захаров, 1968,1986; Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989).
2. У A. bisporus вследствие нарушений в ориентации веретена образуются аббе-рантные 3-4 споровые базидии с одноядерными гомокариотическими спорами. Показано, однако, что такие споры формируют медленнорастущие колонии на агаровых средах, не способны оккупировать естественные субстраты, имеют пониженную жизнеспособность и не могут сколько-нибудь долго существовать в природе (Камзолкина и др., 1996).
Двуспоровые базидиомицеты амфиталличны, т.е. имеют смешанную систему размножения, у них наряду с двуядерными псевдогомоталличными спорами образуются одноядерные гетероталличные. В первом случае спора при прорастании сразу формирует вторичный гетерокариотический мицелий с плодовыми телами, во втором - спора прорастает первичным мицелием, а для формирования вторичного мицелия необходимо слияние двух первичных мицелиев, гетероаллельных по локусу спаривания (Дьяков, 1999).
Для ряда грибов описана еще одна разновидность гомоталлизма - кассетный механизм переключения типов спаривания. Подобный процесс описан у аскомицетов Sac-charomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen (Hobcr, 1992), Schizosaccharomyces pombe Lindner (Egel, 1984) и базидиомицетов Agrocybe aegerita (V.Brig) Singer (Labarere, Noel, 1992) и A. campestris (Martinez-Carrera et al., 1995). При наличии в двух кассетах последовательностей ДНК, гомологичных по разным типам спаривания, возможен перенос генетической информации из кассеты в mat-локус, переключение типа спаривания у отдельных потомков одной мейоспоры и слияние их с другими потомками, у которых переключения не было, т.е. половой процесс внутри односпорового потомства (гомо-таллизм) (Дьяков, 1999).
Иногда первичный мицелий гетероталличных видов может образовывать плодовые тела (Kl5hner,1977). В базидиях таких плодовых тел не происходит кариогамии и мейоза, они могут напоминать по форме базидии нормальных плодовых тел (Psathyrella coprobia (Lange) Smith) или сильно отличаться от них (Laxitextum bicolor (Pers.) Lentz). Гаплоидное плодоношение наблюдалось в культуре гомокарионов Agaricus bisporus var. bisporus (Lange) Imbach (Dickhardt, 1985) и Agaricus bisporus var. burnettii Kerrigan et Callac (Callac et al., 2003).
Обычно базидии партеногенетических плодовых тел несут по две одноядерные споры и два ядра остаются в базидии (Kiihner, 1977).
В природе монокариотическое плодоношение встречается довольно редко, но, например, многие монокариотические штаммы вида Мусепа galericulata (Scop, ex Fr.) Gray потеряли способность к дикариотизации мицелия. Партеногенетические плодовые тела для таких штаммов являются единственным способом размножения. По-видимому, монокариотическое плодоношение является тупиком эволюции. (Kiihner, 1977).
Изучение жизненных циклов разных видов рода Agaricus показало, что для большинства из них характерен гетероталличный тип жизненного цикла (Raper, 1976; Raper et Кауе, 1978; Elliott, 1978; Anderson et al., 1984). Исключение составляет вид A. bisporus, для разных разновидностей которого характерен вторичный гомоталлизм (ам-фиталлизм), первичный гомоталлизм и гетероталлизм.
Поверхностное культивирование
Для выделения моноспоровых и многоспоровых культур использовали одно- и двухсуточные отпечатки штаммов Bs83, Bs84, Ас83.
Выделение культур проводили на КГА. Посев спор производили на подложку из среды (10 мл), затем суспензию спор добавляли в КГА (10 мл) и, перемешав, помещали ее на подложку. Споровую суспензию получали смывом спор со спорового отпечатка 1 мл стерильной воды. Затем производили высев споровой суспензии без разведения и с разведением в 100 и 200 раз. В споровую суспензию добавляли ампициллин (в концентрации 2,5 мкг/мл), фундазол (5 мкг/мл) и гентамицин (2,5 мкг/мл).
В связи с предположением о низкой жизнеспособности спор было решено провести стимуляцию прорастания. Для этого на крышку половины опытных чашек каждого штамма наносили каплю среды сусло-агар (СА) и инокулировали зерновым мицелием шампиньона.
Культивирование проводили при 24 ±1С (Fritsche, 1982) до появления видимых глазу колоний, которые помещали на пробирки со средой (СА). Затем культуры помещали в термостат при 24 ±1С. Количество спор в исходной суспензии подсчитывали с помощью камеры Горяева и проводили учет выживаемости спор. Отсевали как быстрорастущие колонии (появляющиеся на чашках через неделю), так и медленнорастущие (появляющиеся через 2-3 недели).
Для описания макроморфологии колонии пересевали на чашки Петри на СА в трех повторностях. Скорость роста измеряли каждые три дня в двух взаимно перпендикулярных направлениях (по диаметру колонии).
Проведение гибридизации. Для уточнения видовой принадлежности штаммов Bs83, Bs84, Ас83 было проведено скрещивание гомокариотических культур тестируемых штаммов с гомокариотическими культурами GDR-2-40, Рс17-3, U3 1/1, U3 1/3, Bs26/3 и между собой.
Гибридизацию проводили двумя способами: 1. На чашки Петри с КГА помещали два моноспоровых изолята на расстоянии 15 мм и инкубировали при 24±1С в течение 12-14 суток. Мицелий с измененным характером роста из зоны контакта (быстрорастущий сектор или валик) и мицелий родительских штаммов инокулировали в жидкое сусло. Мицелий использовали для измерения ферментной активности методом электрофореза. 2. В пробирки с зерном (Lemke, 1972) в верхней трети столбика помещали два моноспоровых мицелиальных изолята, располагая их вплотную друг к другу. Инкубировали при 24±1С в течение 20 - 22 суток, во время инкубации проводили наблюдение за характером и скоростью роста мицелия каждые 3-4 суток. В дальнейшем этот зерновой материал использовали для посева в компост.
Поверхностно растущий мицелий инокулировали в зерно (пшеницу), приготовленное по Лемке (Lemke, 1972) без добавления гипса и культивировали в колбах при 24±1С до полного обрастания зерна. После обрастания зерна, мицелий переносили в колбы со стерильным компостом, полученным в совхозе «Заречье». Через 10-15 суток после обрастания компоста вносили покровную смесь. Плодовые тела выращивали в производственной камере искусственного климата с контролируемыми параметрами влажности и температуры и собирали на стадии зрелого частного покрывала.
Приготовление препаратов для микроскопии. В чашки Петри на СА инокулировали блок с мицелием, рядом с ним помещали стерильные покровные стекла. Чашки инкубировали в термостате при температуре 24±1С в течение 7, 14 или 28 суток в зависимости от цели эксперимента.
Срезы гимениального слоя (поперек пластинок) делали вручную с помощью опасной бритвы (толщина срезов - 10-15 мкм), наблюдения проводили на давленых препаратах.
Подсчет среднего количества спор на одной базидии проводили после вскрытия частного покрывала по количеству стеригм на базидиях: несколько пластинок (из разных участков гимениального слоя) помещали на предметное стекло в каплю водопроводной воды, накрывали покровным стеклом и микроскопировали.
Определение размера спор проводили в смыве из спорового отпечатка на предметном стекле. Люминесцентная микроскопия: Наросший на стекло мицелий окрашивали прижизненно родамином 6Ж (1:10000) для выявления митохондрий (Butt et al., 1989; Askari, Vo-Dinh, 2004). Для окрашивания ядерной ДНК мицелий и срезы гимениалыюго слоя предварительно фиксировали в модифицированной жидкости Карнуа в течение 10 минут (Evans, 1959) с последующим окрашиванием реактивом DAPI, концентрацией 500 нг/мл в Na-фосфатном буфере рН=6,9 (Ota et al., 1998) в течение 10 минут. Далее мицелий без промывания помещали в 50% (по объему) раствор глицерина (Chiu, Moore, 1993) и микроскопировали.
Просмотр препаратов. Препараты просматривали на микроскопе Axioskop 40 FL при увеличениях объективов х40, хЮО. Для просмотра препаратов, окрашенных DAPI и родамином, использовали микроскоп Axioskop 40 FL (увеличение объектива хЮО, светофильтры фирмы «Zeiss» №02, 15). Фотографировали с помощью камеры AxioCam MRc.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Культуры инокулировали на СА и инкубировали в термостате при температуре 24±1С в течение 7 суток. Выросший мицелий на блоке с агаром фиксировали в парах осмия в течение 2х суток. После высушивания образцы напыляли смесью платина/палладий (ГВ-3 Ion Coater) и просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа "Hitachi" S-405A.
Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии образцы мицелия, полученного на поверхности диализных пленок на СА и выращенного в глубинной культуре, помещали в 2,5% раствор глутарового альдегида ("Merck") на 0,1М Na-фосфатном буфере (рН=7,2) на 2 часа (при комнатной температуре). После промывки в Na-фосфатном буфере (3 раза по 15 минут) проводили постфиксацию в 1% растворе Os04 1 час при комнатной температуре. Материал промывали в растворе буфера, обезвоживали и заливали в EPON ("Fcrak"). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800 с использованием стеклянных ножей, окрашивали водным раствором уранил-ацетата (30 минут) с последующим докрашиванием по Рейнольдсу (Reynolds, 1963) и исследовали с помощью микроскопа "Jeol" (JEM-100B) и «U12» (Hitachi).
Подтверждение ядерного статуса тестами на фертилыюсть
Для проверки видовой принадлежности исследуемых в работе штаммов нами было проведено сравнение электрофоретических спектров неспецифических эстераз данных штаммов с другими штаммами вида A. bisporus и видами A. silvaticus, А. Ыorquis, A. arvensis, A. campestris, Pleurotus ostreatus, P. pulmonarius (рис.22, 24). Опыт был поставлен в 6 повторностях. На электрофореграмме и построенном кластере можно наблюдать, что изоляты Bs83 и Bs84, которые были ранее определены как штаммы вида Л. bisporus, кластеризуются вместе с другими штаммами шампиньона двуспорово-го с высокой степенью достоверности. Штамм Ас83 с высокой степенью достоверности попадает в один кластер со штаммом АсА, относящемуся к виду A. campestris. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что не идентифицированный штамм Ас83 является представителем вида A. campestris. По нашему мнению, метод вертикального электрофореза с окрашиванием на неспецифические эстеразы может быть использован как дополнительный критерий для видовой идентификации представителей рода Agaricus.
В нашем исследовании мы провели сравнение электрофоретических спектров эстераз у разных видов рода Agaricus из разных экологических групп (гумусовые сапро-трофы, подстилочные сапротрофы, сапротрофы-«гербофилы»). (рис. 23, 25) Было получено три больших достоверных кластера (рис.25). Первый кластер составляют виды А. bisporus (секция Duploannulatae, гумусовый сапротроф), A. bitorquis (секция Duploannu-latae, гумусовый сапротроф), A. xanthodermus (секция Xanthodermatae, сапротроф-«гербофил»). Второй кластер -A. excellens (секция Arvenses, подстилочный сапротроф), A.silvaticus (систематическое положение достоверно не установлено, подстилочный сапротроф), A. macrocarpus (секция Arvenses, подстилочный сапротроф), A. abruptibulbus (секция Arvenses, подстилочный сапротроф). В третий кластер - A. campestris (секция Agaricus, сапротроф-«гербофил»), A. arvensis (секция Arvenses, сапротроф-«гербофил»). Систематическое положение штаммов дано по последним данным молекулярной систематики (Geml et al., 2004; Kerrigan et al., 2005). Мы предполагаем, что виды, принадлежащие к одной экологической группе, обладают сходной ферментативной активностью, так как в один кластер преимущественно объединяются виды - представители одной экологической группы. Исключение составляет штамм вида A. xanthodermus (Ах 1517), который принадлежит к экологической группе сапротрофов-«гербофилов», но кластеризуется в один кластер со штаммами видов A. bisporus и A. bitorquis (гумусовые сапротрофы). Причина этого явления, вероятно, в генетической близости секций Duploannulatae и Xanthodermatae, показанной рядом авторов на основании данных мо лекулярной систематики (Geml et al., 2004; Kerrigan et al., 2005). Нам не известно литературных данных, посвященных исследованию ферментативной активности неспецифических эстераз у разных видов рода Agaricus и сравнения их между собой. Украинскими учеными было исследовано 17 видов рода Agaricus па предмет наличия того или иного фермента (18 тестов). Было показано, что наличие и интенсивность реакций на ксилозиназу и р-глюкозидазу является видоспецифичным признаком и коррелирует с принадлежностью вида к той или иной экологической группе (Григанський, 1995). По нашему мнению, исследование ферментативных спектров неспецифической эстеразы методом электрофореза является удобным методом для разделения штаммов и видов внутри рода Agaricus, определения видовой принадлежности неизвестных штаммов, установления принадлежности вида к той или иной экологической группе и т.д. Тем не менее, важно отметить, что в дальнейшем необходимо исследовать большее число видов рода для того, чтобы с уверенностью говорить о том, что является первопричиной объединения штаммов в один кластер - генетическая близость или принадлежность к той или иной экологической группе.
Первая часть работы посвящена характеристике критериев отбора природных штаммов рода Agaricus. Известно, что для видов рода Agaricus характерна большая вариабельность морфологических признаков, которые значительно варьируют в зависимости от возраста исследуемого образца, условий роста, содержания воды и т.д. (Гари-бова, 2003; Challen et al., 2003; Callac et al., 2005). Ранее даже высказывалась гипотеза о невозможности создания рабочего ключа для определения видов рода (Singer, 1951: цит. по Гарибова, 2003). Поэтому при выделении штаммов видов рода Agaricus из природы нельзя руководствоваться исключительно макроморфологическими признаками плодовых тел. В последнее время систематика рода основывается преимущественно на исследовании ДНК различными методами, которые обеспечивают более четкое разделение рода на виды и идентификацию неизвестных штаммов (Calvo-Bado et al., 2000; Challen et al., 2003; Geml et al., 2004; Callac, Guinberteau, 2005; Kerrigan et al., 2005). Данные методы, однако, достаточно дорогие и не всегда доступны (Micales, Bonde, 1995). Помимо анализа ДНК, наиболее надежными методами установления видового статуса изолятов являются гибридизация и изозимный анализ (Дьяков, Долгова, 1995; Calvo-Bado et al., 2000; Дьяков, 1998; Micales, Bonde, 1995). Однако, и эти критерии, будучи применимы поодиночке, не всегда являются достаточно достоверными для установления видовой принадлежности штамма к тому или иному виду рода Agaricus. Так, например, для ряда представителей первично гомоталличной популяции A.bisporus var. eurotetrasporus Callac et Guinberteau характерна частичная интерстерильность по отношению к другим штаммам A.bisporus и полная несовместимость с представителями собственной вариации (Callac et al., 1998А). Несмотря на то, что изозимный анализ достаточно широко используется для таксономических целей, в том числе для идентификации неизвестных организмов (Micales, Bonde, 1995; May, Royse, 1982; Kerrigan, Ross, 1989 и др.), данный метод имеет ряд недостатков. Прежде всего, следует помнить, что наличие какой-либо ферментативной активности указывает только на экспрессию гена, кодирующего определенный фермент, а не на присутствие или отсутствие определенной его аллели в генотипе организма (Дьяков и др., 1996). На экспрессию генов влияет множество факторов, таких как, например, состояние окружающей среды, стадия жизненного цикла и т.д. Кроме того, метаболизм клеток в разных частях организма или даже различных областях клетки может сильно различаться, а значит, будут различаться и электрофоретические спектры ферментов (Можина и др., 1993; Paranjipe et al., 1979; Harris et al., 1976: цит. no Micales, Bonde, 1995). Поэтому необходима максимально возможная стандартизация условий выращивания материала. Для точной идентификации неизвестного организма необходимо найти мономорфный локус (не дающий изменчивости внутри вида (подвида)), для выявления которого необходимо исследовать большое количество изолятов широкой географической зоны с использованием большого числа различных ферментных систем, а, кроме того, точно определить пределы вариабельности внутри таксона (Micales, Bonde, 1995), что также не всегда бывает возможно. Поэтому для установления видовой принадлежности организма не достаточно использование одного критерия, а только комплекса культурально-морфологических, биохимических, цитологических и генетических критериев.
Макроморфология колоний штаммов рода Agaricus при росте на сусло-агаре
В литературе имеются противоречивые данные относительно влияния на рост грибов добавления в среду мелкодисперсных компонентов. В ряде работ показано, что добавление в жидкую среду нерастворимых компонентов способствует формированию новых колоний и дисперсного мицелия (Биосинтетическая деятельность..., 1969; Pat. 2850841, USA: цит. по Бухало, 1988). Тем не менее, в некоторых исследованиях показано, что добавление нерастворимых компонентов (в том числе, агар-агара) не приводит к увеличению биомассы мицелия и не способствует формированию новых колоний (van Suijdam et al., 1980; Martin et Bailey, 1985; Бухало, 1988).
Для большинства исследованных нами штаммов увеличение концентрации агара в среде способствовало появлению округлых рыхлых колоний и появлению диффузпо растущего мицелия. У ряда штаммов (Bs94, Bs26, Bs423 (A. bisporus), Bit {A. bilorquis)) глубинная культура в колбах с концентрацией агара 75 мкг/100 мл и 150 мкг/ 100 мл представлена преимущественно очень рыхлыми колониями и диффузпо растущим мицелием, что является признаком хорошего роста штаммов в глубинной культуре (Solomons, 1975; Бухало, 1988; Znidarsic, Pavko, 2001; Lin, Yang, 2006). Все эти штаммы относятся к экологической группе гумусовых сапротрофов. Кроме того, для ряда штаммов (Bs94 {A. bisporus), Bs26 {A. bisporus), Ах 1517 {A. xanthodermus), Ае145 {А. excellens)) характерно изменение формы митохондрий в субапикальпой зоне гифы (зоне 2). Так, в колбах без агара и колбах с 15 мкг агара у вышеперечисленных штаммов в зоне 2 наблюдали преимущественно шаровидные митохондрии, в то время как в колбах с 75 и 150 мкг агара в зоне 2 присутствовали преимущественно митохондрии переходного типа и нитевидные митохондрии. Ту же тенденцию наблюдали у штаммов Aahet {A. arvensis), Аа284 {A. abruplibulbus), Am 150 {A. macrocarpus), в зоне 2 у которых присутствуют, помимо шаровидных митохондрий, единичные митохондрии переходного типа и нитевидные митохондрии. Для всех исследуемых штаммов отмечено уменьшение фрагментации мицелия в колбах с количеством агара 75 и 150 мкг. Из таблицы 19 видно, что прирост биомассы по мере увеличения количества агара в колбе находится в прямой зависимости от степени развития диффузпо растущего мицелия и рыхлых колоний, а также формы митохондрий в зоне 2. Так, наиболее значительный прирост биомассы наблюдали у видов A. bisporus, A. bitorquis. Аналогичный эффект наблюдали и для штаммов рода Pleurolus, для которых также характерен хороший рост в глубинной культуре. Полученный результат, по-видимому, связан с введением в среду субстрата, способствующего абсорбции мицелия. Вероятно, для видов данного рода это обстоятельство является необходимым условием для благоприятного глубинного роста. Однако, для большинства видов, относящихся к экологическим группам подстилочных сапротрофов и сапротрофов-«гербофилов», плохо растущих в глубинной культуре, наблюдается лишь незначительное улучшение роста при добавлении агара в среду. Необходимо также отметить слабый рост штаммов вида A.campeslhs в глубинной культуре при добавлении агара в среду.
Напротив, изменение объема среды в колбе (50, 100 и 150 мл) не приводило к существенным изменениям роста в глубинной культуре у большинства исследуемых штаммов. Только у штаммов видов A.bitorquis, P.ostreatus, P.putmotmritts наблюдали увеличение числа колоний на колбу и достаточно большой прирост биомассы по мере увеличения среды в колбе(ри: Й(2?У остальных штаммов рода Agaricus наблюдали незначительный прирост биомассы при росте колбах со 100 мл среды по сравнению с ростом в колбах с 50 и 150 мл среды. У большинства штаммов при росте в колбах с 150 мл среды повышалась степень фрагментации мицелия, у штаммов Bs94 (A.bisporus), Bs423 {A.bisporus), Aahct (A.arvensis), Am 150 (A.tnucrocarpus) в колбах с объемом среды 150 мл практически весь мицелий состоял из одноклеточных или двух-трехклеточных фрагментов. Также, в колбах со 150 мл среды возрастает степень орнаментации мицелия кристаллами, как мелкими, палочковидными (A.xamhodennus, A.macrocarpus), так и крупными, октаэдрическими (A.bitorquis). У штаммов видов A.bitorquis, P.oslreatus. P.pulntoncirius морфология митохондрий практически не меняется в зависимости от количества среды в колбах. Количество зернистых митохондрий в зоне 2 несколько возрастает в колбах со 150 мл среды, что, вероятно, связано с ухудшением аэрации. У остальных штаммов сохраняется 2-й тип хондриома при росте в колбах с разным количеством среды.
Ядра в клетках поверхностной культуры располагались в основном в центральной части гифы, редко в сильно вакуолизировапиых клетках они оказывались сдвинутыми к периферии клетки. Ядра в клетках мицелия большинства штаммов рода Agaricus лежали но отдельности, крайне редко - но два или были собраны в группы из 3-4 ядер (рис. 75). Особенно часто сгруппированные по два или более ядра наблюдали в клетках мицелия штаммов A.maaocarpus, A.exceUens и Aba (A.bisporus). По форме ядра были округлыми, веретеновидными (соотношение длина : ширина примерно 3-4 : 1) и даже червеобразными (длина : ширина от 5 : I и более). Размер ядер составлял 2,5-3,5 х 1-1,6 мкм. Этот признак незначительно отличался у разных видов рода Agaricus и практически не отличался у штаммов одного вида (табл. 20), Размер ядер у мицелия возрастом 7 суток и 28 суток практически не отличался между собой. Мелкий размер гаплоидных ядер, не превышающий 1-4 мкм в диаметре, характерен как для агариковых грибов (Степанова, Васильев, 1994), так и для аскомицетов (Камалетдинова, Васильев, 1982). Для штаммов вида/1, bisporus типичен размер ядер 1-3 мкм в диаметре (Степанова, Васильев, 1994; Волкова и др., 2003; Камзолкипа, 2005), что совпадает с нашими данными. Надежность измерений - более 98%
В глубинной культуре штаммов рода Agaricus ядра также располагались преимущественно в центральной части гифы и были локализованы по одному (рис. 76). Размер ядер в клетках глубинной культуры был значительно мельче по сравнению с поверхностной культурой и составлял в среднем 1-2 х 1-1,6 мкм. По форме большинство ядер были округлыми, редко овальными (соотношение длина : ширина = 2-3 : 1). Изменение формы и размеров ядер при росте в глубинной культуре было связано, вероятно, с уменьшением толщины гиф и с компактизацией ядерного материала вследствие старения мицелия, замедления процессов метаболизма. Изменение формы ядра отмечено в литературе для стареющих клеток плодовых тел (ядро становится неправильным или округлым) (Степанова, Васильев, 1994). Вероятно, в данном случае имеет место та же тенденция. Большинство фрагментов мицелия исследуемых штаммов, как в поверхностной культуре возрастом 28 суток, так и в глубинной культуре, содержали 1-2 ядра, как правило, мелкие и округлые, но по размеру не отличающиеся от ядер в клетках мицелия нормальных не фрагмеитировапных гиф (табл. 20). Надежность измерений - более 95%.
