Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 7-84
1.1. Характеристика микроорганизмов, окисляющих восстановленные соединения серы 7-42
1.1.1. Физиологические особенности 9-13
1.1.2. Морфологические особенности и тонкое строение 14-26
1.1.3. Принципиальные схемы окисления элементарной серы и ее восстановленных неорганических соединений . 26-38
1.1.4. Экология и практическое значение 38-42
1.2. Роль поверхностных структур при взаимодействии бактерий с различными поверхностями 42-60
1.2.1. Участие дсгутиков и пили 45-49
1.2.2. Роль капсул, слизей и клеточных стенок 49-60
1.3. Процессы первичного воздействия на субстрат, транспорт и окисление его бактериальной клеткой
1.3.1. Изменение питательного твердого субстрата вне клетки 61-66
1.3.2. Транспорт питательного субстрата через клеточную стенку 66-75
1.3.3. Функция периплазматического пространства 75-80
1.3.4. Транспорт питательного субстрата через цитоплазматическую мембрану 81-83
1.4. Заключение. Цель и задачи исследования .83-84
ГЛАВА П. Методы исследований 85-93
2.1. Микробиологические и химические методы 85
2.2. Получение препаратов для электронной микроскопии 85-88
2.3. Методы дезинтеграции бактериальных клеток .88-90
2.4. Метода электронно-микроскопической цитохимии. -90-92
2.5. Метод микрозондового рентгеновского микроанализа 92-93
ГЛАВА 3. Организация поверхностных структур клеток T.ferrooxidans --ІІ1
3.1. Пили T.ferrooxidans 94-97
3.2. Макромолекулярная организация клеточной стенки T.ferrooxidans 97-103
3.3. Тонкое строение клеточной оболочки интактных клеток и сферопластов T.ferrooxidans I03-II0
3.3.1. Тонкое строение интактных клеток T.ferrooxidans .103-104
3.3.2. Получение сферопластов 104-107
3.3.3. Тонкое строение сферопластов I07-II0
3.4. Заключение II0-III
ГЛАВА 4. Изучеше локализащи серы и фосфорных соединений в клетках T.ferrooxidans II2-I44
4.1. Цитохимическое изучение тонкого строения клеток T.ferrooxidans II2-II4
4.2. Идентификация гранул в клетках II5-I20
4.3. Выявление химической природы серосодержащего компонента в клетках T.ferrooxidans с помощью цитохимических методов 120-128
4.4. Локализация серы в клетках T.ferrooxidans в зависимости от стадии развития культуры 128-134
4.5. Локализация АТФ-азной активности в клетках T.ferrooxidans 134-143
4.6. Заключение 143-144
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 145-155
Выводы 156-157
Литература I58-I9I
- Принципиальные схемы окисления элементарной серы и ее восстановленных неорганических соединений
- Транспорт питательного субстрата через цитоплазматическую мембрану
- Тонкое строение клеточной оболочки интактных клеток и сферопластов T.ferrooxidans
- Выявление химической природы серосодержащего компонента в клетках T.ferrooxidans с помощью цитохимических методов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В природных условиях элементарная сера и ее соединения неустойчивы и подвергаются окислению и восстановлению, переходя при этом из одного геосферного резервуара в другой ( Trudinger , 1982 ) . Окисление и восстановление неорганических соединений серы может включать как химические, так и биологические процессы, которые в совокупности осуществляют "биогеохимический цикл серы". Окислять элементарную серу и ее восстановленные неорганические соединения могут представители разных систематических групп в широком диапазоне физико-химических параметров окружающей среды. Тионовые бактерии ( p. Thio-bacillus ) окисляют сульфиды металлов, элементарную серу, тиосульфат, политионаты и сульфит до сульфата. Они используют неорга нические восстановленные соединения серы в качестве энергетических субстратов, осуществляя хемолитотрофный способ питания.
Физиология, биохимия и морфология тионовых бактерий и, в частности вида Т. ferrooxidans , достаточно полно изучены. Однако механизм окисления серы, которая является одним из основных продуктов окисления сульфидных минералов, еще мало изучен. Спорным остается ответ на вопрос о первичных воздействиях бактериальной клетки на гидрофобный субстрат. Мало известно о роли поверхностных структур в окислении серосодержащих неорганических соединений. Поскольку культура T.ferrooxidans используется при бактериальном выщелачивании металлов из руд и концентратов и применяется в гидрометаллургии, решение этих вопросов имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению структуры и функций отдельных органелл клетки и, особенно поверхностных структур, в связи с окислением элементарной серы.
При решении этой проблемы нами были поставлены следующие задачи :
1. Изучить тонкое строение T.ferrooxidans при окислении элементарной серы, обратив особое внимание на их поверхностные структуры.
2, Выяснить функцию отдельных структур T.ferrooxidans в связи с окислением элементарной серы.
Научная новизна работы. Впервые показано, что при окислении элементарной серы клетками T.ferrooxidans она поступает в коллоидном состоянии в периплазматическое пространство и локализуется в нем, а также в крупных биполярно расположенных сферических структурах и в простых инвагинатах цитоплазматическои мембраны.
Установлено, что наиболее интенсивно сера накапливается в клетках T.ferrooxidans в стационарную фазу роста культуры и может использоваться в качестве эндогенного энергетического материала в условиях голодания.
Выявлена локализация в клетках T.ferrooxidans АТФ-азной активности. Она также связана с периплазматическим пространством и с крупными биполярно расположенными сферическими структурами.
Впервые также обнаружены у тионовых бактерий пили и изучена макромолекулярная организация клеточной стенки: обнаружены поры и специализированные отверстия для выхода пили. Предполагается, что в транспорте серы эти структуры участия не принимают.
Практическая ценность работы. В процессе окисления многих сульфидных минералов основным промежуточным, а зачастую и конечным продуктом является элементарная сера. В последнем случае она может подавлять процесс окисления сульфидного минерала. Понимание взаимосвязи структуры и функции бактерий при окислении этого субстрата является существенным для оптимизации условий выщелачивания металлов из руд и концентратов, а также для оценки физиологического состояния бактерий как при окислении сульфидных минералов, так и при хранении или переживании неблагоприятных условий в природных местах обитания.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых и специалистов Института микробиологии АН СССР (Москва,1978 ), на Второй Республиканской конференции молодых ученых (Ташкент,1978 J , вошли в курс лекций для студентов почвенного факультета МГУ, были представлены на Международном семинаре "Современные аспекты микробиологической гидрометаллургии" (Москва,І98Н ;.
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в б статьях.
Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 191 странице машинописного текста, включая 8 рисунков и 54 микрофотографии. В списке литературы 3IZ наименований работ : 68 на русском и 244 на иностранных языках.
Место проведения работы. Работа проводилась в отделе "Микробиология горных пород" Института микробиологии АН СССР. Часть исследований проводилась совместно с А.А.Маныкиньм,А.В.Севцовым. Методическая часть по электронной микроскопии выполнена под руководством ст.н.сотр., к.б.н. Н.А.Переверзева.
Принципиальные схемы окисления элементарной серы и ее восстановленных неорганических соединений
Поскольку среди восстановленных неорганических соединений серы можно выделить растворимые и нерастворимые субстраты, метаболизм их будет несколько отличаться. Использование нерастворимых твердых субстратов, таких как элементарная сера и сульфиды металлов, вносит дополнительный этап, который заключается в первичном воздействии бактерий на субстрат с целью его растворения или разрушения и уже затем транспорта в клетку. В этом разделе диссертации остановимся на биохимическом механизме окисления элементарной серы и ее восстановленных соединений.
Окисление элементарной серы. В ранних работах по изучению механизма окисления элементарной серы тионовыми бактериями было установлено, что этот субстрат окисляется аэробно с образованием сульфата в качестве конечного продукта ( Waksman, 1922; Waksman, Starkey, 1923 J Starkey, 1925; Parker, Prisk,I953). Затем было обнаружено, что при окислении элементарной серы в качестве промежуточного продукта образуется сульфит. Из клеток многих видов тионо-вых бактерий, а именно: T.thiooxidans (Suzuki,1965), T.thioparus (Suzuki, Silver, 1966), T.novellus (Suzuki, 1966) и T.ferrooxi-dans (Silver, Lundgren, 1968) был выделен И очищен серу-ОКИСЛЯЮ - 27 -щий фермент. Под действием этого фермента в присутствии восстановленного глютатиона ( GSH) осуществляется следующая реакция:
Элементарная сера, представляющая собой полимер ( Sn), взаимодействует с восстановленным глютатионом (GSH), образуя полисульфид глютатиона ( GSSnH), который под действием серу-окисля-ющего фермента окисляется в итоге до сульфита (so ). По природе этот фермент - оксигеназа ( Suzuki, 1965), в качестве кофактора он содержит негеминовое железо ( Suzuki, Silver,1966). Активность серу-окисляющего фермента обнаружена как в растворимой, так И В мембранной фракции клеток (Kodama, Mori, 1968; Ко-dama, 1969). Если окисление серы, катализируемое растворимой серу-окисляющей системой, требует добавления восстановленного глютатиона, то система "клеточная стенка - цитоплазматическая мембрана" из экстрактов клеток тионовых бактерий T.thiooxidans и T.neapolitanus не нуждается в таком добавлении ( Adair, 1966; Taylor, 1968). В настоящее время мало известно о сопряжении окисления элементарной серы с транспортом электронов по дыхательной цепи. Не установлено взаимодействие серу-окисляющего фермента с дыхательной цепью интактных клеток.
Окисление сульфидной серы. Этот процесс идет в две стадии (Lundgren, Tano, 1978). В первой стадии происходит окисление,
Интересно отметить, что при окислении сульфида акцептором освобожденных электронов может быть не только кислород, но и нитрат. Такое явление имеет место при окислении сульфида клетками T.-denitrificans в анаэробных УСЛОВИЯХ ( Aminuddin, Nicholas, 1973). Предложена следующая схема механизма окисления сульфида:
-Фермент сульфид-связанная нитрит-редуктаза функционирует как ци-тохром-оксидаза. Представлена возможная схема транспорта электронов В такой системе ( Aminuddin, Nicholas,1973). нитрит-редуктаза Поскольку a?.denitrificans - факультативный анаэроб, роль конечного акцептора электронов могут выполнять кислород либо нитрит (нитрат).
Таким образом, при окислении сульфидной серы промежуточными продуктами, как и при окислении элементарной серы, являются полисульфид и сульфит, который далее окисляется до сульфата ( Ok, Suzuki, 1980): Окисление сульфита. Сульфит, как отмечали выше, является промежуточным компонентом окисления всех восстановленных неорга нических соединений серы (s , s , s20 ). Окисление его до сульфата представляет собой конечный этап при метаболизме всех восстановленных соединений серы клетками тионовых бактерий. Окисление может осуществляться двумя способами: либо с помощью АЮ-не зависимой сульфитоксидазы (Vestal, Lundgren, 1971), либо посредством образования аденозин-5-фосфосульфата (Peck,i960). В последнем случае процесс идет в три ступени: А&С-редуктазная ферментная система окисления сульфита р ( SO3) была обнаружена и изучена в клетках тионовых бактерий, например: Т.thioparus (Lyric, Suzuki, 1970) И T.denitrificans (Bowen et ai., 1966); в клетках пурпурных и зеленых серобактерий ( Kircnhoff,Truper, 1974/; Truper,Rogers, 1977 ), а также в клетках сульфатредуцируїощих бактерий ( Реск,19б1, 1962; Ishimoto, Fujimoto, I961). В клетках сульфатредущрующих бактерий АФС-путь имеет место при диссимиляторном восстановлении 2 2 сульфата (soj ) до сульфита ( so 3). При окислении двух анионов сульфита до сульфата, как видно из приведенных выше реакций, в результате субстратного фосфори-лирования синтезируется одна молекула АТФ и освобождается 4 электрона, которые поступают в дыхательную цепь. Окисление сульфита через АФС-путь имеет важное значение в энергетическом метаболизме тионовых бактерий, поскольку генерация АТФ осуществляется посредством как субстратного, так и окислительного фосфорилирования ( Bowen et al.,1966; Lyric, Suzuki,1970; Suzuki, 1974).
Транспорт питательного субстрата через цитоплазматическую мембрану
Цитоплазматическая мембрана представляет собой типичную биологическую мембрану и отвечает модели Даниэли-Давсона-Роберт-сона (схемы 3 и 4). Она содержит два фосфолипидных слоя, в которые встроены молекулы белка (Costerton et al, 1974). По толщине она приближается к наружной мембране клеточной стенки, что отмечалось нами выше.
Цитоплазматическая мембрана является важным компонентом клетки и выполняет жизненно необходимые функции. Одна из них -способность пропускать питательные компоненты. Проникновение веществ происходит благодаря одному из четырех способов: пассивной или облегченной диффузии, а также активному транспорту или транслокации радикалов (Black, Gerhardt,1961; Kepes, Cohen, 1962; Koch,1964; Kosehberg,1954; Rosemen,1969; Гершанович, 1973).
Два вида переноса, а именно, простая и облегченная диффузия, осуществляются через поры в цитоплазматической мембране, во втором случае перенос происходит с помощью специального белка, локализованного в мембране (Kepes, Cohen, 1962; Koch,1964;
Winkler, Wilson, 1967). Поскольку вещество поступает из окружающей среды, где концентрация его существенно выше, в клетку, где концентрация ниже, то процесс не требует затрат энергии. Благодаря пассивной диффузии в цитоплазму поступает вода, а с помощью облегченной диффузии проникает, например, глицерин ( Sanno et al.,1968).
Питательные субстраты проникают в клетку также с помощью активного транспорта и транслокации радикалов (Гершанович, 1973). В обоих случаях перенос субстрата осуществляется против градиента концентрации, поэтому процессы энергозависимы. Перенос через цитоплазматическую мембрану происходит с участием специфических белков - пермеаз. В процессе транслокации радикалов в отличие от активного транспорта имеет место химическая модификация переносимого субстрата (Roseman, 1969).
Поскольку закисное железо и элементарная сера для клеток тионовых бактерий T.ferrooxidans являются энергетическими субстратами, они не будут транспортироваться через цитоплазматическую мембрану. Окисление этих субстратов, вероятно, осуществляется снаружи от цитоплазматическои мембраны. Закисное железо, как полагают, окисляется в периплазматическом пространстве, а место окисления элементарной серы пока не известно.
В заключение необходимо отметить, что процесс окисления нерастворимого субстрата - элементарной серы является многоступенчатым. Он состоит из первичного воздействия на субстрат, поступления его в клетку и последующего окисления. Однако многие моменты в этих процессах еще недостаточно полно изучены; так не ясны тонкие механизмы взаимодействия клетки с субстратом и поступления гидрофобного субстрата в клетки. Не ясно также, где именно происходит процесс окисления субстрата и как это связано с синтезом АТФ и работой АТФ-азы.
В результате суммирования приведенных литературных данных можно представить схему окисления элементарной серы клетками тионовых бактерий:
1) синтез и выброс клеткой экзопродуктов липидной природы;
2) смачивание субстрата липидами и адгезия бактериальной клетки;
3) проникновение субстрата в клетку в растворенном (?) или нерастворенном состоянии (?);
4) наличие специальных структур в клетке, участвующих в пе - 83 -ремещении субстрата во внутрь (?);
5) окисление субстрата в периплазматическом пространстве на цитоплазматической мембране (?). Синтез АТФ.
Из обзора литературы следует, что многое в изучении физиологии, биохимии и морфологии тионовых бактерий и, в частности вида Т.ferrooxidans, достигнуто. Сера является одним из основных продуктов окисления сульфидных минералов, однако механизм ее окисления еще недостаточно изучен. Спорным остается ответ на вопрос о первичных воздействиях бактериальной клетки на гидрофобный субстрат. Мало известно о роли поверхностных структур в окислении серосодержащих неорганических соединений. Поскольку культура T.ferrooxidans используется в бактериальном выщелачивании металлов из бедных руд и применяется в гидрометаллургии, решение этих вопросов имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
Мы полагали, что одним из наиболее перспективных подходов в решении этой проблемы является изучение структуры и функций организма при окислении элементарной серы.
Цель настоящей диссертации заключается в изучении ультраструктурной организации T.ferrooxidans в связи с окислением элементарной серы.
Конкретная цель заключается в следующем.
1. Изучение организации поверхностных структур клеток Т.ferrooxidans.
2. Изучение локализации серы и фосфорных соединений в клетках Т.ferrooxidans.
3. Взаимосвязи структуры и функции клеток T.fer rooxidans при окислении ими элементарной серы.
Тонкое строение клеточной оболочки интактных клеток и сферопластов T.ferrooxidans
Окисление элементарной серы и сульфидных минералов осуществляется при непосредственном контакте клеток T.ferrooxidans с нерастворимым субстратом. В связи с этим большой интерес представляет изучение клеточной оболочки интактных клеток, а также изучение сферопластов, полученных из интактных клеток T.ferrooxidans, выращенных на среде с элементарной серой.
При изучении сферопластов T.ferrooxidans для сравнения нами были получены тонкие срезы интактных клеток, выращенных на среде с элементарной серой. На электронных микрофотографиях (рис. 9а) видно, что клетки, не обработанные лизоцимом, имеют палочковидную форму и характерную для них внутриклеточную организацию. Размеры клеток находятся в пределах 0,55 - 0,65 х х 1,2-1,5 мкм. На клетках обнаружены "поверхностные" структуры, диаметр которых достигает 50 нм (рис. 96).
Клеточная стенка интактных клеток T.ferrooxidans имеет сложное строение. Она состоит из трехслойной наружной мембраны, периплазматического пространства, содержащего пептидогликановый электронноплотный слой (рис. 9а).
Получение сферопластов. При получении сферопластов была использована методика, предложенная для морских форм рода Pseudo-monas (Costerton et al., 1967) и модифицированная для получения сферопластов из клеток грамотрицателышх гетеротрофных бактерий BOrdetella pertussis (Захарова с соавт.,1975). Метод описан выше. Он включает обработку клеток T.ferrooxidans растворами ЖаС1 (0,5 М), затем экспозицию,в сахарозе (0,5 М) и последующую инкубацию с лизоцимом.
Выход сферопластов T.ferrooxidans зависит от используемой концентрации лизоцима. Так, при иппользовашш фермента в концентрациях 200 и 40U мкг/мл, выход сферопластов составлял соответственно 62 и 77$.
Прежде сферопласты были получены из клеток T.ferrooxidans, выращенных на среде с закисным железом ( Schnaitman, Lundgren, 1965 а). При получении сферопластов эти авторы использовали метод повторного замораживания и последующего оттаивания клеточной суспензии в растворе, содержащем лизоцим, ЭДГК и 10% раствор сахарозы.
Однако получить сферопласты из клеток T.thiooxidans посредством обработки их лизоцимом или лизоцимом - ЭДТК (Noguchiet al., 1977; Marunouchi, Mori, 1968) в соответствии с методиками, использованными для получения сферопластов из клеток E.coli, не удалось ( Miura, Mizushima, 1969; Osborn et al., 1972). Причина этих неудач, по мнению Ногучи с соавторами (Noguchi et al., 1977), заключается в специфике химического состава мукопептидного слоя клеточной стенки T.thiooxidans, который содержит главным образом глюкозу, галактозу, рамнозу и лишь небольшое количество N-ацетилмурамовой кислоты.
Улитковый фермент, как известно, вызывает гидролитическое расщепление глюкана клеточной стенки дрожжей в результате действия -глюкйназы ( Eddy, Williamson, 1957; Anderson, Millbank, 1966). Ногучи с соавторшж ( Noguchi et al., 1977) показали, что после обработки клеток T.thiooxidans кишечным соком улитки средний электронноплотный слой клеточной стенки исчезал и клетки теряли палочковидную форму.
В результате ферментативной дезинтеграции клеток T.ferro-oxidans лизопимом рвется 1-4у-гликозидная связь между N -аце-тилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой, что приводит к "растворению" мукополимерного слоя, а это в свою очередь приводит к потере ригидности клеточной стенки.
Сферопласты T.ferrooxidans в отличие от интактных клеток не содержат мукопептидный слой и имеют овальную или слегка продолговатую форму и размеры 0,50-0,65 х 0,75-0,95 мкм (рис. 10 а,б). Периплазматическое пространство сферопластов сильно увеличено и в некоторых случаях достигает 97 нм (рис. 10 б).
Таким образом, нами, как и другими авторами ( Schnaitman, Lundgren,1965а; Costerton et al.,1967; Захарова с соавт., 1975), показано, что предварительная обработка клеток бактерий, в том числе и тионовых, сахарозой является необходимым этапом
. Ультратонкие срезы интактных клеток Т.ferrooxidans . а-палочковидная форма; б-распределение поверхностных структур. НМ-наружная мембрана клеточной стенки,
Ультратонкие срезы сФеропластов Т. ferrooxidans а-округлая форма; б-увеличение периплазматического пространства ПП . СС-средний слой, Ц-цитоплазма,Н-нуклеоид,ПР-полирибосомы,ПС-поверхностные структуры. при получении сферопластов. Вопрос о необходимости обработки клеток ЭДТ\ остается не совсем ясным. Ряд авторов считает, что обработка клеток ЭДТА необходима, так как это соединение действует на поверхностные слои клетки и тем самым способствует действию лизоцима на ригидный мукопептидный слой ( Costerton et al., 1967). По данным Захаровой с соавторами (1975), использование ЭДТЯ при получении сферопластов грамотрицательных бактерий не обязательно. При получении сферопластов из клеток T.ferrooxidans нами ЭДТК также не применялась.
Таким образом, нами показано, что сферопласты из клеток T.ferrooxidans, выращенных на среде с элементарной серой, можно получить при инкубации клеточной суспензии в 0,5 М растворе сахарозы и последующей обработке клеток лизоцимом.
Выявление химической природы серосодержащего компонента в клетках T.ferrooxidans с помощью цитохимических методов
В процессе изучения механизма окисления элементарной серы клетками тионовых бактерий T.ferrooxidans встает вопрос о том, в каком состоянии сера транспортируется в клетку. Выше при сочетании цитохимического метода выявления серосодержащего компонента с помощью AgN03 и метода энерго-дисперсионного микроанализа удалось установить локализацию в клетке серосодержащего компонента. Поскольку данные методы не позволили точно выявить химическую природу серосодержащего компонента, необходимо было применить цитохимические методы с использованием других реагентов. Важным также было выяснение вопроса о специфичности реакции серосодержащего компонента в клетке с 2% раствором AgNOo.
Известно, что ион серебра, который всегда находится в растворе в виде однозарядного катиона (Ag+ ), может реагировать различными серосодержащими анионами (Алексеев, I960):
Одновалентные катионы серебра, меди, золота и двувалентные катионы ртути, свинца, меди, кадмия и цинка, а также соединения трехвалентных катионов мышьяка и сурьмы обладают особенно высоким сродством к сульфгидрильным группам (SH - группам) (пит. по Торчинокому, 1977, стр. 43). В результате реакции SH-групп с катионами металлов образуются меркаптиды: R-SH + Ме+= = R-SMe + Н+
Отсюда следует, что не исключена возможность взаимодействия ионов серебра с SH -группами белков.
Поскольку ионы кадмия специфически связываются с сульфгид-рильными группагли и эта реакция используется в качественном анализе для отделения сульфгидрильных групп от других серосодержащих анионов в растворе (Алексеев,I960), при изучении природы серосодержащего компонента, обнаруженного в клетках T.ferrooxi-dans , была использована цитохимическая реакция с 2% раствором Cd(N03)2.
В этой серии опытов, как это видно на рис. 19 а, продукт положительной реакции с ионами Cd++ в клетках T.ferrooxidans, выращенных на среде с элементарной серой, отсутствует. Отдельные участки наружной мембраны клеточной стенки были отчетливо обозначены (рис. 19 б), цитоплазма бактерий содержала более плотные участки, чередующиеся со светлыми зонами {рис. 19 а,б), но электронно-плотные гранулы отсутствовали. Поскольку при окрашивании клеток T.ferrooxidans 2% раствором Gd(N0 )2 цитохимическая реакция отсутствует, можно сказать, что свободные (SH )-группы В клетках T.ferrooxidans с ПОМОЩЬЮ AgNO не обнаруживаются.
Если ион серебра ( Ag ) взаимодействует с анионом тио 2— сульфата ( &2з ), то в случае избытка ионов серебра в растворе соль Ag2s2o быстро переходит в Ag и выпадает в осадок (Алексеев,I960). Полученный осадок растворим в разбавленной азотной кислоте ( HNO ) при нагревании до 40.
Были проведены следующие опыты. Срезы клеток T.ferrooxi-dans , обработанных 2% раствором AgNO , наносили на медные сеточки, покрытые пленкой-подложкой- из формвара. Затем препараты помещали в 1% или 2% раствор азотной кислоты (НЕГО ) при 40 в течение 1-2 часов. После этого их тщательно промывали в дистиллированной воде и контрастировали Ъ% раствором уранил-ацетата. Количество электронно-плотных гранул цитохимической реакции с 2% раствором AgNO в обработанных таким образом клетках (рис. 20 а) не отличалось от их количества в контрольном варианте (рис. 20 б). Следовательно, осадок не растворим в азотной кислоте.
Можно заключить, что в клетках отсутствуют в свободном со-стоянии как (SH )-группы, так и анионы тиосульфата ( S23 Кроме того, мало вероятно, что электронно-плотные гранулы положительной реакции с AgNOjj представляют собой AgS04, поскольку эта соль легко растворима в воде.
Таким образом, из серосодержащих компонентов, которые могут давать положительную реакцию с ионом серебра, остаются два возможных варианта: либо сульфит (SO3), либо коллоидная сера -(5). Для идентификации ее были использованы следующие методы.
Клетки T.ferrboxidans, выращенные на среде ЭД с элементарной серой, предварительно обрабатывали 70$ или 96$ растворами этилового спирта, либо 95$ раствором метилового спирта.
Как видно из микрофотографий (рис. 21 а,б), после обработки этиловым спиртом клетки содержали электронно-плотные гранулы, которые по локализации и количеству не отличались от таковых в клетках, не обработанных этиловым спиртом (рис. 13 а). Гранулы ориентированы в клетках главным образом в клеточной стенке и заполняют ее целиком.
В клетках T.ferrooxidans, выращенных на среде 9К с элементарной серой и обработанных 95$ раствором метилового спирта, после проведения цитохимической реакции с 2$ раствором AgNO- можно наблюдать лишь отдельные очень мелкие электронно-плотные гранулы, расположенные в клеточной стенке и в цитоплазме около овальных пустот, имеющих размер от 80 до 100 нм (рис. 22 а; ).
Как видно из данных таблицы I, именно метиловый спирт является более активным растворителем серы.
