Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Дрожжи - потенциальные продуценты липидов для пищевых целей.
1. Использование микробных липидов для пищевых целей . II
2. Незаменимые жирные кислоты, их роль в сбалансированности рационов питания 13
3. Пути метаболизма полиеновых жирных кислот в животных клетках 17
4. Выбор потенциальных продуцентов липидов для пищевых целей 22
5. Этанол, как субстрат для получения пищевых липидов 26
6. Биохимия липидообразования у микроорганизмов ... 27
ГЛАВА 2. Регуляция синтеза липидов у дрожжей в условиях непрерывного культивирования.
1. Применение непрерывного культивирования для получения микробных липидов 32
2. Условия, благоприятные для синтеза липидов .... 35
3. Влияние фазы роста и скорости роста культуры ... 37
4. Влияние рН среды 41
5. Влияние температуры 42
ГЛАВА 3. Представление о материально-энергетическом балансе роста микроорганизмов 46
1. Объекты исследования 54
2. Методы поддержания культур, посевной материал . . 54
3. Методы культивирования 55
4. Состав и приготовление питательных сред 57
5. Методы анализов биомассы и культуральной жидкости . 58
6. Математическая обработка экспериментальных данных . 63 Результаты и их обсуждение.
ГЛАВА I. Физиолого-биохимические особенности дрожжей -
продуцентов липидов 65
1.1. Состав биомассы штаммов дрожжей, интенсивно синтезирущих липиды 65
1.2. Физиологические характеристики эффективности роста и липидообразования у дрожжей ........ 77
ГЛАВА 2. Закономерности в соотношении компонентов биомассы дрожжей.
2.1. Соотношение между азотсодержащими компонентами биомассы 85
2.2. Корреляция между элементным составом и содержанием липидов в биомассе дрожжей 90
ГЛАВА 3. Влияние условий культивирования на синтез липидов и физиологические характеристики дрожжей-продуцентов липидов.
3.1. Синтез липидов в динамике роста периодических культур 99
3.2. Влияние удельной скорости роста на синтез липидов и физиологические характеристики роста дрожжей 119
3.3. Влияние рН среды на синтез липидов и физиологические характеристики роста и липидообразования дрожжей 134
3.4. Влияние температуры на синтез липидов и физиологические характеристики роста и липидообразования дрожжей 142
3.5. Влияние концентрации железа в среде на синтез липидов дрожжами 151
ГЛАВА 4. Синтез липидов дрожжами при двухстадийном методе культивирования 159
Заключение 169
Выводы 174
Использованные сокращения и обозначения 176
Литература 178
- Использование микробных липидов для пищевых целей
- Применение непрерывного культивирования для получения микробных липидов
- Методы поддержания культур, посевной материал
- Состав биомассы штаммов дрожжей, интенсивно синтезирущих липиды
- Синтез липидов в динамике роста периодических культур
Использование микробных липидов для пищевых целей
Использование микробных липидов для пищевых целей. В настоящее время в мире производится около 50 млн. тонн жиров ежегодно (не считая сливочного масла и молочных продуктов), причем 80% из них - для пищи человека. Остальные жиры используются в химической промышленности для производства мыла, детергентов, красителей, смазочных веществ, алкидных и эпоксидных смол, типографской краски и т.д. Необходимо отметить, что мировое потребление жиров постоянно растет: в 1971 г. оно составляло 11,4 кг пищевого жира на человека в год, в 1975 г. - 12,3 кг, а в 1979 г. - уже 13,7 кг (Ratledge, 1982).
Если учесть, что примерно 70% масел, производимых в мире (табл.1), получают из растительного сырья (остальное количество из животных и рыб), то становится понятной неустойчивость и непредсказуемость цен на эти масла. Урожаи масличных растений зависят от многих факторов, главным из которых являются погодные условия. Спрос на масла возрастает быстрее, чем их производство; этим объясняется то, что цены на основные растительные масла на мировом рынке за 8 лет (1969-1977) увеличились более, чем в 4 раза ( Ratledge, 1978). Все вышесказанное объясняет повышенный интерес к процессу получения липидов с помощью микроорганизмов. Во-первых, триацилглицерины микробного происхождения могут быть добавлены в съедобные жиры (кулинарный жир, маргарин, салатное масло); во-вторых, они могут использоваться для производства различных изделий химической промышленности, высвободив, таким образом, большое количество растительных масел для пищевых нужд
Применение непрерывного культивирования для получения микробных липидов
Применение непрерывного культивирования для получения микробных липидов. В настоящее время не вызывает сомнения факт, что метод непрерывного культивирования микроорганизмов является наиболее перспективным как в области теоретических лабораторных исследований, так и в практическом применении. С его использованием стало возможным более глубокое исследование физиологии микроорганизмов, в частности, изучение влияния внешних факторов на биохимические, морфологические и, главным образом, физиологические особенности организма (Малек, 1968; Работнова, Позмогова, 1979). Недостаточная разработка этих вопросов объясняется тем, что долгое время не существовало такого способа культивирования, который позволил бы изучать действие каждого фактора в отдельности. Это стало возможным после того, как были разработаны основные методы непрерывного культивирования. Фундаментальное значение хемостата стало очевидным лишь в 50-х годах, после того, как одновременно и независимо друг от друга Моно во Франции ( Monod, 1950) и Новиком и Сцилардом в Америке ( Novick, Szilard, 1950) была создана основная теория хемостата. Метод хемостатного культивирования имеет несомненные преимущества перед периодическим процессом, поскольку, во-первых, позволяет вести процесс при фиксированной скорости роста, дифференцируя таким образом, влияние изменений окружающей среды от влияния изменений скорости роста. Во-вторых, поддержание одинаковых условий в течение долгого времени позволяет получать биомассу неизменного состава. В-третьих, метод хемостатного культивирования позволяет исследовать влияние природы лимитирующего фактора.
Развитие хемостатного метода привело к созданию турбидос-тата, позволяющего исследовать культуру при скорости роста, близкой к максимальной ( Bryson» 1952, цит.по: Перт, 1978). В турбидостате задается определенный уровень плотности биомассы, а скорость подачи среды сама подстраивается под стационарное значение (Перт, 1978). Турбидостат применяется как средство для поддержания культуры в течение многих генераций при избытке субстрата и постоянных условиях среды. Позднее была разработана разновидность турбидостата - рН-стат (Печуркин и др., 1969) или рН-ауксостат (Martin, Hempflin, 1976). В отличие от турбидостата, скорость протока среды в рН-ауксостате регулируется изменением рН среды, т.е. в качестве первичного датчика вместо датчика оптической плотности выступает датчик рН ( аихо " от греч. аизсеіп "-расти, " stat "-постоянный). рН-ауксостат имеет ряд преимуществ перед турбидостатом, наиболее важным из которых является то, что для рН-ауксостата мутность и дисперсность среды не имеет значения, тогда как турбидостат требует для своего применения оптически прозрачных сред.
Методы поддержания культур, посевной материал
В работе использовали 20 штаммов дрожжей из коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР: Lipomyces lipofer ИБФМ y-28I, Lipomyces lipofer ИБФМ у-693, Lipomyces starkeyi ИБФМ у-282, Lipomyces starkeyi ИБФМ У-694, Lipomyces starkeyi ИБФМ у-692, Zygolipomyces lactosus ИБФМ у-695, Cryptoeoccus albidus var. aerius ИБФМ y-229, Cryptococcus albidus var. aerius БКМ - 1994, Cryptococcus albidus var. albidus ИБФМ y-706, Cryptococcus albidus ИБФМ y-4I5, Torulopsis kestoniiHEM y-901, Torulopsis v/ickerhamii ИБЗМ y-910, Trichosporon pul-lulans ИБФМ y-757, Trichosporon pullulans ИБФМ y-84I, Trichosporon fermentans ИБФМ y-48I, Trichosporon serice-um ИБФМ У-486, Endomyces magnusii ИБФМ У-26І, Endomyces geotrichum ИБФМ y-2I0, Candida methylica ИБФМ y-670, Cryptococcus albidus ИБФМ y-7I5.
Они были отобраны из дрожжей, способных к росту на среде с этиловым спиртом; качественную оценку содержания липидов в клетках проводили при помощи лкминисцентной микроскопии, прижизненным окрашиванием клеток флуорохромом - нильским голубым сульфатом (Константинова-Шлезингер, 1961; Пирс, 1962).
В результате исследований, на основании данных об эффективности липидообразования и синтезе незаменимой линолевой кислоты, основными объектами для дальнейших экспериментов были отобраны штаммы Cryptococcus albidus var. aerius ИБФМ y-229 и Trichosporon pullulans ИБФМ y-757. Методы поддержания культур, посевной материал.
В лабораторных условиях культуры хранили на косяках сусло-агара при температуре + 5С. Посевной материал получали при выращивании штаммов дрожжей на сусло-агаре в матрацах при + 20С. Для засева ферментера использовали трехсуточную культуру. Методы культивитювания. I. Периодическое культивирование.
С целью исследования биохимического состава биомассы и физиологических характеристик роста штаммы дрожжей выращивали в периодическом режиме в ферментере АНКУМ-2М на минеральной среде НЕ (Ерошин и др., 1976). Рабочий объем ферментера 5,0 л. Для создания условий лимитирования роста азотом содержание NH ci в среде было уменьшено в 2 раза. В среду добавляли 0,5 об$ этилового спирта-ректификата. При достижении остаточной концентрации этилового спирта в среде 0,1-0,15$ в ферментер вносили дополнительные дозы этанола в количестве 0,5 об%. В расчетах испарение этанола не учитывали, считая его одинаковым во всех опытах, поскольку время культивирования дрожжей было примерно равным.
Значение рН среды поддерживали равным 5,0 ± 0,1 автоматической подтитровкой 1% раствором NaOH. Температуру устанавливали оптимальной для каждого вида дрожжей. Парциальное давление кислорода в среде (р02) поддерживали на уровне 40-60$ от насыщения. Для пеногашения использовали силиконовый пеногаситель М-30 ("Serva" ).
Культивирование проводили до середины стационарной фазы; для определения фазы роста культуры оптическую плотность измеряли на ФЭК-56 (длина волны 580 нм, размер кюветы 5 мм) каждые 2 часа. Контроль изменения концентрации биомассы во время культивирования в ферментере осуществляли встроенным датчиком оптической плотности (Д0П), работающим с двухмиллиметровой измерительной кюветой.
Состав биомассы штаммов дрожжей, интенсивно синтезирущих липиды
С целью исследования биохимического состава биомассы, а также физиологических характеристик роста и липидообразования, отобранные штаммы культивировали в периодических условиях в ферментере. Необходимо отметить, что в целом у штаммов дрожжей-продуцентов липидов наблюдается более низкая удельная скорость роста (табл.4) по сравнению с "белковыми" штаммами дрожжей (максимальная удельная скорость роста "белковых" дрожжей рода Candida составляла 0,27-0,45 час""І)(Мутафов, 1983).
Установлено, ЧТО у представителей РОДОВ bipomyces И Cryptococcus содержание липидов наиболее высоко и достигает 2/3 от веса абсолютно сухой биомассы (табл.4, рис.3). Меньше липидов (19-35$) синтезируют дрожжи, относящиеся К родам Trichosporon, Endomyces, Torulopsis, Candida.
Существует мнение, что между содержанием липидов и белка у микроорганизмов существует обратнопропорниональная зависимость.
Высказывается предположение, что повышенный синтез липидов связан с блокированием ферментных систем, ответственных за синтез аминокислот (Залашко, 1971).
При сравнении данных о содержании липидов и белка у культур, интенсивно синтезирующих липиды (табл.4), и "белковых" штаммов (Ерошин и др., 1974; Дедюхина и др., 1978; Чистякова и др., 1980) можно видеть, что значительное количество липидов (30-60$) накапливают только те штаммы дрожжей, содержание белка в которых составляет 10-20$ от веса абсолютно сухой биомассы (рис.4). При большем количестве белка доля липидов в клетках резко снижается (в 5-6 раз). Обращает на себя внимание тот факт, что штаммы с содержанием белка менее 10$ характеризуются слабым образованием липидов. Возможно, это обусловлено накоплением в клетках значительных запасов углеводов, как альтернативных ли-пидам резервов энергетического материала.
Проведенные нами исследования показали, что в отличие от "белковых" штаммов дрожжей, содержащих 3-9$ нуклеиновых кислот (Чистякова и др., 1980; 1981; 1982; Ерошин и др., 1974), дрожжи-продуценты липидов содержат мало нуклеиновых кислот (от 0,7 до 3,8$ от веса абсолютно сухой биомассы (табл.4).
В экспериментах С Aerobacter aerogenes (Dicks, Tempest, 1966) было обнаружено, что молярная стехиометрия между содержанием магния, калия, РЖ и фосфора в клетках остается постоянной независимо от скорости роста культуры. Это соотношение составляло I : 4 : 5 : 8. Авторы предположили, что постоянство этого соотношения объясняется участием калия, магния и фосфора в поддержании функционального состояния рибосом. Наши исследования с дрожжами, интенсивно синтезирующими липиды, показали (табл.5), что содержание магния составляет 0,04-0,26$, калия - 0,23-2,86$, фосфора - 0,27-2,51$ от веса абсолютно сухой биомассы.
Синтез липидов в динамике роста периодических культур
Имеющиеся в литературе данные о влиянии фазы роста культуры на количество и жирнокислотный состав внутриклеточных липидов довольно противоречивы. Большинство авторов считает, что биосинтез липидов при периодическом культивировании микроорганизмов является, как правило, двухфазным процессом (Залашко, 1971; Thorpe, Ratledge, 1972; Дедюхина, Ерошин, 1984). В период активного роста синтезируются липиды, играющие функциональную роль (регулирующие проницаемость цитоплазматических мембран, активность ферментных систем и т.д.). Интенсивное образование резервных липидов происходит после окончания активного роста культуры, в период стационарной фазы.
Вместе с тем, как отмечалось в обзоре литературы, есть сообщения о том, что фаза роста практически не влияет на содержание и жирнокислотный состав липидов у ряда штаммов Candida uti-lis ( Hossack et al., 1979); эксперименты с другими штаммами Candida utiiis показали, что вступление культуры в стационарную фазу приводит к быстрому уменьшению содержания общих липидов (Dawson, Graig, 1966).
По всей вероятности, существующие противоречия объясняются тем, что в опытах были использованы физиологически различные группы дрожжей, различающиеся интенсивностью синтеза липидов. Что касается истинных продуцентов липидов, то существует мнение ( Pedersen, 1961; Залашко, 1971; Ratledge, 1978; Грачева и др., 1980), ЧТО дрожжи Gryptococcus terricolus (syn. Cryptococcus aibidus ) занимают особое место среди высокоактивных продуцентов липидов. Их особенностью является способность синтезировать запасные липиды (до 70$ от веса АСБ) в период активного роста. Совершенно очевидно, что в случае подтверждения этой уникальной особенности, дрожжи этого вида можно было бы считать наиболее перспективными продуцентами липидов в условиях непрерывного культивирования.
Учитывая вышесказанное, представляло интерес провести детальное исследование динамики синтеза липидов в процессе роста дрожжей, интенсивно образующих липиды. Для исследования состава биомассы и эффективности образования биомассы и липидов в динамике роста были использованы отселекционированные нами "липидные" штаммы Cryptococcus aibidus var. aerius ИБШ y-229 и Tricho-sporon puiiuians ИБЙЛ y-757. Кривые роста дрожжей представлены на рис.13, стрелками отмечено время отбора проб для анализа.
