Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 9
1.1 Этиология псориаза 9
1.2 Иммунопатогенез псориаза 26
1.3 Микрофлора кожи и её изменение при псориазе 36
1.4 Классификация, клиника псориаза 41
Глава 2.Материалы и методы 48
2.1 Общая характеристика больных 48
2.2 Детекция вирусов папилломы человека 49
2.3 Исследование микрофлоры кожи 52
2.4 РИП в оценке врожденного иммунитета больных псориазом 55
2.5 Статистическая обработка результатов исследования 57
Глава 3. Результаты 58
3.1 . Выявление ДНК ВПЧ рода beta у больных псориазом 58
3.2 Определение вирусной нагрузки ВПЧ рода beta при псориазе 64
3.3 Особенности микрофлоры кожи и её взаимодействие с гуморальными факторами организма 68
3.3.1 Показатели теста оценки аутомикрофлоры кожи 68
3.3.2 Вирусно-бактериальные ассоциации при псориазе 71
3.4 Оценка врожденного иммунитета больного с применением реакции иммуноприлипания 72
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 76
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Список литературы 95
Введение к работе
Актуальность проблемы
Состояние нормальной микрофлоры человека является одним из важных показателей здоровья организма. Количественные и видовые изменения в составе нормофлоры могут сопровождаться как развитием угрожающих жизни заболеваний, так и манифестацией болезней, исходно протекавших субклинически [Митрохин С.Д.,1998; Шендеров Б.А., 1998; Finegold S.M. et al., 1983].
В настоящее время псориаз является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний кожи; заболеваемость им продолжает непрерывно возрастать [Молочков В.А. и соавт., 2007; Топорова Н.П. и соавт., 1997; Чистяков И.А., 1997; Henseler Т., 1997; Schafer Т. et al., 1996). Имеются данные о том, что некоторые микробные агенты, в том числе S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, могут играть триггерную роль в отношении псориаза [Abeck С, 1992; Aly R. et al, 1976; Leung D.Y. et al, 1993; Tefer N.R. et al, 1992]; при этом большее значение придают не столько очагам фокальной инфекции, сколько массивной микробной контаминации кожи микробными агентами. Так, продемонстрировано, что у больных псориазом численность стафилококков в очагах в 20 раз превосходит таковую на участках непораженной кожи [Noble W.C, 1998].
Высказывается предположение о том, что наряду с бактериями, развитие псориаза может быть связано также с вирусом папилломы человека (ВПЧ) [Pfister Н, 2003]. Среди почти 200 типов ВПЧ выделяют не только слизистые, но и кожные типы, которые также как и ВПЧ слизистого типа, подразделяют на группы низкого и высокого онкогенного риска. Непосредственное участие ВПЧ в кожном канцерогенезе было впервые установлено на примере ВПЧ-5 и ВПЧ-8, ассоциирующихся с верруциформной эпидермодисплазией Левандовского-Лютца с развивающимся в последующем на фоне этого заболевания
плоскоклеточным раком кожи, формирование которого обусловливала интеграция в геном клетки ВПЧ 9, 12, 15, 17, а также 19 — 25 типов [zur Hausen Н., 1996]. ДНК ВПЧ может быть обнаружена и в образцах здоровой кожи, но частота ее выявления достоверно возрастает у лиц с иммуносупрессией [Boxman IX. et al., 1999; Harwood С.A. et al., 2000; Stockflelh E. et al., 2004; Weissenborn S.J. et al., 1999].
Взаимосвязи репликации кожных ВПЧ с течением псориаза изучены менее подробно. Тем не менее, установлено, что частота обнаружения ВПЧ-5 на коже псориатических бляшек более чем двукратно превосходит таковую в образцах видимо здоровой кожи [Prignano G. et al., 2003]. Показано, что частота обнаружения ВПЧ 5, 36, 38 типов в псориатических очагах может достигать 90%. Кроме того, отмеченное Н. Pfister et al. (2003) более чем пятикратное повышение сывороточного титра антител к ВПЧ-5 и ВПЧ-8 у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми людьми косвенно свидетельствует в пользу участия ВПЧ в патогенезе местных иммунологических кожных нарушений при псориазе. Частота обнаружения ВПЧ-5 и ВПЧ-8 достигает максимума также после высокодозовой PUVA-терапии, сопровождающейся локальной иммуносупрессией [Wolf P. et al., 2003].
Таким образом, повышенная репликация определенных типов кожных ВПЧ, отражая присущие псориазу нарушения локального кожного иммунитета, может таюке служить маркером интенсивности патологической пролиферации кератиноцитов в псориатических очагах. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение взаимосвязи оцененной с помощью высокочувствительных методов кожной вирусной нагрузки кожными ВПЧ с другими показателями, отражающими расстройства кожного локального иммунитета, в частности, нарушениями аутомикрофлоры кожи, регистрируемыми исходя из количества персистирующих стафилококков. Результатом изучения кожных бактериально-вирусных ассоциаций при псориазе может стать углубление представлений о формировании и
прогрессировании псориаза с возможным в дальнейшем расширением возможностей его патогенетически обоснованного лечения.
Цель исследования: изучить связь кожных вирусов папилломы человека с нарушениями аутомикрофлоры кожи при псориазе. Задачи исследования:
Оценить частоту обнаружения ДНК ВПЧ в псориатических очагах.
Определить вирусную нагрузку ВПЧ в очагах псориаза и на участках видимо здоровой кожи и изучить ее динамику в зависимости от клинического течения и формы псориаза.
Изучить обсемененность стафилококками пораженных и здоровых участков кожи больных псориазом с оценкой ее динамики в зависимости от клинического течения и формы псориаза, а также состояния врожденного иммунитета, оцениваемого с помощью реакции иммуноприлипания.
Сопоставить динамику микробной обсемененности и вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от клинического течения псориаза.
Научная новизна
Впервые проведено определение кожных типов ВПЧ рода Betapapillomavinis с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени у больных псориазом. На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация клинического течения псориаза с ВПЧ рода Betapapillomavinis. Также подробно описано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения псориаза.
Для оценки врожденного иммунитета организма у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми лицами применен тест для определения уровня аутомикрофлоры кожи (АМФК) в отношении Staphylococcus aureus с помощью контактных слайдов Envirocheck Contact YM (R). Впервые проанализирована взаимосвязь динамики величины вирусной нагрузки ВПЧ рода
Betapapillomavirus и степени микробной обсемененности в зависимости от морфофункционального состояния кожи больных псориазом, динамики клинического течения псориаза и клинической формы. Также впервые проведена оценка врожденного иммунитета больных псориазом с применением реакции иммуноприлипания в титрационном варианте.
Практическая значимость
Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что расстройства локального кожного иммунитета, наблюдающиеся при псориазе и достигающие максимальной выраженности в период его обострения, могут быть диагностированы по увеличению вирусной нагрузки ВПЧ в псориатических очагах и усугублению нарушений аутомикрофлоры кожи, регистрируемому по нарастанию обсемененности кожи стафилококками. Данные показатели могут быть использованы для выявления нарушений локального кожного иммунитета у пациентов, страдающих псориазом, а также мониторирования течения этого заболевания, в том числе в качестве доклинических маркеров его обострений. Определение их обосновано, в первую очередь, у больных псориазом, резистентным к стандартным терапевтическим схемам, а также при решении вопроса о віоіючении в программу ведения антибактериальных и противовирусных препаратов. Детекция нарушений аутомикрофлоры кожи как неинвазивный метод выявления расстройств локального кожного иммунитета может применяться при динамическом наблюдении больных псориазом.
Положения, выносимые на защиту
1. У больных псориазом часто удается обнаружить наличие ВПЧ рода Betapapillomavirus в псориатических очагах, при этом концентрация ДНК ВПЧ рода Betapapillomavirus при псориазе достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ.
Существует взаимосвязь между динамикой вирусной нагрузки ВПЧ и стадией клинического течения псориаза.
Изменения показателей, характеризирующих состояние аутомикрофлоры кожи, коррелируют с динамикой вирусной нагрузки ВПЧ у больных псориазом.
Диагностическая значимость теста с применением контактных слайдов Envirocheck Contact YM (R), описывающего аутомикрофлору кожи (АМФК), и диагностическая значимость теста «Бактотест» сопоставимы.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2007г., 2008г.; на 14-ой международной специализированной выставке «Аптека» 23 - 26 октября 2007г., Москва, СК «ОЛИМПИЙСКИЙ»; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006r.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 37 отечественных и 123 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 18 таблицами.
Этиология псориаза
Общепринятым является представление о псориазе как об аутоиммунном, генетически детерминированном хроническом дерматозе многофакторной природы, характеризующемся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалением дермы с последующим поражением суставов и некоторых внутренних органов [16]. Псориаз — одно из наиболее распространенных хронических заболеваний кожи: в настоящее время его обнаруживают не менее чем у 3% представителей общей популяции. Заболеваемость псориазом продолжает непрерывно возрастать.
Псориаз занимает одно из ведущих мест и в структуре заболеваемости болезнями кожи. Частота его у амбулаторных больных дерматологического профиля составляет около 5%, а среди госпитализированных в специализированные дерматологические стационары — 6,5-22% [18, 28, 71, 59, 78].
Хорошо известно, что псориаз чаще всего возникает в третью декаду жизни [137]. Однако в последние 10-15 лет констатируют неуклонное увеличение числа случаев этого заболевания, возникающих у молодых: у 3/4 пациентов псориаз развивается в возрасте до 40 лет [16].
Сегодня известно более 100 пусковых факторов, способствующих возникновению псориаза или манифестации уже существующего псориатического процесса у лиц с генетической предрасположенностью к нему [16]. Триггеры псориаза могут оказывать как непосредственное действие на кожу, так и обладать системными эффектами. По данным СИ. Довжанского и В.Я. Пинсона (2006), роль предшествующих раздражителей в возникновении заболевания и его рецидивов не удается выяснить лишь у 15% больных псориазом [8].
К экзогенным факторам, провоцирующим развитие или манифестацию псориаза, относится травма, в том числе физическое воздействие — ультрафиолетовые и рентгеновские лучи, дермабразия, хирургическая операция, электротравма, татуировка, вакцинация, укусы насекомых, внутрикожные и подкожные инъекции, ожоги, царапины, акупунктура. Псориаз возникает и вследствие химических ожогов, под действием некоторых препаратов, применяющихся для местного лечения этого лечения, одновременно с проявлениями реакции гиперчувствительности замедленного типа при проведении кожных аллергических проб. Псориаз может сочетаться с воспалительными дерматозами — опоясывающим и розовым лишаем, аллергическим дерматитом.
У многих пациентов дебют или обострение заболевания наблюдают летом или в периоды усиления солнечной активности. Показано, что сильный солнечный ожог может также способствовать развитию псориаза по типу феномена Кебнера (появление высыпаний на участках поврежденных кожных покровов). К оказывающим системное действие факторам, обусловливающим возникновение и/или обострение псориаза, относят инфекционные агенты, в том числе ВИЧ, лекарственные препараты (бета-адреноблокаторы, противомалярийные препараты, нестероидные противовоспалительные), а также курение, психоэмоциональный стресс, злоупотребление алкоголем и эндокринные расстройства [121].
Первые случаи семейного псориаза были описаны еще в начале XIX столетия; в настоящее время роль генетического фактора в развитии этого заболевания не вызывает сомнений. Данные, полученные при анализе родословных, позволяют рассматривать псориаз как заболевание с мультифакторным типом наследования с неполной пенетрантностыо генов. Доля генетической компоненты в развитии псориаза составляет 60-70%, средовой — 30-40% [132].
Многочисленные наблюдения свидетельствуют о большей частоте псориаза (до 36%) в семьях, где болеет хотя бы один представитель, при этом он чаще возникает у родственников первой степени родства. При наличии псориаза у одного из родителей риск его развития у ребенка составляет 14%, если болеют оба родителя - достигает 41%. Установлено, что псориазом заболевают 16% лиц, имеющих одного страдающего псориазом родителя, и 50%) лиц, у которых им больны оба родителя. Распространенность псориаза среди родственников больного I степени родства составляет 5,6-6,3%), II степени — 3,1%), III степени — 1,35% ; в семьях, где ни один из членов, за исключением больного, не болеет псориазом, не превышает 0,75% [18].
Концепция наследственной предрасположенности к псориазу подтверждается также большей его распространенностью у представителей некоторых рас и национальностей, связь в семьях случаев заболевания псориазом с локусом, расположенным на длинном плече хромосомы 17 (17q), показателем фенотипической конкордантности, величина которого в 3 - 4 раза больше у гомозиготных близнецов, чем у дизиготных [18]. В настоящее время описано более 1000 маркеров генетической предрасположенности к псориазу, однако наиболее достоверными из них считают носительство ряда локусов системы HLA.
Общая характеристика больных
Материалом для молекулярно-биологического исследования служили биоптаты кожи размером 0,2x0,2 см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба. Соскоб использовался только для взятия материала из зон псориатических высыпаний, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы.
Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (PBS буфер, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР-анализа при -70 С.
Генодиагностика ВПЧ-инфекции. Подготовка исследуемого материала осуществлялась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением ДНК методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» согласно инструкции производителя
(ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Экстракцию ДНК проводили в 100 мкл ТЕ-буфера. Образцы, содержащие очищенную ДНК, использовали в реакции амплификации нуклеиновых кислот.
Выявление и количественное определение ВПЧ рода Р проводили методом ПЦР в режиме реального времени (А.Ю. Кладова и соавт., 2006) с использованием рекомбинантных плазмидных положительных контролей, содержащих последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, ти, пи и beta-1,3,4,5,7,8,15,20,24,27Ю37,38,49,50,65 (М. Favre Institut Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Human, France; E.M. de Villers, Abteilung tumorvirus- Charakterisierung Referenzzenturum fur Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента Р-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
Для выявления ДНК ВПЧ рода Р были использованы 4 независимые системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов). Первая-для выявления генотипов вида beta 1 (5,8,12,14,20,21,19,25,47,36); вторая-для выявления вида beta 2 (9,15,17,22,23,38,37,80); третья-для выявления вида beta 3 (49,75,76) четвертая - для выявления вида beta 4 (92), beta 5 (96), beta 1 (20,24 и 93 типы). Последовательности всех олигонуклеотидов ВПЧ рода beta были выбраны при анализе известных последовательностей ВПЧ, взятых из Интернет ресурса «NCBI Genebank» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и обработаны при помощи программы AlignX пакета Vector NTI 6 (InforMax Inc., 2000). ПЦР проводили в мультиплексном формате. Аналитическая чувствительность методики позволяла выявлять генотипы вида beta 1-1250 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 2-1000 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 3-450 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 4,5-300 копий ДНК ВПЧ/мл.
В состав реакционных смесей для ПЦР входили следующие компоненты: праймеры и зонды; нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого; ПЦР-буфер (66мМ Tris-HCl, рН 8,8, 17 MM(NH4)2S04, 4 мМ MgCl2 0,01% Tween 20); TaqF ДНК-полимераза (2U в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва); очищенная ДНК, выделенная из клинического материала - 10 мкл.
В отдельные пробирки (вместо образца ДНК) вносили положительные и отрицательные контрольные образцы (10 мкл). Отрицательный контроль амплификации представлял обычную реакционную смесь, в которую вместо образца ДНК добавлялся ТЕ-буфер. Положительный контроль амплификации представлял собой фрагмент специфичной ДНК (контрольные плазмиды ВПЧ в концентрации 104 копий ДНК ВПЧ/мл).
Термоциклирование проводили на амплификаторе МхЗОООР (Stratagene,CUIA), соединенным с персональным компьютером по следующей программе: предварительный этап 95 С - 15 мин., затем при 95 С - 15 сек., при 60 С - 30 сек., при 65 С - 1 мин. - 50 циклов.
Детекция продуктов амплификации осуществлялась в «реальном времени» путем измерения флуоресцентного сигнала, нарастающего по мере накопления специфического продукта реакции. Получаемая зависимость интенсивности флуоресценции от цикла реакции: кривая флуоресценции имела в случае положительной реакции характерный S-образный вид. В соответствии с этим проводили качественную оценку результатов реакции.
Для количественного анализа использовали 10-кратные разведения (6 lg - 1 lg) положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24, 49 типов ВПЧ и ДНК человека (стандарты), по которым осуществляли построение калибровочных прямых и расчет концентрации ВПЧ и ДНК человека.
Для построения и математической обработки описанных кривых использовали программу построения, обработки, анализа кривых флуоресценции и ведения документации для метода ПЦР «в реальном времени» - МхЗОООР (Stratagene, США).
Выявление ДНК ВПЧ рода beta у больных псориазом
В настоящем разделе приведены результаты выявления и определения вирусной нагрузки ВПЧ рода beta (5 видов) у больных псориазом с помощью количественной методики ПЦР с детекцией продуктов амплификации «в режиме реального времени». В исследование были включены 69 образцов псориаза (соскобы). В качестве контроля использовали 46 биоптатов нормальной кожи здоровых добровольцев, у которых кожные заболевания, в том числе, ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. Обследование проводили в два этапа. Первоначально все образцы кожи больных псориазом и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta. В дальнейшем проводили количественный анализ ВПЧ-положительных образцов псориаза и нормальной кожи, заключавшийся в определении вирусной нагрузки ВПЧ и нормировании количества геномов ВПЧ на ДНК человека.
В таблице 5 представлены результаты обследования больных псориазом и лиц контрольной группы (нормальная кожа) на наличие ДНК ВПЧ рода beta. Как видно из таблицы, ДНК ВПЧ обнаруживалась в 2 раза чаще у больных псориазом по сравнению с контрольной группой (р 0,001). Проведенный анализ показал, что наличие ДНК ВПЧ удавалось обнаружить независимо от возраста, пола больных, а также от длительности заболевания.
Оценка частоты обнаружения ДНК ВПЧ рода beta в зависимости от клинической формы псориаза выявила, что ее наличие несколько чаще удавалось зарегистрировать у больных эритродермией по сравнению со страдавшими вульгарным псориазом (94,7% и 84%, соответственно) (рис. 6). 28 больным вульгарным псориазом проводили исследование, направленное на выявление ДНК ВПЧ рода beta как в псориатических бляшках, так и на участках видимо здоровой кожи. Частота обнаружения ДНК ВПЧ рода beta на различных участках кожи больных псориазом представлена в таблице 6.
Как видно из таблицы, более чем в половине исследованных образцов ДНК ВПЧ рода beta удавалось выявить как в псориатической бляшке, так и на
видимо здоровой коже. Почти в 40% образцов наличие ДНК ВПЧ рода beta регистрировалось в псориатических бляшках, но отсутствовало в здоровой коже. Лишь в 2 (7%) образцах ДНК ВПЧ рода отсутствовала как в псориатических бляшках, так и в видимо здоровой коже.
С учетом того, что группоспецифический формат разработанной методики (см. Главу И) позволял дифференцированно выявлять beta 1, beta 2, beta 3, beta 4-5 виды ВПЧ, мы проанализировали данные о частоте их обнаружения и ассоциации в образцах псориаза и нормальной кожи. Результаты приведены в таблице 7. В результате проведенного анализа было установлено, что как в псориатических бляшках, так и нормальной коже выявлялся широкий спектр ВПЧ рода beta, представленный beta 1, beta 2, beta З, beta 4-5 видами. В образцах псориаза папилломавирусы beta 1 и beta 2 видов встречались более чем в 4 раза чаще, (р 0,05), а представители beta 4, 5 видов - почти в 2 раза чаще, чем в нормальной коже.
