![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/b/3273/204210.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/d/3892/204210/450/1.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/d/3892/204210/450/2.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/d/3892/204210/450/3.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/d/3892/204210/450/4.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
![Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]](/i/d/3892/204210/450/5.png "Биологические свойства симбионтной микрофлоры кожи при первичной роже [Электронный ресурс]")
Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Микробиоценозы кожи в норме и при роже нижних конечностей 9
ГЛАВА 2. Роль факторов колонизации и персистенции в форми ровании микробных биоценозов организма 19
Часть вторая собственные исследования
ГЛАВА 3. Материал и методы исследования 29
3.1. Характеристика объектов исследования 29
3.2. Микробиологическое исследование аэробной и анаэробной микрофлоры кожи нижних конечностей 33
3.3. Определение адгезивной активности 34
3.4. Определение антилизоцимной активности 35
3.5. Определение антикарнозиновой активности 36
3.6. Статистическая обработка данных 37
ГЛАВА 4. Микробиоценозы кожи голеней условно-здоровых и больных первичной рожей 38
4.1. Микрофлора кожи голеней условно здоровых людей 38
4.2. Микрофлора кожи голеней при первичной роже до проведения антибактериальной терапии 46
4.3. Микробиоценозы кожи голеней при первичной роже после антибактериальной терапии 60
ГЛАВА 5. Биологические свойства основных симбионтов кожи голеней условно-здоровых и больных первичной рожей нижних конечностей до и после антибактериальной терапии 75
5.1. Адгезивная активность 75
5.2. Антилизоцимная активность 82
5.3. Антикарнозиновая активность 88
Обсуждение результатов 95
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Указатель литературы
- Микробиологическое исследование аэробной и анаэробной микрофлоры кожи нижних конечностей
- Определение антикарнозиновой активности
- Микробиоценозы кожи голеней при первичной роже после антибактериальной терапии
- Антилизоцимная активность
Микробиологическое исследование аэробной и анаэробной микрофлоры кожи нижних конечностей
Для микробиологического исследования перед назначением антибактериальной терапии забирали мазок стандартным ватным тампоном с пораженного участка кожи и с симметричного участка непораженной ко-нечности размером 1 см ; после курса антибактериальной терапии проводили исследования с тех же участков кожи. Кроме того, однократно проводили таким же способом забор материала с кожи голени у здоровых людей контрольной группы. Материал транспортировали в тиогликолевом буфере в лабораторию в течение 1 часа после его забора, что обеспечивало сохранение жизнеспособности большинства микроорганизмов.
Из исходного материала готовили 10-кратные разведения в тиогли-колевом буфере от 10" до 10" . Из разведений производили высевы пипеткой по 0,1 мл на соответствующие пластинчатые питательные среды (кровяной агар, желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро), скошенный мя-со-пептонный агар (по Шукевичу), сердечно-мозговой бульон и высокий столбик среды Блаурокка.
Посевы аэробных бактерий инкубировали в термостате 2-3 суток, а анаэробных - 3 - 5 суток при температуре 37С. Для создания анаэробиоза откачивали воздух из микроанаэростата МИ-752 и заполняли газовой смесью, содержащей 10% углекислого газа, 10% водорода и 80% азота. Контроль степени анаэробиоза осуществляли с помощью окислительно-восстановительного индикатора (0,02% раствор метиленового синего на трисбуфере с глюкозой), который обесцвечивался в строго анаэробных условиях. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили до вида по морфологическим, тинкториальным, культуральным, а также биохимическим свойствам (с помощью Lachema тест-систем), согласно определителю Берджи (1997).
Определение адгезивной активности (АА) выделенных штаммов бактерий проводили экспресс-методом (Брилис В.И. с соавт., 1986) с использованием формалинизированных эритроцитов человека О (I) Rh (+) группы крови.
Подсчет адгезированных микроорганизмов проводили с помощью световой микроскопии. Степень выраженности адгезии оценивали по среднему показателю адгезии (СПА) — среднему количеству микробных клеток, прикрепившихся к одному эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения.
Микроорганизмы считали неадгезивными при СПА от 0 до 1,0, низкоадгезивными - от 1,01 до 2,0, среднеадгезивными от 2,01 до 4,0, высокоадгезивными - при СПА 4,0.
Наличие и степень выраженности антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов определяли по методу О.В.Бухарина с соавт. (1984).
Для этого в питательной среде (чашки Петри с 5 мл 1,5% МПА) готовили ряд разведений лизоцима (ФАО «Феррейн», г. Москва) от 1 до 10 мкг/мл с интервалом 1 мкг. Контролем служила питательная среда без добавления лизоцима. На поверхность приготовленных сред наносили стандартной петлей капли испытуемых суточных бульонных культур (109 бактерий/мл). Посевы инкубировали при 37С в течение 24 часов. Выросшие культуры инактивировали парами хлороформа при комнатной температуре, наливая его на фильтровальную бумагу в крышку чашки Петри в течение 20 минут. Затем чашки помещали на 10 минут в термостат для удаления паров хлороформа. Далее на колонии наносили второй слой (3,0 мл) полужидкого (0,7%) МПА, содержащего 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой индикаторной культуры Micrococcus luteus var. lysodeikticus (штамм 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича) в изотоническом (0,85%) растворе NaCl.
Учет проводили после повторной 24-часовой инкубации при 37С. Если исследуемые штаммы проявляли АЛА, то вокруг колоний наблюдался рост микрококка. Количественную оценку АЛА проводили по максимальной концентрации лизоцима, которую инактивировал исследуемый штамм, и выражали в мкг/мл.
Определение антикарнозиновой активности
Из представителей факультативной микрофлоры (табл. 4.2.), наиболее часто выделяли КОС (факультативные виды) (64,7%), споровые микроорганизмы (57,6%о), коринеформные бактерии (факультативные виды) (47,1%) и золотистый стафилококк (41,2%). Полученные результаты, за исключением коринеформных бактерий существенно отличаются от данных Нобла У.К. (1986), Шендерова Б.А. (1987), Sommerville D.A., Lankaster-Smith М. (1973), Kloos W.E. (1986), Bredy Dominiques (1990), которые выделяли эти микроорганизмы у более молодых возрастных контингентов в 2,0 - 7,0%, 8,0 -10,0%, 18,6 - 24,0%, 0,5 - 16,0% случаев, соответственно.
Выявленная нами высокая частота присутствия выше перечисленных факультативных симбионтов на коже голеней здоровых людей в основном пожилого возраста возможно связана со снижением иммунного статуса и изменениями в кровоснабжении нижних конечностей, что является закономерным для этого периода жизни.
Выделенные штаммы КОС относились к 8 факультативным видам (табл. 4.3.), частота обнаружения которых варьировала от 5,9% (S. xylosus) до 23,5% (S. auricularis, S. caprae, S. capitis). Интенсивность колонизации бы-ла более высокой у видов S. simulans (lg 3,5 КОЕ/см ), менее выраженной -у S. cohnii, S. lugdunensis и S. xylosus (lg 2,0 КОЕ/см ).
Аэробные бациллы были представлены следующими видами (рис. 4.3.): В. brevis (17,6%), В. pumilis (17,6%), В. mesentericus (11,7%), В. macerans (5,8%), В. subtilis (5,8%). Следует отметить, что в 35,3% случаев эти микроорганизмы присутствовали на коже голеней здоровых людей в ассоциации со споросарцинами.
Наиболее широкий видовой спектр (10 видов) был выявлен среди кори-неформных бактерий, относящихся к факультативным симбионтам (табл. 4.4.).
Таблица 4.4. Частота и интенсивность колонизации кожи голеней С большей частотой с кожи голеней здоровых людей выделяли штаммы С. paurometabolum - в 22,3% случаев. Реже (4,7 - 11,8%) исследуемый биотоп колонизировали другие факультативные виды коринебактерий. Интенсивность колонизации для большинства описываемых микроорганизмов была практически одинаковой (lg 2,0-2,1 КОЕ/см2). Исключением являлись штаммы С. striatum и С. kutsheri, которые обнаруживали в коли-честве lg 2,5 и lg 3,0 КОЕ/см , соответственно.
Стрептококки были представлены анаэробными (Peptostreptococcus sp.) (11,9%о) и аэробными (A. viridans, S. salivarius) (по 5,8%) видами, при интен-сивности колонизации lg 2,5 КОЕ/см".
Неспорообразующие аэробные палочковидные бактерии (дермабактер, бревибактерии, роции, флавибактерии и цитробактер) (табл. 4.2., рис. 4.1.) колонизировали КГ у 4,7 — 5,9% обследуемых контрольной группы. Коли чество их было незначительным и варьировало в пределах lg 1,0 - 2,0 КОЕ/см2.
Из облигатно анаэробных факультативных симбионтов обнаружены только эубактерии в 4,7% случаев, в количестве lg 2,0 КОЕ/см .
Микроскопические грибы присутствовали на коже голеней у 17,6% условно-здоровых людей с интенсивностью колонизации lg 2,3 КОЕ/см2 и таксономически относились к дрожжеподобным грибам родов Candida и Geotrichum, а также плесневым грибам рода Aspergillus.
При анализе состава микробиоценозов КГ обследуемых контрольной группы было установлено (рис. 4.4.), что они чаще были представлены 4 -5-компонентными (41,2 и 23,5%, соответственно), реже 2- и 3- компонентными ассоциациями резидентных и факультативных симбионтов (11,7 и 17,6%, соответственно). Наименьший удельный вес (6,0%) имели 7-компонентные ассоциации.
У остальных 64 (75,3%) человек из 9 представителей факультативной микрофлоры на КГ присутствовали от одного до четырех штаммов различных родов (видов) микроорганизмов.
Таким образом, микробиоценозы кожи голеней условно здоровых людей контрольной группы характеризовались наличием многокомпонентных ассоциаций, с доминированием 4-х и 5-й компонентных. Наибольшая частота встречаемости и более высокая интенсивность колонизации кожных покровов для лиц в возрасте от 45 до 84 лет выявлены для представителей резидентной микрофлоры, а также некоторых условно-патогенных факультативных симбионтов (КОС, бациллы, коринеформные бактерии, золотистый стафилококк). Достаточно высокий удельный вес последних в микробиоценозах кожи голеней соответствующей возрастной группы может явиться одним из факторов, предрасполагающих к возникновению рожистого воспаления.
Для исследования микробной колонизации КГ при рожистом воспалении (РВ) до проведения антибактериальной терапии было проведено микробиологическое исследование материала пораженного и симметричного участка здоровой кожи (СУЗК) у 108 больных в возрасте от 41 года до 75 лет. В результате проведенных исследований из очага РВ выделены 1922 штамма, а с симметричного здорового участка 1390 штаммов различных видов (родов) микроорганизмов.
Данные по частоте встречаемости и интенсивности колонизации резидентными симбионтными микроорганизмами КГ у больных РВ на пораженном и симметричном здоровом участках приведены в табл. 4.5.
Микробиоценозы кожи голеней при первичной роже после антибактериальной терапии
После завершения этиотропной терапии и клинического выздоровления у всех пациентов была повторно изучена микрофлора кожи голеней как в очаге поражения, так и на СУЗК для выявления качественных и количественных изменений в составе микробиоценозов по сравнению с началом заболевания, а также группой условно здоровых людей.
Сводные данные по характеристике резидентной микрофлоры КГ у больных РВ после антибактериальной терапии приведены в табл. 4.10. и на рис. 4.12.
Как видно из табл. 4.10. и рис. 4.12., частота обнаружения резидентных видов КОС, микрококков и коринебактерий в очаге поражения и на СУЗК после лечения не имела достоверных отличий (р 0,05) от данных, полученных в начале заболевания.
Следовательно, после лечения сохранялись те же негативные изменения в составе резидентных симбионтов, как и до проведения этиотропной терапии. А именно, не происходило восстановления до нормы частоты встречаемости микрококков и коринеформных бактерий на фоне стабильного удельного веса резидентных видов КОС в микробиоценозах голеней. Вместе с тем, средние показатели интенсивности колонизации КГ пациентов резидентной микрофлорой после лечения практически не отличалась от данных в начале заболевания и в группе условно-здоровых людей.
Большинство выделенных из пораженного и здорового участков кожи после этиотропной терапии резидентных штаммов КОС (рис. 4.13.) относились к виду S. epidermidis (68,6 и 65,7%), что не имело достоверных отличий (р 0,05) от данных в начале заболевания (75,8 и 75,6%) и в контрольной группе (71,7%).
Вместе с тем, выявлено значительное снижение частоты обнаружения S. hominis в очаге поражения, как по сравнению с началом заболевания (в 2,8 раза, р 0,05), так и с группой контроля (в 1,8 раза, р 0,05). Кроме того, установлено существенное снижение (в 2,0 и 2,6 раз, р 0,05) удельного веса S. warneri в кожных микробиоценозах в очаге РВ после лечения по сравнению с началом заболевания и с контрольной группой. На СУЗК после этиотропной терапии штаммы этого вида не были обнаружены.
В отношении S. haemolyticus (рис. 4.13.) выявлена тенденция к снижению частоты встречаемости этого вида стафилококков после лечения как в очаге РВ, так и на СУЗК. Вместе с тем, удельный вес S. haemolyticus в кожных микробиоценозах КГ в этот период не имел достоверных отличий (р 0,05) от соответствующего показателя в контрольной группе.
Среди микрококков после проведения этиотропной терапии (рис. 4.14.) значительно повышалась частота обнаружения на коже голеней пациентов основного симбионта - М. luteus. Наиболее выраженными эти изменения были на СУЗК (в 2,2 раза, р 0,05) по сравнению с началом заболевания.
Однако, удельный вес М. luteus в микробиоценозах КГ обследуемых после лечения не достигал нормативных показателей (51,8 и 52,7% против 76,5% в контрольной группе).
Аналогично М. luteus, существенно повышалась частота встречаемости М. halobius на симметричном участке здоровой кожи на фоне отсутствия каких-либо изменений в очаге поражения.
Несколько иные закономерности установлены для штаммов М. kristinae: снижение частоты их обнаружения в очаге воспаления после лечения в 1,7 раза по сравнению с началом заболевания, тогда как на СУЗК этот показатель (38,8%) практически совпадал с данными до лечения (37,9%). Однако, в целом после антибиотикотерапии удельный вес М. kristinae в кожных микробиоценозах не имел достоверных отличий от аналогичного показателя в группе условно-здоровых людей.
Из резидентных видов коринеформных бактерий (рис. 4.15.) у обследованных больных после этиотропной терапии на пораженном и здоровом участках кожи голеней регистрировали наличие штаммов С. pseudodiphhericum. Вместе с тем, частота обнаружения этого основного резидентного симбионта в очаге РВ достоверно (р 0,05) снижалась в 1,7 раз по сравне нию с началом заболевания и 2,2 раза - с группой здоровых людей. На СУЗК штаммы С. pseudodiphthericum выделяли практически с такой же частотой (52,7%), как и до проведения этиотропной терапии (51,4%). Следовательно и на здоровом участке кожи голеней пациентов с РВ после лечения не происходило восстановления до нормы (70,6%) С. pseudodiphthericum.
Как и в начале заболевания, в очаге РВ отсутствовали штаммы С. pseudotuberculosis, которые колонизировали кожу голеней здоровых людей в 52,9% случаев. И только на СУЗК после лечения эти микроорганизмы были зарегистрированы у 10,1% обследованных в количестве 102КОЕ/см2.
Среди факультативных симбионтов у пациентов с РВ после лечения (табл. 4.11.) наблюдалась полная элиминация с кожи голеней представителей родов Dermabacter и Rothia, а с участка здоровой кожи - бревибакте-рий. Кроме того, установлено достоверное снижение (р 0,05) частоты обнаружения коагулазоотрицательных стафилококков на пораженном и здоровом участках кожи в 1,9 и 2,4 раза, по сравнению с началом заболевания. Вместе с тем, для других кожных факультативных симбионтов получены неоднозначные результаты при исследовании различных экониш.
Антилизоцимная активность
Представляет интерес тот факт, что при тяжелых формах после антибактериальной терапии примерно в равном количестве случаев имели место как полная элиминация, так и сохранение исследуемых факультативных симбионтов в монокультуре или в виде 2-х и 3-х компонентных ассоциаций (табл. 4.15.).
Таким образом, после проведения антибактериальной терапии не только не происходило нормализации микробиоценозов КГ у пациентов, перенесших первичную рожу, но и наблюдалось усугубление дисбиотиче-ских изменений в резидентной и (или) в факультативной группах микроорганизмов, наиболее выраженное при тяжелых формах заболевания.
Такие изменения микробиоценозов кожи у обследованных на фоне контаминации госпитальными штаммами свидетельствуют о дальнейшем снижении колонизационной резистентности исследуемого биотопа и возможности рецидивов инфекции.
В настоящее время симбионтную микрофлору кожи характеризуют по наличию конкретных видов (родов) микроорганизмов, а также интенсивности колонизации занимаемой ими экологической ниши.
Между тем, важно учитывать биологические свойства кожных симбионтов, способствующие их колонизации и защите от местных неспецифических факторов резистентности макроорганизма, как в норме, так и при различных инфекционных заболеваниях.
В доступной нам литературе мы нашли лишь единичные сообщения, касающиеся адгезивных свойств и факторов персистенции условно -патогенных симбионтных микроорганизмов кожи при флегмонах и абсцессах (Фадеев СБ., 1998; Куцевалова О.Ю., 2002), а также при псориазе (Акрут Абдуллатиф Мохаммед Салех, 2003). Вместе с тем, полностью не изучены эти биологические свойства микроорганизмов как у здоровых людей, так и при рожистом воспалении.
Проведенные нами исследования по определению адгезивных свойств у резидентных симбионтов кожи голеней условно-здоровых людей показали (табл. 5.1.), что большинство микрококков (77,6%) не обладали адгезивной активностью (АА). Значительно реже регистрировали штаммы с отсутствием этого признака среди резидентных видов КОС (35,8%) и кори-небактерий (21,4%).
Культуры со средней степенью адгезивности чаще встречались среди коринебактерий (32,8%), а с низким уровнем признака - среди КОС (38,6%).
Удельный вес штаммов резидентных видов бактерий с высокой степенью экспрессии адгезивной активности был незначительным: в 2,9% (КОС) и 11,4% (коринебактерии) случаев. Среди микрококков культуры с высоким уровнем АА не были зарегистрированы.
Учитывая невысокую адгезивную активность резидентных симбионтов КГ условно - здоровых людей, а также наличие значительного количества культур с отсутствием АА, представляло интерес изучение этого признака у аналогичных микроорганизмов при РВ в начале заболевания, до антибактериальной терапии.
Общие данные о степени выраженности АА у резидентных симбионтов КГ больных РВ представлены в табл. 5.2.
Как видно из табл. 5.2., в начале заболевания значительно снижалось в очаге поражения и на СУЗК количество неадгезивных культур КОС (в 17,0 и 8,7 раз, соответственно, р 0,01) и микрококков (в 2,1 и 2,3 раза, соответственно, р 0,05) по сравнению с группой условно-здоровых людей. На этом фоне в 2-х исследуемых биотопах существенно возрастал удельный вес штаммов КОС с высоким (в 6,2 и 2,9 раз, р 0,05) и средним уровнем адгезивных свойств (в 1,8 и 1,9 раз, соответственно).
Аналогичная закономерность в отношении частоты встречаемости штаммов с высокой и средней степенью адгезивности выявлена и для микрококков. Напротив, среди резидентных видов коринебактерии в очаге
РВ и на СУЗК наблюдали достоверное увеличение (р 0,05) штаммов с низкой и нулевой адгезивностью и полное отсутствие культур с высокой и средней АА против 11,4 и 32,9% штаммов коринебактерий с соответствующей активностью в группе контроля.
После проведения этиотропной терапии и клинического выздоровления обследуемых, происходили существенные изменения (табл. 5.3.) как в частоте встречаемости, так и степени выраженности АА у представителей кожной резидентной микрофлоры. Для КОС и микрококков эти изменения характеризовались достоверным снижением (р 0,05) в очаге РВ и на СУЗК штаммов с высокой степенью адгезивной активности и достоверным увеличением (р 0,05) количества неадгезивных культур этих микроорганизмов по сравнению с началом заболевания.
Частота обнаружения этих микроорганизмов со средним и низким уровнем адгезивности после лечения не претерпевала существенных изменений.
Вместе с тем, в этот период среди резидентных видов коринебактерий доминировали как на пораженном, так и симметричном участке кожи голеней обследуемых культуры со средней степенью адгезивности (67,6%) на фоне появления штаммов с высоким уровнем АА в 5,9 — 10,5% случаев. В начале заболевания выделяли культуры коринебактерий только с низкой и нулевой степенью признака.
