Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 7
1.1. Кровь и кроветворение у рыб . 7
1.2. Тяжелые металлы в организме рыб 15
1.3. Объекты исследования 25
ГЛАВА 2. Краткий физико-географический очерк водоёмов 30
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 49
3.1. Общий анализ крови 50
3.2. Подготовка проб для определения содержания тяжелых металлов 53
ГЛАВА 4. Результаты исследований 56
4.1. Морфобиологическая характеристика изученных рыб . 56
4.1.1. Возраст и размеры рыб в пробах . 56
4.1.2. Меристические и пластические признаки 62
4.2. Состав крови исследованных видов рыб в разнотипных водоёмах . 70
4.2.1. Пескарь . 70
4.2.2. Окунь . 80
4.2.3. Ротан 92
4.3. Содержание тяжелых металлов в грунте и воде исследованных водоёмов . 99
4.4. Тяжелые металлы в изученных объектах . 105
4.4.1. Пескарь . 105
4.4.2. Окунь . 129
4.4.3. Ротан . 152
Обсуждение результатов 167
Выводы 178
Список литературы
- Тяжелые металлы в организме рыб
- Объекты исследования
- Подготовка проб для определения содержания тяжелых металлов
- Состав крови исследованных видов рыб в разнотипных водоёмах
Тяжелые металлы в организме рыб
Тяжелые металлы относятся к приоритетным загрязняющим веществам, наблюдения за которыми в настоящее время во всём мире, особенно в промышленно развитых странах, обязательны во всех средах в рамках общеэкологического мониторинга (Алябина и др., 1983; Израэль, 1984; Некрасов и др. 1989; Мартин, 1993 и др).
Термин тяжелые металлы, характеризующий широкую группу загрязняющих веществ, получил в последнее время значительное распространение. На сегодняшний день к тяжёлым металлам относят более 40 металлов периодической системы Д. И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц: V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, Cd, Sn, Hg, Pb, Bi и др. При этом немаловажную роль в категорировании тяжелых металлов играют следующие условия: их высокая токсичность для живых организмов в относительно низких концентрациях, а также способность к биоаккумуляции и биомагнификации. Практически все металлы, попадающее под это определение (за исключением свинца, ртути, кадмия и висмута, биологическая роль которых на настоящий момент не ясна), активно участвуют в биологических процессах, входят в состав многих ферментов. По классификации Н. Реймерса, тяжелыми следует считать металлы с плотностью более 8 г/см3. Таким образом, к тяжелым металлам относятся Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg (Вредные химические вещества, 1989).
Источниками загрязнения вод тяжелыми металлами служат сточные воды гальванических цехов, предприятий горнодобывающей, чёрной, и цветной металлургии, машиностроительных заводов. Тяжелые металлы входят в состав удобрений, пестицидов и могут попадать в водоёмы вместе со стоком с сельскохозяйственных угодий. Однако повышение концентрации тяжёлых металлов в природных водах часто связано с другими видами загрязнения, например, с закислением. Выпадение кислотных осадков способствует снижению значения pH и переходу металлов из сорбированного на минеральных и органических веществах состояния в свободное (Мур, Рамамурти, 1987).
Интерес, проявляемый исследователями к тяжелым металлам при изучении водных экосистем, не случаен. С одной стороны, многие соединения этих металлов оказывают на гидробионтов положительное воздействие, являясь катализаторами протекающих в их организмах биохимических процессов (Воробьев, 1979). С другой, эти же соединения, но в других ситуациях (более высоких концентрациях, иных абиотических условиях и физиологическом состоянии организмов) оказывают на гидробионтов отрицательное влияние, которое проявляется в нарушении гомеостаза на всех уровнях – от молекулярного до организменного (Гольдин, 1978; Алабастер, Ллойд, 1984; Линник, Набиванец, 1986; Никаноров, Жулидов, 1991; Эйхенбергер, 1993). При интоксикации металлами прежде всего страдают ферментативные механизмы, нарушение которых ведет к патологическим сдвигам, что вызывает нарушения функциональных механизмов клеток и целостных физиологических систем организма (Ларский, 1990).
Антропогенные пути поступления и биологическая роль некоторых тяжелых металлов: Хром. В поверхностные воды соединения трех- и шестивалентного хрома попадают в результате выщелачивания из пород (хромит, крокоит, уваровит и др.). Некоторые количества поступают в процессе разложения организмов и растений, из почв. Значительные количества могут поступать в водоемы со сточными водами гальванических цехов, красильных цехов текстильных предприятий, кожевенных заводов и предприятий химической промышленности. В речных незагрязненных и слабозагрязненных водах содержание хрома колеблется от нескольких десятых долей микрограмма в литре до нескольких микрограммов в литре, в загрязненных водоемах оно достигает нескольких десятков и сотен микрограммов в литре. (Мур, Рамамурти, 1987).
Токсичное действие металла зависит от валентности: шестивалентный катион гораздо токсичнее трехвалентного. В организме животных общетоксикологическое, нефротоксическое и гепатотоксическое действие оказывает Cr6+. Токсичность хрома выражается в изменении иммунологической реакции организма, снижении репаративных процессов в клетках, ингибировании ферментов, поражении печени, нарушении процессов биологического окисления, в частности цикла трикарбоновых кислот. Кроме того, избыток металла вызывает специфические поражения кожи (дерматиты, язвы), изъявления слизистой оболочки носа, пневмосклероз, язву желудка и двенадцатиперстной кишки, хромовый гепатоз, нарушения регуляции сосудистого тонуса и сердечной деятельности. Соединения Cr6+, наряду с общетоксикологическим действием, способны вызывать мутагенный и канцерогенный эффекты. Хром интенсивно накапливается в печени, почках, селезенке, костях и костном мозге (Краснокутская и др., 1990).
Медь. Основным источником поступления меди в природные воды являются сточные воды предприятий химической, металлургической промышленности, шахтные воды, альдегидные реагенты, используемые для уничтожения водорослей. Медь может появляться в результате коррозии медных трубопроводов и других сооружений, используемых в системах водоснабжения. В подземных водах содержание меди обусловлено взаимодействием воды с горными породами, содержащими ее (Мур, Рамамурти, 1987).
Объекты исследования
Кровь брали из хвостовой артерии с помощью инсулинового шприца, согласно методике В.В Метелева (1965) не позднее чем через 15-20 секунд после извлечения рыбы из воды.
Для подсчета форменных элементов использовалась методика, описанная в трудах Н.Т. Ивановой (1983).
Взятие крови на эритроциты: в пробирку отмеривали 4 мл разводящей жидкости - 3%-ый NaCl (физраствор). В разводящую жидкость вносили капилляром от гемометра Сали 0,02 мл крови. Тщательно перемешивали. Получали разведение в 200 раз.
Взятие крови на лейкоциты: в пробирку отмеривали 0,4 мл разводящей жидкости - 3-5% раствор уксусной кислоты. Пипеткой от гемометра Сали вносили 0,02 крови, тщательно перемешивали. Получали разведение в 20 раз.
Для подсчета эритроцитов и лейкоцитов использовали счетную камеру Горяева. Она представляет собой толстое прямоугольное стекло с двумя сетками, разграниченными поперечной бороздой. Сбоку сеток находятся прямоугольные пластинки, к которым притирается шлифованное стекло. Сетка Горяева состоит из 125 больших квадратов; 100 из них не расчерчены, пустые, а 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 маленьких. Глубина камеры 0,1 мм. Сторона малого квадрата 1/20 мм, таким образом, объем малого квадрата равен 1/4000 мм3.
Тщательно перемешивали содержание пробирок, вращая между ладонями, но не взбалтывая. Одну из сеток заполняли для подсчета лейкоцитов, другую – эритроцитов. После заполнения камеру оставляли на 1-2 минуты для оседания форменных элементов и приступали к подсчету. Подсчет производили при увеличении 15 8 с опущенным конденсором.
Эритроциты считали в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали, каждый из которых разделен на 16 маленьких. Количество эритроцитов в 1 мкл определяли по формуле: Х= а (количество эритроцитов, подсчитанных в сетке) 4000 (1/4000 - объем малого квадрата) 200 (степень разведения крови) / 80 (количество малых квадратов), или Х= а 10000.
Лейкоциты считали в 100 больших пустых квадратах. Количество лейкоцитов в 1 мкл считали по формуле: Х= а 4000 20 (разведение) / 1600 (количество малых квадратов), или Х= а 50. Приготовление, фиксация и окраска мазков крови.
Приготовление мазка крови. Взяв тщательно вымытое и обезжиренное стекло за короткие ребра, наносили каплю крови недалеко от края стекла. Впереди капли крови ставили под углом 450 шлифованное стекло и, подводя его к капле крови, давали ей растечься по ребру шлифованного стекла, затем быстрым движением вели его справа налево до тех пор, пока вся капля не была исчерпана. Она должна быть такой, чтобы весь мазок поместился на предметном стекле.
Правильно сделанный мазок не доходит до края предметного стекла на 1,0 - 1,5 см, имеет желтоватый цвет и заканчивается «метелочкой». Мазок сушили на воздухе. Все пометки делали на середине мазка простым карандашом.
В ходе исследований было сделано 352 мазка крови обыкновенного пескаря. Для фиксации и окраски использовали следующие реактивы: смесь Никифорова (спирт и эфир 1:1) и краску Романовского-Гимзе (азур I - 3,0 г, водорастворимый желтый эозин - 0,8 г, метиловый спирт - 250 мл, глицерин -250 мл).
Фиксация прикрепляет мазок к стеклу, вызывая коагуляцию белка и придает форменным элементам стойкость к воде, содержащейся в красках. Мазки складывали попарно мазками наружу и пинцетом опускали в стаканы с фиксирующей жидкостью на 30 сек. После этого пинцетом вынимали и сушили на воздухе.
Окраска. Клетки восприимчивы к анилиновым краскам. Ядро клетки, содержащее нуклеиновые кислоты, связывает основные краски, т.е. базофильно красится в фиолетовый цвет. Цитоплазма одних клеток оксифильна, другая 52 базофильна. Фиксированные мазки укладывали на мостик и заливали разведенной согласно титру краской. На один мазок расходуется 3 мл краски, ее наливают высоким слоем. Время окраски согласно титру, от 25 до 45 сек. После окраски мазки промывали водой и просушивали.
Для фиксации и предварительной окраски мазков крови окуня и ротана использовали раствор Лейшмана. При этом способе применяли краситель, получаемый растворением смеси азура I, метиленового синего и желтого водорастворимого эозина в количестве 0,2 г в 10 мл абсолютного метилового спирта. Продолжительность фиксации неразбавленным красителем 3-4 мин, а окраски с равным количеством воды 5-10 мин.
Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики (анализ средних и их отклонений). Для установления достоверности отличий средних значений между выборками в отношении указанных признаков, рассчитывали достоверность разности по t–критерию Стьюдента и сравнивали с табличными значениями данного критерия (при p 0,05) (Лакин, 1980). Анализ проводили с использованием программы Excel 7.0 for Windows (Microsoft).
Средние и их отклонения представлены в таблицах и на рисунках в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M+m). Фотографии клеток крови делали с помощью микроскопа Olympus BX 51 с системой визуализации изображений и программы Cell B.
Подготовка проб для определения содержания тяжелых металлов
Пескарь из Мотовилихинского пруда и р. Сылвы изучался 4 года. Как показали исследования, количественный состав лейкоцитов подвержен большей динамике, чем эритроцитарный. Количество эритроцитов зависит от сезона (особенно влияет температура), питания, возраста и ряда других параметров (Остроумова, 1957; Srivastava, 1968; Клец, Яхненко, 1975; Houston, Rupert, 1976 и др.), незначительные межгодовые колебания количества эритроцитов связаны с тем, что ежегодно исследовались одновозрастные особи в один и тот же период времени.
Вместе с тем известно, что под влиянием внешних и внутренних факторов состав периферической крови постоянно меняется. Чем стабильнее окружающая среда, тем эффективнее действуют структуры организма и устойчивее гематологические показатели (Велдре, 1958, 1959 и др.).
При исследовании лейкоцитарного состава у пескаря, обитающего в р.Сылве выявлено, что в основном колеблются относительные показатели, а у пескаря из Мотовилихинского пруда – абсолютные (прил. 1, 4). Поскольку исследования проводились синхронно, можно связать данный факт с тем, что Мотовилихинский пруд, находясь в черте города, испытывает значительное антропогенное влияние, среда обитания рыб менее стабильна в сравнении с р. Сылвой, и здесь особи подвержены большим стрессорным воздействиям.
При сравнении рыб из этих водоёмов оказывается, что количество эритроцитов достоверно ниже, количество лейкоцитов, наоборот, выше у пескаря из Мотовилихинского пруда в основном за счет моноцитов, эозинофилов, нейтрофилов и молодых форм клеток. Сходные тенденции отмечены и в литературных источниках по загрязненным водоёмам (Телль, 1970; Крылов, 1972 и др.), указывающих на усиление клеточного иммунитета у рыб, обитающих в наиболее «грязных» зонах, т.к. достоверно увеличено абсолютное количество незрелых форм клеток белой крови, а также моноцитов, вследствие физиологических нарушений.
Чтобы определить, являются ли данные отличия показателей крови следствием нормальной изменчивости вида или это связано с антропогенной нагрузкой (подобные изменения крови, а именно: лейкоцитоз и уменьшение количества эритроцитов характерны для 2-ой стадии токсикоза у рыб), мы провели исследования в 2008 г. на р. Бабке (с. Жилино) и Верхнезырянском водохранилище. Данные водоёмы близки по физико-географическим и гидробиологическим характеристикам к р. Сылве и Мотовилихинскому пруду. Мотовилихинский пруд, Верхнезырянское водохранилище и р. Бабка в районе села Жилино испытывают значительную антропогенную нагрузку, а участок р. Сылвы в пределах УНБ “Предуралье” начинается в 12 км выше г. Кунгур и имеет менее значительное загрязнение (Холстов, Вертгейм, 2008), поэтому р. Сылва выбрана нами в качестве контроля.
Соотношение форменных элементов крови пескаря, обитающего в Мотовилихинском пруду, Верхнезырянском водохранилище и р. Бабке достоверно отличается по большинству показателей от таковой у пескаря из р. Сылвы (табл. 17). Так, количество эритроцитов у изученных рыб из р. Сылвы достоверно выше, а количество лейкоцитов – ниже, в сравнении с параметрами пескаря из 3 загрязненных водоёмов (рис. 25). Сравнение эритроцитов разной степени дифференцированности выявило следующую картину: скорость эритропоэза выше у пескаря из Верхнезырянского водохранилища, Мотовилихинского пруда и р. Бабки. Это выражено в том, что количество незрелых форм эритроцитов достоверно выше, а зрелых, наоборот ниже (рис. 26), что скорее всего может являться следствием неблагоприятной обстановки водоёмов.
Наибольшее число лейкоцитов в крови пескаря из всех исследованных водоёмов составляют лимфоциты: 53% от клеток белой крови у пескаря из р. Сылвы, 42% – из Мотовилихинского пруда, 51% – из Верхнезырянского водохранилища и 48% – из р. Бабки. Абсолютное количество лейкоцитов ниже у пескаря из р. Сылвы, чем у пескаря из других водоёмов в основном за счет низкого количества клеток предшественников. В крови рыб из Мотовилихинского пруда содержание нейтрофилов и эозинофилов превышает подобные показатели пескаря, обитающего в р. Сылве. У пескаря из р. Бабки сходная картина наблюдается по лимфоцитам (рис. 27).
В 2012 г. на р. Бабке было взято две пробы: одна в районе с. Жилино (ниже с. Платошино) также, как в 2008 г., вторая выше с. Кукуштан. Несмотря на то, что обе пробы взяты из средней части р. Бабки и расстояние между точками сбора материала не превышает 7 км, при анализе гематологических показателей выявлены устойчивые достоверные отличия у пескаря из полученных проб. Так, у пескаря из р. Бабки выше с. Кукуштан количество эритроцитов достоверно выше, а количество лейкоцитов, наоборот, ниже в основном за счет клеток предшественников и моноцитов (прил. 7). Полученные данные могут быть следствием того, что на всем протяжении р. Бабки выше с. Кукуштан находятся отдельные дачные кооперативы, которые незначительно загрязняют реку. От с. Кукуштан и с. Платошино, наоборот, систематически попадает в воду достаточно большое количество органических веществ. Необходимо отметить увеличение количества эритроцитов (в основном за счет молодых форм) и лейкоцитов (в основном за счет клеток предшественников, нейтрофилов и эозинофилов) у пескаря из р. Бабки ниже с. Платошино в 2012 г. в сравнении с показателями крови пескаря, выловленного в 2008 г. (прил. 8-9).
Состав крови исследованных видов рыб в разнотипных водоёмах
В целом данный участок реки можно оценить как сильно загрязненный, воды которого не пригодны для хозяйственно-бытовых и промышленных целей (воды могут быть условно использованы только для орошения) (Двинских, Китаев, 2011). Главным фактором загрязнения вод Нытвенского пруда, р. Нытвы и ее притоков является сельскохозяйственное производство (применение химических удобрений и гербицидов, размещение животноводческих ферм в водоохраной зоне), на втором месте находятся бытовые и промышленные стоки (Воронов, Стенно, 1991). Промышленные предприятия г. Перми и г. Краснокамска служат источниками загрязнения Воткинского водохранилища тяжелыми металлами и нефтепродуктами (Материалы ежегодного сборника…, 2010).
Экологическая ситуация подтверждается гематологическими исследованиями: наибольшее количество эритроцитов характерно для окуня из р. Сылвы (2,10-2,42 млн/1 мкл) и окуня из Камского водохранилища (1,92 млн/1 мкл). У окуня из других водоёмов клеток красной крови достоверно меньше. Так, данный показатель для окуня из р. Мулянки составил от 1,20 до 1,45 млн/1 мкл, окуня из Мотовилихинского пруда – 1,74 млн/1 мкл, окуня из Нытвенского пруда – 1,54 млн/1 мкл, из верхней части Воткинского водохранилища – от 1,29 до 1,85 млн/1 мкл (в различные годы и сезоны) и из средней части Воткинского водохранилища – 1,77 млн/1 мкл. Обратная картина в отношении лейкоцитов: наименьшее количество клеток белой крови обнаружено у окуня из Камского водохранилища (98,4 тыс./1 мкл) и окуня из р. Сылвы (100,9 – 105,8 тыс./1 мкл). Для окуня из других водоёмов характерно следующее количество лейкоцитов: для окуня из р. Мулянки – от 151,1 до 164,0 тыс./1 мкл, окуня из Мотовилихинского пруда – 141,4 тыс./1 мкл, окуня из Нытвенского пруда – 146,5 тыс./1 мкл, из верхней части Воткинского водохранилища – от 120,1 до 147,8 тыс./1 мкл (в различные годы и сезоны) и из средней части Воткинского водохранилища – 132,0 тыс./1 мкл. При этом у окуня из загрязненных водоёмов достоверно выше количество клеток предшественников, моноцитов и нейтрофилов в сравнении с показателями периферической крови окуня из относительно чистых водоёмов.
При сезонном анализе гематологических показателей окуня из верхней части Воткинского водохранилища выявлено, что наибольшее количество лейкоцитов характерно для весенней пробы в основном за счет увеличения лимфоцитов и нейтрофилов. Основная функция этих клеток – защита организма от инфекций и от токсических воздействий, скорее всего, это связано с естественными сезонными изменениями в организме рыб (рыбы выходят из зимовки и начинают нагуливаться). Также в Воткинском водохранилище максимум биогенных веществ наблюдается в весенний, минимум – в летний период. Процентное содержание форменных элементов крови может меняться в зависимости от стадии зрелости гонад и функционального состояния рыб (Спановская, Ролдугина, 1978; Сухопарова, Дубинин, 1981; Шатуновский и др., 1996).
У ротана из озера в р-не г. Добрянки в сравнении с ротаном из озер в г. Перми количество эритроцитов и лейкоцитов достоверно ниже и составляет соответственно 1,42-1,58 млн/1 мкл и 112,4-126,8 тыс./1 мкл. Для ротана из водоёма в м-не Заостровка количество клеток красной крови колеблется в пределах от 1,70 до 2,00 млн/1 мкл, клеток белой крови – от 139,25 до 158.12 тыс./1 мкл. Количество эритроцитов у ротана из озера в м-не Закамск составило от 1,75 до 1,98 млн/1 мкл и лейкоцитов – от 155,12 до 168.12 тыс./1 мкл. В целом у ротана озер г. Перми выше скорость эритропоэза (большое количество молодых форм), также достоверно увеличено количество клеток предшественников, нейтрофилов и эозинофилов, что может являться следствием начальных стадий токсикоза и свидетельствовать о мобилизации защитных сил организма.
Необходимо отметить, что озёра в черте г. Перми подвержены антропогенному воздействию. Его оказывают садовые кооперативы, расположенные по берегам, автодороги, проходящая вдоль берега, также сильная рекреационная нагрузка (массовое купание летом, рыбалка). Озера, главным образом, загрязнены органическими веществами, замусорены бытовыми отходами (бутылки, пакеты, полиэтиленовые упаковки и т.д.) и строительным мусором (арматура, бетон, доски) (Бакланов, 2001). Озеро в р-не Пермской ГРЭС г. Добрянки находится на расстоянии 5 км от города и непосредственной антропогенной нагрузки не испытывает.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об усилении клеточного иммунитета у рыб, обитающих в загрязненных водоёмах, и могут являться следствием начальных стадий токсикозов, сопровождающихся мобилизацией резервных функций организма. Однако отсутствие патологичных форм клеток доказывает, что рыбы изученных водоёмов Пермского края в настоящее время справляются с неблагоприятными воздействиями окружающей среды, о чем также свидетельствует их большая численность и отсутствие отклонений в развитии у всех исследованных особей.
Одновременно в нашей работе мы пытались выяснить, связаны ли гематологические изменения с уровнем тяжелых металлов, как в водоёме, так и органах и тканях изученных рыб. Данная часть работы продиктована тем, что среди множества органических и неорганических веществ, загрязняющих окружающую среду, тяжелые металлы занимают особое место, т.к. не разлагаются, токсичны, способны включаться в пищевые цепи и обладают потенциальной способностью биоаккумулироваться во многих живых организмах (Яржомбек, 1991; Эйхенбергер, 1993; Кашулин, 1995; Sorensen, 1992 и др.).
