Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Этиология и патогенез атопического дерматита. Влияние препаратов наружной терапии на микрофлору кожи при атопическом дерматите 12
1.1 Современные представления об этиологии и патогенезе атопического дерматита 12
1.2 Роль стафилококковой микрофлорыкожи в течении - атопического дерматита 15
1.3 Местные антимикробные факторы кожи в антистафилококковой защите при атопическом дерматите 19
1.4 Вирулентные свойства и факторы бактерий рода Staphylococcus и их значение в аллергическом воспалении кожи при атопическом дерматите 20
1.5 Воздействие препаратов, применяемых при местном лечении атопического дерматита на бактериальную микрофлору кожи .28
Собственные исследования 32
Глава 2 Материалы и методы исследований 32
2.1 Общая характеристика обследованных групп больных 32
2.2 Методы исследования 33
2.2.1 Лабораторно-аллергологические методы исследования 34
2.2.2 Микробиологические методы исследования 35
2.2.3 Методы изучения свойств бактериальных штаммов in vitro 35
2.2.4 Применение пиритиона цинка в местной терапии больных атопическим дерматитом 40
2.2.5 Методы статистической обработки данных 41
Глава 3 Клинико-микробиологическая характеристика больных атопическим дерматитом. Вирулентные свойства стафилококковой микрофлоры кожи при атопическом дерматите. Клиническая эффективность и антистафилококковая активность пиритиона цинка при местной терапии атопического дерматита
3.1 Клинические и прогностически неблагоприятные факторы заболевания, выявленные у пациентов с атопическим дерматитом 42
3.2 Стафилококковая колонизация кожи при атопическом дерматите 49
3.3 Клинико-бактериологическая характеристика пациентов с осложнённым течением атопического дерматита 54
3.4 Вирулентные свойства бактерий рода Staphylococcus, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом 58
3.4.1 Адгезивные свойства бактерий рода Staphylococcus и их оценка 61
3.4.2 Протеиназная активность бактерий рода Staphylococcus 64
3.4.3 Нуклеазная активность бактерий рода Staphylococcus 69
3.4.4 Активность каталазы и супероксиддисмутазы бактерий рода Staphylococcus 73
3.4.5 Антибиотикорезистентность Staphylococcus aureus и частота встречаемости среди них метициллинрезистентных и метициллинчувствительных изолятов у больных атопическим дерматитом 78
3.5 Оценка эффективности 1-окси-2(1Н)-пиридитиона цинка (пиритиона цинка) при местной терапии атопического дерматита и его антибактериальная активность в отношении Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу 82
Заключение 91
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
- Роль стафилококковой микрофлорыкожи в течении - атопического дерматита
- Воздействие препаратов, применяемых при местном лечении атопического дерматита на бактериальную микрофлору кожи
- Методы изучения свойств бактериальных штаммов in vitro
- Клинические и прогностически неблагоприятные факторы заболевания, выявленные у пациентов с атопическим дерматитом
Введение к работе
Актуальность проблемы
В мире ежегодно, согласно данным ВОЗ, заболевают аллергическими і болезнями более млн человек, доминирующим среди которых, прежде всего в детском возрасте, является (АтД) [Лютина Е.И. и др., 2004; Lmstov M.L. et al., 2002]. Заболеваемость АтД является высокой и в экономически развитых странах мира составляет в среднем 15—20 человек на 1000 населения [Ильина Н.И., 2005; РевякинаВ.А. и др., 2008]. Влияние неблагоприятной экологической ситуации, ухудшение здоровья населения, агрессивное распространение бактериальной, вирусной и микотической флоры, резистентной к фармакологическому воздействию [Дерябин Д.Г., 2000; Елисютина О.Г. и др., 2004], существенно меняют течение болезни, приводя к развитию более тяжелых форм,, характеризующихся непрерывно рецидивирующим течением и выраженными микробно-воспалительными проявлениями [Смирнова Г.И., 2004].
В настоящее время серьезной» проблемой клинической аллергологии является частое наслоение вторичной бактериальной, грибковой и вирусной инфекции кожи у 25-34 % больных атопическим дерматитом [Воронина В.Р. и др., 2003; Маланичева Т.Г. и др., 2007; Leung D.Y.M. et al., 1998].
Среди микробных агентов, инфицирующих кожу пациентов, страдающих атопическим дерматитом, значительная роль принадлежит Staphylococcus aureus. По данным авторитетных исследований, в 80 - 100 % случаев кожные покровы больных АтД колонизируются Staphylococcus aureus [Кудрявцева А.В. и др.,2003; Максимова А.Е., 1997; Goodyear Н.М. et al., 2002], а у детей с этой патологией во всех возрастных группах он выделяется не только с участков кожных поражений, но и с непораженной кожи, причем нередко при отсутствии видимых клинических признаков инфекционного процесса [Matsui К. et al., 2000].
Однако до настоящего времени особенности стафилококковой» микрофлоры, колонизирующею кожу пациентов при атоническом дерматите; и при этом потенциально являющейся этиологическим фактором, развития: местных инфекционных осложнений раскрыты недостаточно.
Исследование вирулентных свойств: стафилококков" кожи позволит раскрыть тонкие механизмы взаимодействия макроорганизма и микрофлоры при атопическом дерматите и будет способствовать развитию новых подходов к лечению пациентов с атопическим дерматитом, ассоциированным с массивной колонизацией кожи стафилококковой микрофлорой.
Цель исследования
Определить вирулентные свойства и= ферментативные особенности стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом; оценить антибактериальную активность 1-окси-2(Ш)-пиридитиона цинка (пиритиона цинка) по отношению к Staphylococcus aureus при его применении в местной терапии больных атопическим дерматитом. Задачи исследования
1 Определить видовой и количественный состав стафилококковой микрофлоры кожи при осложнённом и неосложнённом течении атопического дерматита в различных возрастных группах.
2 Изучить вирулентные свойства (адгезивный потенциал, гидролитических энзимов и ферментов антиоксидантной системы защиты) штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, колонизирующих кожу пациентов с атопическим дерматитом в зависимости от тяжести заболевания.
3 Оценить клиническую эффективность местной терапии с применением Д-окси-2(Ш)-пиридитиона цинка (пиритиона цинка) и егсь антибактериальные свойства в отношении штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих поражённую кожу у больных атопическим дерматитом.
Научная новизна
Получены новые данные о различной степени выраженности адгезивного потенциала у штаммов стафилококков (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), колонизирующих кожу больных в зависимости от степени тяжести атопического дерматита.
Впервые дана количественная характеристика активности протеиназ штаммов стафилококков, высеянных с пораженной кожи больных атопическим дерматитом; для Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis определён тип секретируемых протеиназ, обусловливающих эту активность.
Установлена зависимость активности каталазы и супероксиддисмутазы штаммов стафилококков, высеянных с кожи больных, от клинической формы, степени тяжести и периода течения атопического дерматита. Выявлена высокая термонуклеазная активность. Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных при тяжелом течении атопического дерматита.
Показана высокая эффективность местной терапии с применением пиритиона цинка, обусловленная антибактериальным действием препарата, способствующим элиминации с кожи больных Staphylococcus aureus и снижением их вирулентных свойств.
Практическая значимость работы
Полученные данные о высокой частоте выделения с кожи больных с тяжелой степенью атопического дерматита метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus указывают ,на необходимость проведения антибактериальной терапии с учетом результатов определенияі метициллинрезистентности стафилококков.
Результаты исследования клинической» эффективности и антибактериальной активности препаратов на основе пиритиона цинка позволяют рекомендовать использование его при местной терапии атопического дерматита у больных атопическим дерматитом, ассоциированным с колонизацией кожи Staphylococcus aureus.
Выраженная активность гидролитических, антиоксидантных ферментов и адгезивность штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом, характеризуют их высокую патогенность, что диктует необходимость учета роли бактериального фактора при проведении этиопатогенетической терапии
По результатам диссертационной работы получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ определения IgG-протеиназной активности» (заявка № 2008113407/13 от 28.03.2008 г.).
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы исследования, отражающие клинико-бактериологические характеристики больных с различной степенью тяжести атопического дерматита, для прогнозирования течения и оптимизации терапии используются в работе аллергологического отделения МУЗ. «Детская городская клиническая больница № 7» г. Казани и специализированной поликлиники Федерального государственного учреждения науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора.
Основные положения работы используются в учебном процессе на кафедре аллергологии и клинической иммунологии и кафедре микробиологии Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию при чтении лекций и проведении. практических занятий.
Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ определения Ig G-протеиназной активности» по заявке № 2008113407/13 от 28.03.2008 г.
Основные положения, выносимые на защиту
1 Кожа пациентов первых двух лет жизни с экссудативной и пруригоподобной формами атопического дерматита с тяжелым течением колонизирована Staphylococcus aureus в высокой степени плотности.
2 Штаммы Staphylococcus aureus, колонизирующие пораженную кожу больных с атопическим дерматитом в периоде обострения, обладают выраженной адгезивной способностью, высоким уровнем активности Ig-протеиназ, нуклеаз, каталазы, супероксиддисмутазы.
3 Применение пиритиона цинка приводит к снижению плотности контаминации пораженной кожи Staphylococcus aureus; снижению их вирулентных свойств.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены на научных форумах: 15-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых, ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007); 17-м Национальном конгрессе по болезням органов- дыхания (Казань, 2007); 10-м Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).
Основные положения диссертации обсуждены на расширенном заседании кафедры аллергологии и клинической, иммунологии, кафедры микробиологии Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, специализированной консультативно-диагностической поликлиники инфекционногаллергических. заболеваний при Федеральном государственном учреждении науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 1 от 01.06.2009 года).
Диссертация апробирована на заседании , Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (протокол № 7 от 25.06.2009 года).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 13 рисунков и 40 таблиц. Она состоит из введения (одна глава), собственных исследований (две главы), заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 194 источника (77 отечественных и 117 зарубежных).
Роль стафилококковой микрофлорыкожи в течении - атопического дерматита
Нормальнаякожа колонизирована как резидентной, так и транзиторной микрофлорой. Резидентная, микрофлора является постоянной, колонизация такой микрофлорой является препятствием для размножения патогенной и условно-патогенной [Новиков А.И и др., 2001 ; Новоселов B.C. и др., 2004; ]..
Микробиоценоз кожи, как открытой экологической ниши, характеризуется относительной стабильностью и максимально адаптирован к условиям, среды обитания [Воронина,В.Р. и др., 2007; Клемпарская Н.Н., 1989], Колонизация кожи аэробной микрофлорой у здоровых лиц достигает 102 клеток на 1 см2 на сухих участках и- 10 клеток на Л см2 на влажных участках. Анаэробная микрофлора, в. том числе и некоторые виды стафилококков, контаминирует преимущественно области, богатые сальными железами; плотность бактериальной колонизации составляет 10-10 КОЕ/смг. Данные микробы выявляются в протоках сальных желез и в волосяных фолликулах, тогдакак в-протоках потовых желез, как правило, бактерии не обнаруживаются [Noble W.C., 1998; Roll A. et al., 2004]!
Высокая степень адаптированности к температурным, трофическим условиям, наличие специфических лиганд-рецепторных взаимодействий между поверхностью бактериальной и эукариотической клеток, обеспечивающих эффективную адгезию микроорганизмов, на определенных участках кожи, очевидно, связаны с природой- резидентности [Шендеров Б.А., 1998].
Другим важным условием обеспечения устойчивости стафилококков является их резистентность к действующим санирующим механизмам, эффективно ограничивающим колонизацию «нетипичными» штаммами [Бухарин О.В., 2006].
При нарушении гомеостаза, в частности при хроническом атопическом воспалении в коже, микробиоценоз кожи у пациентов существенно меняется - наряду со стафилококками встречаются и другие виды, бактерий и микроскопических грибов. Но тем не менее, доминирующим видом в микробиоценозе кожи у этих пациентов является золотистый стафилококк [Солнцева В.К. и др.,2000; Текучева Л.В. и др., 2006; Gong J.Q. et al., 2006].
Контаминация кожи золотистым стафилококком у пациентов с атопическим дерматитом - типичное явление, встречающееся в 80-100 % случаев, тогда как постоянное носительство золотистого стафилококка на коже здоровых лиц встречается в 10—30 % случаев [Мокроносова М.А. и др., 2004]. В других подобных исследованиях было показано, что золотистый стафилококк у пациентов с АтД колонизирует пораженную кожу в 83 % случаев, а непораженные участки - в 76 % случаев, при этом данный вид стафилококка высевается и со слизистых верхних дыхательных путей также часто [Елисютина О.Г. и др., 2006; Шарифуллина А.А., 2007]. Исходя из анализа зарубежных и отечественных работ в этом направлении, можно констатировать, что при развитии экземы и хронического воспаления кожи аллергического генеза вероятность колонизации её патогенными видами бактерий увеличивается в несколько раз. Коагулазоотрицательные стафилококки (КОС)- у этих пациентов с поврежденной воспалительным процессом кожи выделяются в 63 % случаев [HuebnerJetal., 1999]. Важную роль в развитии патологического процесса в коже играет степень её бактериальной колонизации. Выявлены значительные различия в плотности колонизации кожи Staphylococcus aureus у здоровых лиц и пациентов с атопическим дерматитом. Показано, что вероятность развития инфекции прямо пропорциональна степени бактериальной колонизации и обратно пропорциональна активности местных защитных реакций [Breuer К et al., 2001]. Плотность бактериальной обсемененности кожи здоровых лиц на несколько порядков ниже, чем у пациентов с атопическим дерматитом [Арзуманян В.Г. и др., 2004]. В ряде исследований выявлена прямая корреляционная связь между тяжестью течения экзематозного процесса при атопическом дерматите и плотностью колонизации кожи Staphylococcus aureus» [Максимова А.Е., 1997; Szacos Е. et al., 2004]. Выявлены особенности микробной колонизации кожи здоровых лиц и больных атопическим дерматитом. Так показано, что если при транзиторном носительстве золотистого стафилококка, преимущественно встречающегося у здоровых лиц, наблюдается колонизация- поверхностных слоев кожи, то при атопическом дерматите этот микроб, как правило, обнаруживается в глубоких слоях дермы [Hirschmann J.V. et al., 1998]. Обсемененность кожи Staphylococcus aureus- у больных атопическим дерматитом неблагоприятно сказывается на характере течения этого заболевания, так как приводит к хроническому течению этого недуга с частыми обострениями, увеличивает риск развития таких осложнений как инфекции мягких тканей и кожи [Белоусова Т.А. и др., 2006; Белькова Ю.А. и др., 2005; Laube S. et al., 2002]. Столь драматичное изменение характера течения атопического дерматита у пациентов с массивной колонизацией кожи- Staphylococcus aureus, как правило, обусловлено: 1) доминированием в составе микробного биоценоза кожи золотистого стафилококка; 2) колонизацией в основном глубоких слоев дермы стафилококковой микрофлорой; 3) способностью стафилококков, колонизирующих кожу пациентов с АтД, образовывать целый ряд факторов, необходимых им для конкурентной борьбы за свою экологическую нишу в пределах кожного биотопа; 4) продукцией мощных экзотоксинов, ослабляющих местный специфический (антимикробный) иммунитет; 5) нарушением функции сальных и потовых желез при АтД, сдвигом рН кожи в сторону алкалоза; 6) нарушением обмена церамидов и снижением уровня сфингозина кожи ; 7) снижением уровня секреторного IgA на поверхности кожи [Arikawa J., 2002; Biber Т. et al., 2000; Dawn B.M. et al.,2005; Deurenberg R.N. et al., 2007; Francois P. et al., 2004; Mempel M. et al., 1998; Nichijima S. et al., 2002; Palmqwist N.et al.,2004; Proft T. et al.,2003; Rippke F. et al., 2004].
Воздействие препаратов, применяемых при местном лечении атопического дерматита на бактериальную микрофлору кожи
Нуклеазы — значимые факторы вирулентности стафилококка. Способность к расщеплению ДНК и РНК эукариотических клеток характерна для многих видов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [Медицинская..., 1999]. Золотистый стафилококк способен к продукции уникального для этого вида фермента термостабильной внеклеточной ДНК-азы, проявляющей активность в присутствии ионов кальция, [Kaplan N.M., 2003; Laqace-Wiens P.R. et al., 2007]. ДНК-азы, расщепляя связи в полинуклеотидной цепи ДНК клеток макроорганизма, вызывают деструкцию ядер и нуклеиновых кислот в эукариотических клетках, приводя к апоптозу и гибели клеток. Таким образом, их воздействие на макрофаги-в определённой степени нейтрализует защитные механизмы иммунной системы организма .
ДНК-азная активность стафилококков коррелирует с их способностью к токсинообразованию и в 100% случаев совпадает с плазмокоагулирующей активностью. Способностью к продукции ДНКазы обладали практически все изученные штаммы стафилококков, выделенные от пациентов со стафилококковой инфекцией. В норме содержание нуклеазопозитивных микроорганизмов в биотопах здорового человека не превышал 2-5% от общего содержания микробов в пробе, тогда как при дисбиозах этот показатель достигал 25-90%. Поэтому нуклеазную активность микроорганизмов, выделенных из различных биоматериалов (фекалии,слизистые ротовой полости, кожные покровы) было предложено использовать в качестве простого теста для определения состояния аутомикрофлоры человека. ДНК-аза - распространённый фактор патогенности Staphylococcus aureus, который участвует в регуляции клеточного биосинтеза и, что особенно важно, известен как маркер персистенции, способствующий адаптации микроорганизма к изменяющимся условиям окружающей среды [Meyrand A. et al., 1999]. Ферменты стафилококков; обеспечивающие антиоксидантную защиту бактериальной клетки
По современным представлениям, наибольшей токсичностью для клетки обладают активные формы кислорода и гидроксидные радикалы. [Бухарин 0.В. и др., 2008]. Определённый! вклад в общий отрицательный «кислородный» эффект вносят и производные кислорода. Для нейтрализации. токсических форм- кислорода существующие бактерии выработали-различные защитные механизмы нескольких типов [Horsburch M.J., et al., 2001]. В- основе системы защиты первого типа лежит деятельность специальных ферментов; для которых разложение токсических форм-кислорода является основной и в ряде случаев» единственной функцией. Для защиты» бактериальной- клетки от токсического действия 02 предназначены ферменты: супероксиддисмутаза (СОД), захватывающая молекулы 02-(реакция 1); каталаза и пероксидаза; улавливающие Н22 [Horsburch- M.J., et al., 2002]. Они сводят до минимума-концентрацию в клетке 02-и Н202 и не дают им возможности взаимодействовать, с образованием гидроксидного радикала.
Супероксиддисмутаза - распространённый энзим, продуцируемый микроорганизмами, обнаружен у всех прокариот, использующих кислород -аэробов, факультативных анаэробов и у подавляющего большинства аэротолерантных форм анаэробов [Clements М.О. et al., 1999]. Обнаружение СОД у строгих анаэробов ставит вопрос о её физиологической роли у этих микроорганизмов. Возможно, что только при попадании строгого анаэроба в неблагоприятные для него аэробные условия синтез этого фермента индуцируется молекулярным кислородом, что и обеспечивает микроорганизму защиту от кислорода в этих условиях.
Каталаза и пероксидаза. Перекись водорода разрушается двумя классами родственных энзимов, катализирующих её восстановление до Н20 и использующих в качестве донора электронов Н202 в случае каталазы или различные органические соединения - в случае пероксидазы [Kanafani H.et al., 1985]. Способность к продукции каталазы и пероксидазы выявлена у всех аэробных и факультативно анаэробных бактерий. У облигатных анаэробов эти ферменты распространены значительно в меньшей степени, чем супероксиддисмутаза.
Таким образом, в условиях активного взаимодействия клеток с молекулярным кислородом, система ферментативной защиты от его токсического действия образована с участием супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы в качестве необходимых компонентов [Clements М.О. et al., 1999]. Ферменты антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза и др.) принимают участие в одном из основных механизмов защиты бактериальных клеток от окислительного прессинга, нарушая кислородзависимые механизмы фагоцитоза в организме хозяина, и, следовательно, играют важную роль в процессах взаимодействия микро- и макроорганизма в ходе инфекционного процесса, вызванного условно-патогенными бактериями, в том числе и стафилококками [ Zanichelli D. et al., 2005]..
Методы изучения свойств бактериальных штаммов in vitro
Оценку антибиотикочувствительности и метициллинрезистентности выделенных штаммов стафилококка осуществляли согласно Методическим указаниям МУК 4.2.1890-04 [Определение..., 2004]; рекомендациям и критериям по лабораторным исследованиям (NCCLS) [National..., 2004]. Определение чувствительности штаммов бактерий рода Staphylococcus к антибактериальным препаратам проводилось диско-диффузионным методом. При интерпретации результатов антибиотикочувствительности штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, рассматривались как устойчивые ко всем бета-лактамным антибиотикам [National..., 2004]. При определении чувствительности микробов к антибактериальным препаратам проводились необходимые процедуры внутрилабораторного контроля качества с использованием референтных штаммов.
Идентификация метициллинрезистентности стафилококка Скрининг на агаре для выявления метициллинрезистентности Staphylococcus aureus является высокочувствительным методом. Для детекции метициллинрезистентных штаммов использованы диски с оксациллином в концентрации 1 мкг. Подозрительные колонии стафилококка засевали на MRSA-SELECT-агар (BIORAD). Для контроля роста параллельно использовали среду без оксациллина. Параллельно с исследуемыми тестировали также контрольные штаммы метициллинчувствительных и метициллинрезистентных стафилококков. Контроль качества выполняли с эталонным штаммом Staphylococcus aureus АТСС № 25923. Определение протеиназной активности штаммов бактерий рода Staphylococcus Для скрининга клинических штаммов на способность продуцировать протеиназы осуществляли культивирование их в аэробных условиях в течение 12 часов при температуре 37 С в питательной среде № 199 с глюкозой. Клетки отделяли от питательной среды центрифугированием при температуре 4 С в течение 15 минут при 10000 g. , Активность выделенных стафилококками протеолитических ферментов определяли в питательной среде методом фибрин-агаровых пластин по Astrap Т. (1952 г.). В качестве субстрата использовали коммерческий препарат фибриногена, содержащий плазминоген. Фибриноген растворяли в растворе 0,05 М трис-HCl буфера, рН 7,85, затем вносили в растопленный агар (Bacto-Agar, FERAK, USA), температура 49 С. В смесь агара с фибриногеном вводили раствор тромбина в рабочей концентрации и наносили на чашки Петри. Для приготовления рабочей концентрации тромбина использовали-маточный раствор тромбина в концентрации 1 мг/мл на физиологическом 0,9 % растворе натрия хлорида. Из этого раствора готовили 10 двукратных разведений. Для определения рабочей концентрации тромбина в 0,1 мл раствора фибриногена (в концентрации 300 мкг/мл) вводили 0,1 мл разведений тромбина. Фиксировали время свертывания при температуре 37 С. Для реакции использовали концентрацию тромбина, которая свертывает раствор фибриногена в течение 5-6 минут. В застывшем субстрат-агаровом слое продавливали лунки диаметром 4-5 мм. Исследуемые на фибринолитическую активность пробы МПБ вносили в лунки и инкубировали при температуре 37 С в течение 3-4 часов. После инкубации проб гель контрастировали 25 % раствором трихлоруксусной кислоты, учитывали зоны протеолиза. Определение иммуноглобулинрасщепляющей активности штаммов Ig-протеиназную активность определяли in vitro иммуноферментным методом [Тюрин Ю.А., 2003] в лаборатории иммунологии и разработки аллергенов (зав. лаб. — старший научный сотрудник, к.м.н. Тюрин Ю.А). В качестве субстрата использован иммуноглобулин человека в 0,05 М трис-НО буфере, рН 7,8. Активность IgG-протеиназ выражали в единицах удельной активности фермента (мкмоль субстрата, расщеплённого за 1 минуту на 1 мг белка в питательной среде культивирования при оптимальных условиях). Концентрацию белка в питательной среде определяли по методу М. Bradford (1976). Определение адгезивных свойствштаммов бактерий рода Staphylococcus Адгезивные свойства стафилококков изучали по методу В.И. Брилис и др. (1986). Использовали систему, в которой применяли отмытые в 0,15 Mj, натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, эритроциты человека, которые инкубировали с взвесью, содержащей 109 клеток стафилококка в 1 мл, в течение 1 часа при температуре 37 С и непрерывном встряхивании, после этого эритроциты отмывали от неадгезированных клеток забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02 М ЭДТА натрия. Из полученной смеси готовили мазки общепринятым способом, подсушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом и окрашивали по методу Романовского - Гимзы. Изучение окрашенных мазков, и подсчет клеток проводили в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КНЦ.РАН с использованием цифровой камеры Axio Cam MRc5 (Carl Zeiss), адаптированной к световому микроскопу «Jenamed» (Carl Zeiss), с программным пакетом для захвата и обработки полученных изображений — Axio Vision Realease 4.6 (Carl Zeiss) (научный сотрудник - к. б. н. Акулов А. Н.). Оценивали индекс адгезии стафилококка (ИАС) по критериям, изложенным в работе В.И. Брилис и соавт., (1986). Методику предварительно апробировали с тест-штаммом из коллекции лаборатории микробиологии (ФГУН «Казанский НИИЭМ») Staphylococcus aureus АТСС № 25923.
Клинические и прогностически неблагоприятные факторы заболевания, выявленные у пациентов с атопическим дерматитом
Таким образом, в нашем исследовании было выявлен ряд неблагоприятных прогностических, факторов в развитии атопического дерматита. У большинства пациентов (91,3 %), страдающих АтД, было характерно раннее начало заболевания. Почти у половины пациентов - у 50 (43,8 %) - было отмечено сочетание нескольких форм аллергических заболеваний, доминирующей клинической- формой была атопическая, бронхиальной астма(АБА).
Ещё одной характерной особенностью пациентов с АтД была высокая степень наследственной» отягощённости по аллергическим заболеваниям, которая выявлена нами в 30,7 % случаев, при этом возраст пациентов в этой группе составил от 6 месяцев до 5 лет. В этой группе в период клинического обострения тяжесть заболевания была высокой и статистически значимо превышала по числу обострений в течение года этот показатель в сравнении с группой лиц со средней и низкой наследственной отягощённостью.
У всех пациентов с АтД выявлена сенсибилизация к небактериальным аллергенам: бытовым, пыльцевым, пищевым, эпидермальным, реже выявлялась сенсибилизация к аллергенам микроскопических грибов. Уровень общего сывороточного IgE был наибольшим и достигал (392+18,3) МЕ/мл (что в 6 раз выше возрастной нормы) у 38 (33,3 %) пациентов в возрасте до двух лет с экссудативной и пруригоподобной формами заболевания. Уровень эозинофилии был наибольшим в этой же возрастной группе (в возрасте до двух лет), где АтД протекал тяжело, характеризовался развитием экссудативной формы заболевания. Наименьшие уровни эозинофилии выявлены нами в старшей возрастной группе с эритематосквамозной формой АтД с выраженной лихенизацией кожи. Уровень эозинофилии статистически значимо коррелировал с уровнем общего IgE у этих пациентов (т=0,39; р 0,05).
Дополнительным фактором, характеризующим неблагоприятное течение атопического дерматита, является сопутствующая патология желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, которая, по данным нашего исследования; диагностирована в 59,6 % случаев.
Нами было установлено, что у пациентов с атопическим дерматитом, частота колонизации кожи различными бактериальными видами статистически значимо отличается от частоты колонизации у группы практически здоровых лиц. Поражённая кожа больных АтД в 2,2 раза чаще, чем у практически здоровых лиц, колонизируется микроорганизмами. Доминирующим видом из всех бактериальных колонизатов, выделяемых от пациентов с АтД как с поражённой кожи, так и с непоражённых участков, являлся Staphylococcus aureus. Так, по нашим данным, у больных с АтД он выделялся с поражённой кожи в 59,5 %, случаев (у практически здоровых лиц только в 8,0 % случаев), а с непоражённой кожи - в 27,7 % случаев. Таким образом, Staphylococcus aureus выделялся с поражённой кожи у больных лиц в 7,4 раза чаще по сравнению с выделением с кожи практически здоровых лиц. Другие виды стафилококков, в частности коагулазоотрицательный вид - Staphylococcus epidermidis, выделялся у больных лиц реже.
Наиболее часто Staphylococcus aureus встречается на коже пациентов в первые 2 года жизни при экссудативной и пруригоподобных формах заболевания, при этом у этих детей была отмечена максимальная степень тяжести заболевания. В 30 % случаев Staphylococcus aureus выделялся у пациентов старше 2 лет в возрастной группе св. 2—14 лет (дети, подростки) при эритематосквамозной форме заболевания. В 13 % случаев Staphylococcus aureus выделялся в старшей возрастной группе пациентов с эритематосквамозной формой АтД с выраженной лихенизацией.
Исследовав плотность колонизации кожи Staphylococcus aureus у больных атопическим дерматитом, мы установили, что у детей в возрасте от 6 месяцев до 2 лет плотность колонизации колебалась от lg (5,3±0,3) до-lg (5,5±0,9 КОЕ/см2 по сравнению с lg (3,3+0,4) КОЕ/см2 в группе практически здоровых лиц (р 0,05). ПрИіЗкссудативной форме АтД в этой возрастной группе больных плотность колонизации была наибольшей — lg (5,5 ±0,9) КОЕ/см2.
В 26,3 % случаев нами было диагностировано осложнённое течение АтД в виде развития симптомов местной инфекции кожи. При этом аллергологическое обследование показало у этих пациентов высокий.уровень общего IgE в сыворотке крови.
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/i/4593/204210.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс] Брагина Ирина Николаевна")
