Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1.Современные представления о формировании микробиоценозов человека 14-41
1.1.1 .Экосистемные симбиотические взаимодействия 14-18
1.1.2.Микробиота толстого кишечника 18-26
1.1.3. Кишечные дисбиозы и экологический прессинг 26-41
1.2. Колонизационная резистентность - ключевая функция индигенных микроорганизмов 41-52
І.З.Бифидобактерии: молекулярный подход и геносистематика 52-56
1.4. Современные методы коррекции дисбиотических нарушений 56-68
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 68-96
2.1. Объекты исследований 69-70
2.2. Методы исследований 70-78
2.3. Эколого-гигиеническая характеристика изучаемых территорий Восточной Сибири 78-96
ГЛАВА 3. Характеристика интестинальных микробиоценозов у детей дошкольного и школьного возраста, проживающих на территории иркутской области 97-139
3.1. Анализ состояния здоровья детей в гг. Иркутск, Ангарск, Шелехов...97-102
3.2. Особенности интестинальных микробиоценозов у детей Иркутска... 102-106
3.3. Особенности интестинальных микробиоценозов у детей Ангарска .106-115
3.4. Характеристика микробной экологии кишечного биоценоза у детей г. Шелехова 115-120
3.5. Сравнительная характеристика интестинальных микробиоценозов у детей, проживающих в промышленных городах Иркутской области 120-122
3.6. Региональные ориентиры количественного содержания основных аутохтонных микроорганизмов в кишечной микробиоте детей Иркутской области 122-123
3.7. Характер дисбиотических нарушений у детей с клиническими проявлениями кишечного дисбиоза 124-129
3.8 Изменение биологического профиля и биохимическая внутрипопуляционная гетерогенность Е.соН у лиц с манифестными формами дисбиоза кишечника 129-134
3.9. Динамика структуры кишечных дисбиозов детей, рожденных в разные годы 134-139
ГЛАВА 4. Некоторые биологические характеристики популяций бифидобактерий у населения иркутской области 139-145
4.1. Изучение антагонистических свойств аутоштаммов бифидобактерий, изолированных от детей с дисбиозами толстого кишечника 139-145
ГЛАВА 5. Изучение видовой архитектоники бифидобактерий на основе молекулярно генетического подхода 145-156
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 156-163
Выводы 163-165
Практические рекомендации 165
Список литературы 166-191
Список основных сокращений 192
- Колонизационная резистентность - ключевая функция индигенных микроорганизмов
- Эколого-гигиеническая характеристика изучаемых территорий Восточной Сибири
- Особенности интестинальных микробиоценозов у детей Ангарска
- Региональные ориентиры количественного содержания основных аутохтонных микроорганизмов в кишечной микробиоте детей Иркутской области
Введение к работе
Актуальность исследования
Экологическая система, неразрывными компонентами которой являются макроорганизм, его микробиота и окружающая среда, характеризуется единством и способностью к саморегуляции. Изменения количественного и видового состава микробиоты кишечника могут возникать при действии самых различных факторов экзогенной и эндогенной природы, включая социальные, климатогеографические и экологические. Не менее важной проблемой является ухудшение экологической обстановки, связанное с урбанизацией (Веккер И.П. и соавт., 2001; Голубев И.П., 2001; Красногорская Н.В., 2002). Имеются доказательство того, что в микробиотопах детей, проживающих в неблагоприятной эколого-биогеохимической зоне, отмечались серьезные нарушения микробной колонизации. Они проявлялись в снижении и изменении свойств симбиотических микроорганизмов, модификации общей микробной обсемененности и появлении условно-патогенных микроорганизмов, не свойственных данному биотопу, сдвигом микробных сообществ в сторону ассоциативного роста грамотрицательных бактерий, что, бесспорно, требует разработки специальной программы коррекции и реабилитации (Урсова Н.И., 2001). По данным Всемирной Организации Здравоохранения, 20% заболеваний человека, так или иначе, связаны с изменением состояния окружающей среды и, в первую очередь, с загрязнением воздушного бассейна. Комплексная медико-экологическая оценка отражает общую неблагоприятную экологическую ситуацию в изучаемых городах (Иркутск, Ангарск, Шелехов) (данные Росгидромета по Иркутской области).
Доказано, что изменения в иммунореактивности организма отражаются и на его микробиоценозе, придавая особенности нормальной микробиоте кишечника, а состав и биологические свойства микробиоты, в свою очередь, определяют состояние здоровья человека, что подтверждается ее изменениями при различных заболеваниях (Kassie F. et al., 2000; Миронов А.Ю. и соавт., 2001; Bjorksten et al., 2001; Sekirov I., Finlay B.B., 2009; Morowitz M.J. et al., 2010). При этом нарушения в составе микроорганизмов кишечника наступают задолго до клинических симптомов и поэтому могут быть предвестниками патологического процесса. В связи с этим возникает необходимость в разработке критериев оценки микроэкологического статуса кишечного биоценоза и определении региональных количественных ориентиров у населения различных территорий (Воробьев В.И. и соавт., 1998; Миронов А.Ю., 2001; Schulenburg H. et al., 2009).
Учитывая малую вероятность полного оздоровления окружающей среды в ближайшее время, формирование и поддержание оптимальных микробиоценозов и их коррекция при дисбиозах являются важными задачами как в отношении сохранения здоровья отдельных людей, так и населения в целом (Глушанова Н. А. с соавт., 2007; Lampe J. W., 2008; Preidis G.A., Versalovic J., 2009; Saulnier D.M.A . et al., 2009). Это делает необходимым дальнейшее расширение и углубление исследований в области микробной экологии, направленных на выяснение закономерностей саморегуляции биоценозов, определения их роли в поддержании гомеостаза и в возникновении многих заболеваний (Finegold S.M. et al., 1983; Векслер И.Г., 1985; Gialdroni-Grassai, 1985; Van der Waaij, 1996; Hamilton-Miller J.,1997; Костюкова Н.Н., 1999; Крамарь Л.В., 2001; Домарадский И.В. с соавт., 2002; Versalovic J., 2006; Costello E. K. et al., 2009; Turnbaugh P. J., 2009; Hattori M., 2009; The NIH Human Microbiome Project, 2009).
Цель исследования: на основе изучения особенностей региональной архитектоники кишечного микробиоценоза определить основные варианты интестинальных микроценотипов и видовой рейтинг бифидобактерий у детей Иркутской области.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Изучить региональные особенности микробного пейзажа кишечной микробиоты у здоровых детей Иркутской области в условиях существующей техногенной нагрузки.
Проанализировать динамику микроэкологических нарушений у детей с клиническими проявлениями кишечного дисбиоза.
Определить спектр геновидового разнообразия рода Bifidobacterium в кишечнике детей и взрослых, проживающих в зоне техногенного загрязнения, а также выявить доминирующие виды бифидобактерий.
Исследовать антагонистическую активность региональных штаммов популяции бифидобактерий.
Научная новизна работы и ее теоретическая значимость
Впервые определены качественные и количественные характеристики микробного пейзажа основных групп резидентных микроорганизмов в кишечной микробиоте детей, проживающих в городах Иркутской области, выявлены характерные отличительные особенности микробиоценозов в зависимости от места проживания.
Установлено, что многолетняя динамика структуры кишечных дисбиозов у детей имеет выраженную тенденцию сокращения тяжёлых форм на фоне отсутствия эубиотических состояний.
Впервые показана оригинальная видовая архитектоника региональных штаммов бифидобактерий с преобладанием B.longum и их низкая антагонистическая активность.
Показана информативность метода МГНК и его перспективность для видовой идентификации бифидобактерий.
Предложен универсальный алгоритм для популяционной оценки микроархитектоники интестинальной микробиоты по отношению к общефизиологическим нормам и региональным ориентирам.
Практическая значимость и внедрение результатов исследований
Создана база данных по микроэкологическому пейзажу кишечного биоценоза человека у населения Иркутской области, защищённая патентом РФ (Рег. номер св. 2009620535 от 06.11.2009).
Характеристика основных вариантов интестинальных микробиоценозов и региональные показатели количественного содержания основных групп индигенных микроорганизмов в кишечнике детей, проживающих в городах Иркутской области, легли в основу методических рекомендаций для врачей «Региональные особенности микробной экологии у детей Иркутской области» и используются в учебном процессе на кафедрах эпидемиологии ГОУ ДПО ИГИУВ Росздрава, общей гигиены ГОУ ВПО ИГМУ Росздрава, физико-химической биологии ГОУ ВПО ИГУ, а также в работе врачей-бактериологов МУЗ ГКБ № 9 г. Иркутска. Акты внедрения приложены к диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Микроэкологическая структура кишечных биоценозов здоровых детей Иркутской области имеет региональные особенности, характеризующиеся снижением количества доминирующих симбионтных микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл, нормальной кишечной палочки), высокой частотой индикации атипичных эшерихий (слабоферментативные, лактозонегативные и гемолитические варианты), увеличивающейся с возрастом детей. У детей изученных городов сложился оригинальный микробиоценоз, отличный от других, как по архитектонике, так и по выделению «индикаторных» штаммов условно-патогенных микроорганизмов (УПМ).
2. Многолетняя динамика структуры дисбиотических изменений в кишечной микробиоте детей с клиническими проявлениями дисбиоза (диспептический синдром, аллергические реакции) характеризуется значительным сокращением, вплоть до отсутствия, как глубоких изменений кишечного микробиоценоза (IV степени дисбиотических изменений), так и отсутствием эубиотических состояний.
3. Видовая архитектоника бифидобактерий у жителей гг. Иркутска и Ангарска имеет оригинальную региональную структуру с преобладанием B.longum. Популяции региональных аутоштаммов бифидобактерий характеризуются резко выраженным снижением антагонистической активности по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, способствуя усилению их персистентного потенциала и формированию патобиоценозов.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международном конгрессе по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2007 г.), Юбилейной международной конференции НИИЭМ, (Иркутск, 2007г), Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье семьи – здоровый ребёнок», посвящённой 20- летию Института педиатрии НЦ ПЗС РЧ СО РАМН (Иркутск, 2009 г.), Научно-практической конференции для врачей (Иркутск, 2009 г.), 6-й Объединенной научной сессии 2-го Международного конгресса по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2009 г.), 8-й научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2010 г.).
Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы и заключалось в выполнении всех микробиологических исследований, статистической обработке результатов, анализе полученных данных, в обобщении и оформлении результатов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикаций материалов диссертационных работ, 1 методические рекомендации, 1 патент РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 196 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 30 рисунками, 2 микрофотографиями. Библиографический указатель включает 131 наименование отечественных и 105 зарубежных источников литературы.
Колонизационная резистентность - ключевая функция индигенных микроорганизмов
Известно, что одной из ключевых функций индигенной микрофлоры ЖКТ является формирование и поддержание колонизационной резистентности. По определению Van der Vaaij (1987), «колонизационная резистентность» - это «резистентность, с которой сталкиваются потенциально патогенные микроорганизмы при попытке колонизировать места обитания на слизистой оболочке одного из трех трактов, имеющих открытое сообщение с внешним миром: дыхательного, мочеполового и пищеварительного». Помимо микрофлоры, в обеспечении колонизационной резистентности участвуют кожные покровы и слизистые, а также клеточные и гуморальные элементы иммунной системы. Однако именно с нормальной микрофлорой - первым и основным барьером - сталкиваются экзогенные микроорганизмы, во множестве поступающие с обсемененной пищей, водой, частицами капельного пылевого аэрозоля и др. Механизмы колонизационной резистентности можно разделить на прямые и непрямые. К прямым механизмам относятся продукция бактериями ингибиторных факторов) (короткоцепочечные жирные кислоты, бактериоцины, дефенсины,. лантабиотики и; др.), нарушающих метаболизм патогенных и условно—патогенных бактерий, конкурентная борьба- за питательные субстраты, места адгезии, прямая деградация токсинов, антиэндотоксической действие, препятствие транслокации в другие участки организма [Zoetendal E.G., Cheng В;, et ak, 2004]. К непрямым эффектам относятся активация иммунной; системы, стимуляция системы мононуклеаров, интерфероногенная функция, ингибирование конъюгации желчных кислот и т.д.
Естественно, что множественность механизмов, обеспечивающих колонизационную резистентность, предполагает ж многообразие вариантов, комбинации в конкретных ситуациях.-Так, при комплексной оценке состояния факторов, формирующих колонизационную резистентность толстой кишки у больных хроническим; панкреатитом показано, что дисбиотические изменения микрофлоры кишечника ассоциируются с нарушениями; качественного и количественного спектра КЖК, отражающих метаболическую активность микрофлоры, со снижением, продукции секреторного иммуноглобулина А основного элемента гуморального-мукозного иммунного ответа и показателя состояния эпителия слизистой,толстой кишки, с дисрегуляцией цитокиновой сети- и внешнесекреторной недостаточностью поджелудочной железы. [СираеваА.С.,2008]. Определяющим условием эффективной работы системы колонизационной резистентности является количественный и качественный состав микроорганизмов ЖКТ и состояние среды их обитания. А ключевой характеристикой микроорганизмов в системе КР является антагонистическая; активность. Антагонистическая активность бактерий определяет выживание микроорганизмов при их взаимодействии в бактериальных ассоциациях, которые являются частью ассоциативного симбиоза — многокомпонентной системы, где кроме хозяина и доминантного микросимбионта учувствуют ассоциативные симбионты, выполняющие функцию формирования и обеспечении стабильности и продуктивности симбиоза (Бухарин О.В. и др., 2007). Исследования Guiot H.F. показали, что в анаэробных условиях, которые имеют место в толстом кишечнике, бактериальный антагонизм определяется высокой степенью конкуренции за субстрат [Guiot H.F., 1982].
При этом антагонистическая активность доминантной микрофлоры регулируется ассоциативными бактериями. Известно, что продукция бактериями различных антимикробных веществ - антибиотиков, бактериоцинов, литических ферментов подвержена микробной регуляции [Егоров Н.С., 2004] и определяет взаимодействие между микроорганизмами в ассоциациях, способствуя стимуляции бактериального антагонизма [Dubuas Ch et al., 2007; Вахитов, 2007]. К сожалению, антагонистические свойства бактерий при межмикробных отношениях недостаточно охарактеризованы, не ясна роль индукторов антагонизма - феромонов, гомосеринлактонов, клеточных стенок - при реализации отношений антагонистического типа на межвидовом уровне, не определено для большого числа антимикробных факторов связь между изменением их продукции и выраженностью антагонистской активности. К малоизученным явлениям следует отнести биотическую регуляцию антагонизма бактерий, обусловленного литическими ферментами — р-гликозидазами, пептидазами, амидазой. Открытым остается вопрос и о практическом использовании регуляторов антагонистической активности бактерий в формировании колонизационной резистентности хозяина. Показано, что бактериальный антагонизм подвержен регуляции со стороны микроорганизмов различных таксонов, где модулирующим антагонизм эффектом обладают как метаболиты, так и пептидогликаны бактерий. Обнаружено неизвестное ранее свойство бактериального пептидогликана — регулировать внутриродовой и межродовой антагонизм прокариот в условиях межмикробных отношений. Изучение отношений между штаммом антагонистом и чувствительной культурой под воздействием метаболитов и пептидогликанов различных микроорганизмов, выявило индифферентное, стимулирующее и ингибирующее действие бактерий-регуляторов. Обнаружена способность бактерий-регуляторов изменять изначально наблюдаемый антагонизм от полного ингибирования признака до ростстимулирующего эффекта.
Регуляция антагонистической активности осуществляется за счет продукции антимикробных веществ, в частности, литических ферментов. Выявлена связь между изменением антагонистической и Р-гликозидазной активностями микроорганизмов под воздействием метаболитов и , пептидогликанов бактерий-регуляторов [Семёнов А.В., 2007, 2008]. Иммуномодулирующая функция микрофлоры, ЖКТ реализуется на различных уровнях иммунной защиты [Lammers К.М et al., 2003; Veckman V., , Miettinen M. et al., 2003] Один из основных эффектов - стимуляция местного иммунитета, за счет повышения уровня секреторного иммуноглобулина А. Помимо этого, микрофлора активно взаимодействует с клетками иммунной I системы ЖКТ, определяя их дифференцировку, играет ключевую роль в " индукции пищевой толерантности, влияя на баланс в системе Thl/Th2 [Горелов t А.В., Усенко Д.В., 2006] Исследования голланских учёных, проведённые на волонтёрах, показали высокую степень корреляции между «золотым стандартом» оценки колонизационной резистентности (изменение концентрации искусственно введённого штамма, NR-E.coli) и количеством биотипов энтеробактерищ т.е. КР обратно пропорциональна числу биотипов Enterobacteriaceae. На основе изучения титров антител к контаминанту был сделан вывод о том, что IgM и IgG не принимают непосредственного участия в обеспечении колонизационной резистентности. КР является важным параметром при оценке воздействия антибиотиков на фекальную микрофлору [Apperloo-Renkema HZ, van der Waaij D, 1991]. ; Показано, что бифидобактерии усиливают реакции иммунитета, стимулируя продукцию цитокинов в макрофагах [Marin et al., 1997],благоприятно
Эколого-гигиеническая характеристика изучаемых территорий Восточной Сибири
Проблема диагностики и профилактики заболеваний, связанных с воздействием неблагоприятных экологических факторов, относится, к числу .приоритетных в профилактической медицине. Гигиеническая донозологическая диагностика призвана изучать адаптационные резервы и устанавливать донозологические состояния организма человека в связи с воздействием факторов окружающей среды. Особый интерес для оценки состояния здоровья людей представляет диагностика микробиоценозов. В настоящее время дисбактериоз или дисбиоз, рассматривается как нарушение одного из параметров гомеостаза организма и имеет еще одно очень четкое определение - микроэкологический дисбаланс. При изучении особенностей микроэкологического дисбаланса кишечника важно знание региональных физиологических нормативов состава компонентов нормальной микрофлоры. Социальное значение микроэкологических разработок значительно возрастает в эпоху научно-технических преобразований, характеризующихся усилением взаимодействия общества и природы. Многокомпонентное загрязнение окружающей среды приводит к росту дисбиозов на территории отдельных регионов нашей страны, в том числе Иркутской области [Лещенко Я.А.,1997]. Современная экологическая политика, содействующая охране и улучшению здоровья населения, невозможна без понимания закономерностей функционирования нормальных биоценозов человека.
Нормальная микрофлора находится в прямой зависимости от факторов окружающей среды, является первичной мишенью приложения любого попадающего в организм соединения и первой вовлекается в трансформацию естественных и чужеродных субстанций, в том числе ксенобиотиков и экотоксикантов. Это способствует росту дисбиозов биотопов человека, приводит к изменению физиологических, биохимических и иммунологических показателей, накоплению и селекции атипичных штаммов, формированию в организме новых микробных сообществ (патоценозов) и, в конечном итоге, способствует возникновению патологических состояний [Савченков М.Ф., 1991; Ревич Б.А., 2000; Леванова Л. А., 2003]. В процессе постоянного взаимодействия макро- и микроорганизмов формируется уникальная система, находящаяся в состоянии динамического равновесия. При этом постоянство микрофлоры, микробиологический фенотип, присущий каждому человеку, является показателем иммунологической реактивности организма и одним из факторов естественного иммунитета [Шендеров Б.А., 2005]. В условиях техногенной нагрузки, которая имеет место в промышленных городах Сибири [Григорьев В.А., 2001; Пененко В.В., 2004] изменения микробиоценозов в различных биотопах очевидны, они имеют свои характерные, региональные особенности, которые необходимо учитывать при оценке результатов бактериологических исследований. Анализ последних тенденций изменения экологической ситуации в городах России показал увеличение степени поляризации загрязнения, нарастающей при переходе на более низкий иерархический уровень [Битюкова В.Р. 2005]. Для выявления степени техногенной нагрузки в отдельных городах, а также расшифровки экологической инфраструктуры в пределах одного города применяются различные методики зонирования и картирования территорий [Воробьев В.В.,1996; Пудовкина Т.А., 2001; Тетиор А.Н., 2002; Быков А.А., 2002: Иванова Ю.Д.. 2004: Пивкин В.М.. 20051. Картирование юга Иркутской области с целью комплексной медико-экологической оценки отражает как общую ситуацию в изучаемых городах, (Иркутск, Ангарск и Шелехов), так и даёт возможность проанализировать медико-экологические особенности отдельных городов с учётом населённости, доминирующих видов промышленности, географического расположения (данные Росгидромета по Иркутской области и результатам исследований Ангарского филиала ВСНЦ ЭЧ СО РАМН- НИИ Медицины труда и экологии человека) (рис. 2.3.1). По данным Всемирной Организации Здравоохранения, 20% заболеваний человека, так или иначе, связаны с изменением состояния окружающей среды и, в первую очередь, с загрязнением воздушного бассейна [Эткина Э.И., 1992;. Seaton A, MacNee W.et al., 1995; Albright J.F., 1996]. Исследования Прусакова В.М., Вержбицкой Э.А. и др., (2009) показали, что при оценке риска вклад загрязнения атмосферного воздуха в формирование общей заболеваемости и смертности в г. Шелехове прогнозировался на уровне 21% и 15% соответственно, а в экологически обусловленную часть заболеваемости - около 51% , что подтверждает ведущую роль загрязнения атмосферного воздуха в формирование экологического неблагополучия.
Причём, с загрязнением атмосферного воздуха может быть связано 17,8-26,0%, а с другими социально-экологическими и санитарно-эпидемиологическими неблагоприятными факторами - 15,2-22,5% экологически обусловленной заболеваемости населения [Прусаков В.М., 2004]. В зависимости от особенностей города среди стационарных и мобильных источников риска смерти от загрязнения атмосферного воздуха ведущая роль принадлежит крупным промышленным предприятиям или ТЭЦ, а риска заболеваний — промышленно-энергетическим предприятиям и автотранспорту при равном их вкладе либо с преобладанием роли первых [Прусаков В.М., Вержбицкая Э.А. и др., 2009]. На основании исследований, проведенных НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН установлена связь между показателями суммарного загрязнения атмосферного воздуха и заболеваниями аллергического характера у детей, проживающих на различных территориях Москвы. Было отмечено, что процент детей, часто болеющих ОРЗ, также наиболее высок в загрязненных района (7,8%) по сравнению с менее загрязненными (1,2%), т. е. изменения микробиоценоза в организме человека однозначно связаны с экологическими изменениями. Сосредоточение крупных экологически опасных промышленных производств, использование отсталых технологий, отсутствие эффективного очистного оборудования привели к тому, что на территории области возникли города с неблагоприятной экологической обстановкой. Загрязнение городов Иркутской области связано с выбросами предприятий теплоэнергетики,
Особенности интестинальных микробиоценозов у детей Ангарска
Микробный спектр образцов фекалий детей дошкольного возраста характеризовался доминирующим положением анаэробных микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл), из аэробных — превалировали эшерихии, выделяемые в 100% случаев. Причем E.coli непатогенная, т.н. полноценная, или нормальная кишечная палочка (НКП) присутствовала не у всех детей, а только у 80,8% из них (табл. 3.3.1.1). Таким образом, каждый 5-й ребенок не имел в составе кишечной микробиоты полноценной кишечной палочки. Среднее содержание бифидобактерий в кишечном биоценозе дошкольников составляло 8,8±0,4 lg КОЕ/г, что сопоставимо с нижним пределом показателей физиологической нормы [ОСТ 91500.11.0004-2003 Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника»]. Среднее содержание лактобацилл у этих детей составляло 8,4±0,7 lg КОЕ/г, и этот показатель был достаточно высоким при сравнении с тем же стандартом. Среди эшерихий, определяемых как ЬЖП, но имеющих фенотипы с биохимическими отклонениями, т.е. с аномальными свойствами, преобладали формы ЬЖП со сниженной ферментативной активностью (28,0±8,9%). По рейтингу встречаемости условно-патогенной микрофлоры (УПМ) в кишечном биоценозе на первом месте определялись микроорганизмы из семейства Enterobacteriaceae (суммарно: Kledsiella spp., Citrobacter spp.) — 36,0±9,5%; вторую рейтинговую группу представляли Clostridium spp. -12,0±б,4% (табл. 3.3.1.2).
У дошкольников пока редко (8,0±4,9%), но в диагностически значимых концентрациях выделялись патогенные грибы рода Candida (5 lg КОЕ/г). 3.3.2. Микробиоценоз толстого кишечника у детей школьного возраста Спектр и коэффициенты постоянства облигатных микроорганизмов кишечного биоценоза детей более старшего возраста, школьников, повторяли параметры дошкольников. Отличия касались количественного содержания микроорганизмов в 1г. фекалий. Среднее содержание бифидобактерий и лактобацилл, основных симбионтов кишечного биоценоза, у этих детей было значительно ниже общефизиологических нормативов (ОСТ, 2003). Для бифидобактерий этот показатель составил 6,61± 1,47 lg КОЕ/г (норма - 9-11 lg КОЕ/г), для лактобацилл - 5,19±0,4 lg КОЕ/г (норма - 6-8 lg КОЕ/г). У всех детей в значительных концентрациях (7,1± 0,9 lg КОЕ/г), вытесняя НКП, регистрировалась E.coli с утратой биохимической активности по отношению к лактозе (лактозонегативные эшерихии и варианты со сниженной ферментативной активностью) (табл. 33.2.1). Candida у них увеличилось в 2 раза (16,1±6,7% случаев) по сравнению с младшей группой (8,0±4,9% случаев). По рейтингу встречаемости видов УПМ на 1-м месте у школьников определялись клостридии (38,7±8,8%), затем следовали энтерококки (29,0±8,14%). Таким образом, резюмируя вышесказанное, можно сделать следующие выводы: 1. у школьников сменилась архитектоника видов УПМ в кишечнике по сравнению с дошкольниками (у школьников доминирующим видом стали клостридии, у младших детей - энтеробактерии); 2. у школьников по сравнению с дошкольниками в 2 раза вырос контингент носителей патогенных грибов рода Candida, выделяемых в диагностически значимых количествах (5 lg КОЕ/г), что является отражением пониженной иммунорезистентности организма [Бухарин О.В. и др., 2002; Бойков С.С. и др. 2005] (табл. 3.3.2.2, рис. 3.3.2.1).
Далее приведен «популяционный» анализ возрастных изменений микроэкологических показателей кишечного биоценоза у детей Ангарска (табл.3.3.2.3). Обследованные лица разбивались на группы с нормальными показателями либо с отклонениями от нормы. За норму принимались общефизиологические стандарты. При анализе полученных результатов бактериологического исследования на дисбиоз кишечника в первую очередь было обращено внимание на содержание бифидобактерий и лактобацилл как основных симбионтов кишечной микробиоты. У 18 дошкольников, что составило почти 70%, уровень бифидобактерий был в пределах нормы. На нижней границе нормы этот показатель был у 26,92% детей этой возрастной группы, и только у одного ребёнка отмечена концентрация бифидобактерий ниже нормы. В отношении лактобацилл у детей просматривалась более устойчивая ситуация: у всех обследованных детей дошкольного возраста концентрация данного микроба-симбионта была высокой, составляя 8 lg КОЕ/г. Однако у детей более старшего возраста (школьников) отмечались изменения микроэкологических показателей в сторону снижения содержания микроорганизмов относительно нормативных. Так, у обследованных школьников в 10 раз снизилась доля лиц с физиологическим уровнем бифидобактерий (6,4 ±4,4%) по сравнению с дошкольниками (69,23±9,0%), а содержание лактобацилл было либо ниже общефизиологической нормы (80,6±7,1% лиц), либо на нижней границе нормы (19,3±7,09% лиц) (рис. 3.3.2.2).
Немаловажную роль в возникновении устойчивого дисбиоза кишечника играет появление атипичных форм кишечной палочки: со слабыми ферментативными свойствами, лактозонегативной, гемолизирующей. В случаях, когда количественное содержание бифидобактерий и лактобацилл в норме, но при этом выделенные изоляты E.coli в 100% случаев являются слабоферментирующими или неферментирующими лактозу, то клинические проявления дисбиоза более глубокие [Попкова СМ., 1999]. Так, у обследованных нами детей-дошкольников только в 2-х случаях была идентифицирована лактозонегативная кишечная палочка. У школьников же процент таких проб увеличился в 8 раз, до 61,29 % случаев. Следует особо отметить, что во всех выявленных случаях титр этого вида кишечной палочки был высоким и составлял 8 lg КОЕ/г. Также было установлено, что среди школьников у 41, 9% детей титры типичной кишечной палочки были ниже нормы и составляли всего 5 lg КОЕ/г. Таким образом, принимая во внимание как содержание доминирующих в кишечнике индигенных анаэробных микроорганизмов, бифидобактерий и лактобацилл, так и возрастную динамику появлений атипичных форм кишечного симбионта - НКП, можно с уверенностью констатировать, что у детей школьного возраста значительно чаще выявлялся микроэкологический дисбаланс в кишечном биоценозе (регистрируемый как дисбгюз I-I1 степени) по сравнению с дошкольниками, что косвенно свидетельствует о снижении у них с возрастом колонизационной резистентности. Особый интерес представлял параллельный формализованный (балльный) анализ микробной экологии кишечной микробиоты у детей в изучаемых группах. В рейтинговой оценке использовались следующие критерии: «0» -физиологическое, или нормальное, содержание бифидобактерий, лактобактерий, нормальной кишечной палочки, отсутствие ее атипичных и гемолизирующих форм; «1» - дефицит симбионтых микроорганизмов, наличие лактозонегативной, гемолизирующей кишечной палочки и других УПМ.
Региональные ориентиры количественного содержания основных аутохтонных микроорганизмов в кишечной микробиоте детей Иркутской области
Анализ полученных данных по количественному содержанию основных индигенных микроорганизмов в кишечной микробиоте детей, проживающих на территории Иркутской области позволил выявить общую закономерность: тенденцию к снижению и достоверное снижение относительно нормативов (ОСТ, 2003), плотности аутохтонных микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл, нормальных эшерихий), что можно рассматривать как региональную характеристику кишечного биоценоза детского населения области, т.к. выявлена эта тенденция у здоровых детей. Этот факт выявляет необходимость региональной корректировки нормативов количественного содержания в кишечнике здоровых детей основных симбионтных микроорганизмов.
Оригинальные исследования, выполненные на небольших выборках, позволяют нам предложить региональные ориентиры по содержанию в кишечном биоценозе детей основных микробов-симбионтов, к которым в современных условиях можно относиться как к определенным физиологическим показателям нормы. Несмотря на то, что, в практике, обычно .отталкиваются от общефизиологических нормативов отраслевого стандарта (ОСТ, 2003), в современной научной литературе уже имеется достаточно данных по их региональной корректировке (Леванова Л.А., 2003; Крамарь Л.В., 2001). По этой причине на основании результатов проведённых исследований нами были определены региональные ориентиры количественного содержания основных групп резидентных (базисных) микроорганизмов в кишечной микробиоте детей, проживающих в городах Иркутской области (рис.3.6.1). Как видно из схемы, изменилась форма ранжирования титров аутохтонных облигатных и факультативных анаэробов относительно показателей ОСТ, 2003 г. и данных по другим крупным промышленным городам России (С-Петербург, Москва, Кемерово). Зафиксировано смещение диапазона количественных
Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), является первичной мишенью любых попадающих в него с пищей или водой соединений, которые прямо или косвенно влияют на формирование и функционирование ассоциаций микроорганизмов. Если по своей интенсивности такое влияние превышает компенсаторные возможности экологической системы «макроорганизм - и его нормальная микрофлора», то возникают микроэкологические или, иначе — дисбиотические нарушения, которые нередко являются пусковым механизмом развития, а в дальнейшем, и поддержания различных патологических состояний [Sekirov I., 2009; Martinez М., 2009; Morowitz J., 2010]. Дисбиотические нарушения в пищеварительном тракте проявляются изменением абсолютного числа анаэробных и аэробных бактерий, их видового и штаммового состава, ареала обитания микроорганизмов, состава и количества образуемых метаболитов. Реакции органов и тканей человека на дисбиотические изменения весьма разнообразны как по времени возникновения, так и по степени выраженности, что зависит от направления сдвигов в микробиоте, глубины отклонения от состояния динамического равновесия и от наличия благоприятных условий для возвращения в исходное состояние. При этом спектр клинических проявлений дисбиоза пищеварительного тракта достаточно широк: диареи, запоры, колиты, язвенная болезнь, гиперхолестеринемия, мочекаменная болезнь, различные аллергические проявления. Причиной широкого распространения дисбиозов являются как социальные факторы, так и ухудшение экологической обстановки, влияющей на состояние коллективной резистентности населения [Иноземцева Л.О., Леверьева М.И., 2000; Захарченко М.П., 2003].
Особенно сильно давлению неблагоприятных факторов среды подвержены дети в силу того, что у них еще недостаточно развиты эволюционно закрепленные формы адаптационной деятельности [Попкова СМ., 1999, 2004]. В связи с этим, оценка резистентности макроорганизма детей имеет существенное значение в системе биомониторинга. Бактериологические исследования на дисбиоз кишечника у детей гг. Иркутска и Ангарска проводили в двух возрастных группах I группа - от 1 месяца до года; II группа - от года до б лет. Все обследуемые дети имели клинику диспепсического синдрома или аллергические проявления (атопический дерматит, пищевая аллергия). Процент лиц с аллергическими реакциями с возрастом увеличивался: 1 мес - 1 г - 43,7%; 1-5 лет - 50,0%; старше 5 лет - 81,8%. Микробный спектр фекалий у детей с клиническими проявлениями дисбиоза, как и у здоровых лиц, характеризовался доминирующим положением анаэробных микроорганизмов, бифидобактерии и лактобацилл, и низким удельным весом аэробной составляющей микробиоты. Бифидобактерии и лактобациллы определялись в кишечнике детей, имеющих клинические проявления кишечного дисбиоза, в 100% случаев. Эшерихии регистрировались также у всех обследованных детей, являлись наиболее значимым видом из числа аэробных микроорганизмов (табл. 3.7.1, 3.7.2, 3.7.3). Это лишний раз подтверждает выводы исследователей о жесткой генетической подверженности индигенных бактерий, а транзиторных - наоборот - паратипической. Однако у детей г. Ангарска (табл. 3.7.2) в 100% случаев был отмечен дефицит доминанты кишечного микробиоценоза, бифидобактерии, содержание которых было ниже общефизиологических норм для этого возраста (109 - 1012 КОЕ/г). Аналогичный показатель по Иркутску составил 40,9%. При этом среднее содержание этих микроорганизмов как у детей Ангарска, так и Иркутска было на 2 - 3 порядка ниже нормы, а у детей из Ангарска - достоверно ниже, чем у детей г. Иркутска (lg КОЕ/г = 6,3±0,10 в г. Ангарске и lg КОЕ/г =7,64±0,10 в Иркутске, р 0,01) (табл. 3.7.1; 3.7.2).
