Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Сериновые протеиназы 11
1.1. Характеристика и классификация субтилизиноподобных протеиназ 12
1.2. Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл 13
1.3. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ 16
2. Функциональная роль внеклеточных протеиназ микроорганизмов 19
3. Особенности биосинтеза бактериальных протеиназ 23
4. Применение протеолитических ферментов 30
5. Бактериальные альдолазы 38
Экспериментальная часть 48
Материалы и методы 48
Результаты исследования 61
1. Подходы для повышения уровня продукции бактериальных протеиназ и альдолаз 61
1.1. Оптимизация питательных сред для эффективного синтеза протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 61
1.1.1. Динамика роста, биосинтеза сериновых протеиназ и спорообразования культур B.amyloliquefaciens и B.pumilus 61
1.1.2. Влияние пептона и неорганического фосфата на продукцию протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 64
1.1.3. Влияние солей аммония на биосинтез протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 69
1.1.4. Влияние белковых субстратов и дрожжевого экстракта на биосинтез протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 71
1.1.5. Влияние аминокислот на продукцию субтилизиноподобных протеиназ B.pumilus 73
1.1.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на продукцию субтилизиноподобных протеиназ B.pumilus 74
1.2. Получение рекомбинантных штаммов-продуцентов трансальдолазы B.subtilis и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S E.coli 76
2. Выделение и очистка сериновых протеиназ и альдолаз 82
2.1. Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз B.amyloliquefaciens и B.pumilus 82
2.2. Выделение и очистка трансальдолазы B.subtilisn фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S E.coli 85
3. Характеристика ферментов 85
3.1. Влияние ингибиторов на активность сериновых протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 85
3.2. Энзиматические свойства сериновых протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 88
3.3. Субстратная специфичность сериновых протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 96
3.4. Фибринолитическая, тромболитическая и антикоагулянтная
активность сериновых протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus 101
3.5. Способность субтилизиноподобных протеиназ B.amyloliquefaciens к ферментативному синтезу пептидных связей 103
3.6. Синтетическая активность трансальдолазы B.subtilis и фруктозо-6-фосфат-альдолазы Al 29S E.coli 106
Обсуждение результатов 111
Выводы 133
Благодарности 134
Литература 135
- Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл
- Функциональная роль внеклеточных протеиназ микроорганизмов
- Динамика роста, биосинтеза сериновых протеиназ и спорообразования культур B.amyloliquefaciens и B.pumilus
- Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз B.amyloliquefaciens и B.pumilus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ферментные препараты, обладающие высокой активностью и специфичностью, являются неотъемлемой частью современных биотехнологических процессов, обеспечивая их эффективность и экологическую безопасность. Альдолазы и протеиназы представляют собой уникальные биологические катализаторы, способные осуществлять реакции расщепления и синтеза молекул. Альдолазы - это эффективные инструменты для синтеза различных Сахаров - предшественников в получении ксилита, некоторых лекарственных, антифунгицидных препаратов и других соединений, используемых в промышленности. Среди альдолаз особый интерес представляют фруктозо-6-фосфат-альдолаза E.coli и трансальдолаза B.subtilis, способные использовать в синтезе различных кето-сахаров недорогой дигидроксиацетон, в отличие от других альдолаз, утилизирующих дорогостоящий фосфодигидроацетон (Schurmann et al., 2002). Одну из важнейших групп индустриальных ферментов представляют протеиназы микроорганизмов, широко используемые в различных областях промышленности, медицины и молекулярной биологии (Gupta et al., 2002; Rao et al., 1998). Интересна способность протеиназ к синтезу олигопептидов, поскольку направленный ферментативный синтез пептидной связи имеет ряд преимуществ перед химическим синтезом. Бактерии B-.amyloliquefaciens и B.pumilus являются известными продуцентами сериновых протеаз, в частности, субтилизиноподобных протеиназ, имеющих практическую ценность. Гены некоторых из них клонированы и секвенированы (Wells et al., 1983; Hung et al., 2003; Aoyama et al., 2000a; Pan and Huang, 2004). Однако недостаточно исследованы тромболитические, антикоагулянтные, пептидсинтетические свойства, а также закономерности биосинтеза внеклеточных протеиназ этих бацилл.
Практическая ценность альдолаз и протеиназ диктует необходимость получения высокоэффективных продуцентов этих ферментов. Различная локализация в клетке и особенности биосинтеза этих белков определяют выбор стратегии повышения продуктивности культур. Альдолазы - это внутриклеточные ферменты, синтезируемые клеткой в небольших
количествах, поэтому для препаративного получения этих белков предпочтительным является использование генно-инженерных методов. Уровень синтеза внеклеточных протеиназ сильно зависит от ряда факторов, в частности, от состава питательной среды, что позволяет значительно повысить выход ферментов за счет оптимизации условия биосинтеза.
Таким образом, перспективы применения протеиназ и альдолаз, в частности, в медицине и для синтеза соединений, используемых в промышленности, определяют актуальность поиска новых продуцентов этих ферментов.
Целью работы явилось выделение и характеристика внеклеточных протеиназ из природных штаммов B.amyloliquefaciens и B.pumilus и внутриклеточных альдолаз из рекомбинантных штаммов E.coli с использованием подходов, основанных на оптимизации условий биосинтеза ферментов и генно-инженерных модификациях продуцентов.
Основные задачи исследования:
Установить особенности биосинтеза внеклеточных сериновых протеиназ штаммами B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62 и получить высокий уровень продукции ферментов путем оптимизации состава питательных сред.
Получить рекомбинантные продуценты внутриклеточных ферментов: трансальдолазы Bacillus subtilis и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S Escherichia coli и исследовать экспрессию клонированных генов.
Выделить и очистить субтилизиноподобные протеиназы и глутамилэндопептидазы природных штаммов B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62, а также трансальдолазу и фруктозо-6-фосфат-альдолазу A129S из рекомбинантных штаммов E.coli.
Охарактеризовать энзиматические свойства, субстратную специфичность, а также тромболитическую, антикоагулянтную, фибринолитическую и пептидсинтетическую активность протеиназ.
Оценить эффективность синтетической активности трансальдолазы и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S в отношении синтеза Сахаров из различных субстратов.
Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобные протеиназы, секретируемые штаммами B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62. Определены условия для эффективного биосинтеза ферментов и разработаны питательные среды для получения протеиназ в препаративных количествах.
Впервые установлено, что субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus обладают тромболитическими и антикоагулянтными свойствами. Получены приоритетные данные о наличии тромболитической, фибринолитической, антикоагулянтной активности у глутамилэндопептидаз B.amyloliquefaciens.
Впервые показано, что фруктозо-6-фосфат-альдолаза с мутацией в активном центре A129S, выделенная из рекомбинантных клеток E.coli, способна эффективно катализировать реакцию образования ксилулозы из дигидроксиацетона и гликольальдегида.
Практическая значимость. Примененные в работе подходы по оптимизации состава питательной среды и клонированию генов альдолаз на векторах экспрессии позволили получить эффективные продуценты внеклеточных сериновых протеиназ и внутриклеточных альдолаз. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ, глутамилэндопептидаз и альдолаз увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и практических целях. Субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus обладают высокой тромболитической и антикоагулянтной активностью, что делает эти ферменты перспективными в качестве препаратов для лечения заболеваний, связанных с образованием тромбов. Субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens могут быть использованы в синтезе специфических хромогенных субстратов для протеолитических ферментов. Полученные из рекомбинантных штаммов E.coli трансальдолаза и фруктозо-6-фосфат-альдолаза A129S могут быть применены для синтеза ксилулозы,' являющейся предшественником в получении ксилита, широко применяющегося в промышленности.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ государственной регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182, АН РТ фонда НИОКР 03-3.10-295, 03-3.5-20, программой CRDF Rec 007, совместной программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/05/3903. Все исследования, представленные в работе, выполнены автором.
Положения, выносимые на защиту:
Оптимизация состава питательной среды культивирования обеспечивает высокий уровень продукции субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз у природных штаммов B.amyloliquefaciens и B.pumilus.
Использование технологии клонирования генов трансальдолазы B.subtilis на рЕТ 22 и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S E.coli на векторе pJFl 19ЕН позволяет получить продуценты с высоким уровнем синтеза ферментов.
Выделенные ферменты обладают практически значимыми свойствами: протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus - фибринолитической, тромболитической, антикоагулянтной активностью; субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens -пептидсинтетической активностью, трансальдолаза и фруктозо-6-фосфат- альдолаза - ксилулозо-синтетической.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003-2006 г.г.) и ежегодных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003-2005 г.г.), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004 г.), XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции,
применение», (Казань, 2005 г.), 79-ой Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2005 г.). V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005 г.), научном семинаре стипендиатов программы «Михаил Ломоносов» (Москва, 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.
Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл
Продуцентами субтилизиноподобных протеиназ являются представители многих эволюционных групп - вирусов, архебактерий, стрептомицетов, эубактерий, грибов, дрожжей, растений, насекомых и млекопитающих (Barret, Rawlings, 1995; Siezen, Leunissen, 1997; Руденская, 1994). Зрелые белки содержат до 1775 остатков, их N-концевые каталитические домены состоят из 268-511 остатков, сигнальные пептиды достигают в отдельных случаях 280 аминокислот. Большинство субтилаз синтезируется в качестве препептидов, которые затем транслоцируются через клеточную мембрану с помощью сигнального пептида и активируются при отщеплении пропептида.
Сходство аминокислотных последовательностей различных видов субтилизинов, консервативность большинства из существующих замен и похожая субстратная специфичность приводит к выводу о сходстве пространственных структур различных субтилизинов. Это показано рентгеноструктурными данными. При сравнении пространственных структур субтилизинов BPNT и Карлсберг, термитазы и протеиназы К, был выявлен структурно консервативный остов из 191 остатка, 18 из которых являются высококонсервативными. Все субтилизины обладают характерным способом укладки полипептидной цепи в пространстве. Ядро фермента содержит около 190 остатков, образующих пять параллельных 0-цепей, окруженных четырьмя а-спиралями (Crapinska, Otlewski, 1999).
Субтилизиноподобные ферменты включают несколько семейств: Семейство субтилизина. К этому семейству относятся белки, в основном микробного происхождения, в частности, ферменты представителей рода Bacillus. Семейство термитазы (субтилизины, действующие в экстремальных условиях); их представители обнаружены только в микроорганизмах, в том числе в термофилах и галофилах. Семейство протеиназы К. Представители этого семейства найдены только в грибах, дрожжах и грамотрицательных бактериях. Это семейство характеризуется особенно высокой степенью близости аминокислотных последовательностей. У некоторых ферментов этого семейства отсутствует участок, ответственный за связывание с ионом Са2\ Кроме того, в литературе описаны семейства пептидаз лантибиотиков, кексинов и пиролизина (Siezen, Leunissen, 1997). Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл Наиболее детально изучены субтилизиноподобные протеиназы, секретируемые бактериями из рода Bacillus. Впервые эти ферменты были выделены из клеток B.subtilis и названы субтилизинами. Позднее подобные ферменты были обнаружены и у других видов бацилл. Хорошо изученными внеклеточными сериновыми протеиназами являются субтилизин Карлсберг, полученный из B.licheniformis и субтилизин BPN - из B.amyloliquefaciens (Ottesen, Svendsen, 1970). Гомология этих ферментов составляет 70%, зрелые ферменты содержат 275 (BPN ) и 274 (Карлсберг) аминокислотных остатков. В протеиназе BPN имеется два Са-связывающих центра, в протеиназе Карлсберг их три (Pantoliano et al., 1988; Bryan et al, 1992). Из культуральной жидкости B.licheniformis также выделены субтилизины А и DY. Субтилизин DY имеет высокую степень гомологии с субтилизином Карлсберг, ферменты имеют сходные физико-химические свойства (Eschenburg et al., 1998). В китайском соевом блюде обнаружена протеиназа DFE, продуцируемая B.amyloliquefaciens DC-4, с молекулярной массой 28 кДа и pi 8,0 (Peng et al, 2003). Было показано, что 24 N-терминальных аминокислотных остатка субтилизина DFE идентичны N-концевой последовательности субтилизина BPN . Щелочная сериновая протеиназа B.subtilis - субтилизин Е (SBE) -является гомологом термитазы из Thermoactinomyces vulgaris. Термитаза отличается от SBE по 157 положениям аминокислот, хотя только 8 замен было бы достаточно для того, чтобы субтилизин Е стал термостабильным. (Zhao, Arnold, 1999). Другим гомологом термитазы (68%) является термостабильная субтилизиноподобная протеиназа Ак1 штамма Bacillus sp. Ak.l (Toogood et al., 1999). Эта протеиназа уникальна тем, что содержит дисульфидную связь в сайте связывания с субстратом. Субтилизиноподобные протеиназы - белки основного характера с изоэлектрическими точками, лежащими в пределах 7,0-9,4. Однако есть и исключения: так, субтилизин Sendai, выделенный из Bacillus sp. G-25-6, имеет изоэлектрическую точку 11, а протеиназа из антарктической психрофилыюй бактерии Bacillus ТА41 - 5,3 (Yamagata et al., 1995; Davail et al., 1994). Как и большинство сериновых протеиназ, субтилизинподобные протеиназы обладают рН-оптимумом в щелочной области рН 7,5-11,0. В литературе последних лет появляется все больше данных об открытии сильнощелочных субтилизиноподобных протеиназ, которые исследователи предлагают отнести к особому подсемейству. Так, необычная для прокариот высокомолекулярная субтилизиноподобная протеиназа с рН-оптимум 10,5-11,0 выделена из Bacillus spp (Okuda et al., 2004). Протеазы, активные в сильнощелочной среде, были выделены из разных штаммов бацилл - ALP I из Bacillus sp, NKS-21, протеиназы А и В из Bacillus sphaericus, apr 46 из B.licheniformis RSP-09-37 (Maeda et al, 2001; Singh et al., 2001; Sareen et al., 2005). Известны и галотолерантные субтилазы - например, протеиназы, полученные из B.subtilis FP-133, сохраняют активность в присутствии 20% NaCl (Setvorini et al., 2006). В целом, рассматриваемые ферменты не термостабильны. Однако из термофильных штаммов бацилл (B.subtilis, B.licheniformes, B.circulans) выделены субтилизиноподобные протеиназы с высокой термостабильностью (Haki, Rakshit, 2003). Так, протеиназа, секретируемая термофильным штаммом B.licheniformes NH1, гомологична субтилизину Карлсберг на 96%, однако обладает высокой термостабильностыо (Nadj-Ali et al., 2006). Большинство субтилизиноподобных протеиназ обладает температурным оптимумом при 45-60С. Однако протеиназы S, N и В, выделенные из B.stearothermophilus TLS33 имеют температурные оптимумы, соответствующие 70, 85 и 90 (Sookkheo et al., 2000).
Функциональная роль внеклеточных протеиназ микроорганизмов
Накопленный фактический материал свидетельствует о том, что функциональная роль этих ферментов куда более многообразна, чем предполагалось ранее и не ограничивается только участием в катаболизме белков. Показано, что секретируемые протеиназы микроорганизмов участвуют в регуляции жизнедеятельности клеток, в том числе в процессах дифференциации, споруляции, осуществляют процессинг белков, а, кроме того, являются факторами патогенности. Трофическая функция. Очевидно, что одной из наиболее важных функций внеклеточных протеиназ является трофическая функция. Протеазы гидролизуют большие полипептиды до мелких пептидов и аминокислот, и таким образом, облегчают их адсорбцию клетками. Внеклеточные ферменты, по-видимому, играют главную роль при питании микробных клеток, обеспечивая возможность роста на труднодоступных высокомолекулярных субстратах. Микробные ферменты, как и внеклеточные ферменты млекопитающих, например, секретируемые поджелудочной железой, таким образом, участвуют в поддержании жизнедеятельности клеток путем обеспечения их необходимым пулом аминокислот.
Имеются интересные данные о том, что внеклеточные субтилазы участвуют в обеспечении микробных клеток микроэлементами. Показано, что ген внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы aprll морской бактерии Alteromonas sp. находится под контролем белка Fur, регулирующего поступление ионов железа в клетку. Предполагается, что в условиях недостатка железа протеиназа осуществляет протеолиз железосодержащих белков с высвобождением ионов металла (Tsujibo et al., 2000).
Участие внеклеточных протеиназ в процессах дифференциации. Белок HetR, представляющий собой сериновую протеиназу, является важным регулятором, необходимым для дифференциации гетероцист цианобактерий Anabaena PCC 7120 (Zhou et al., 1998), что было показано на мутантных белках и с применением ингибиторов сериновых протеиназ. В литературе активно обсуждается роль протеиназ в споруляции. Показано, что при формировании аскоспор дрожжей (Esposito et al., 1981) и высвобождении конидий у грибов (Phadatare et al., 1989) происходит интенсивный белковый обмен, сопровождающийся деградацией белка с помощью протеиназ.
Спорообразование у бацилл также сопровождается синтезом различных протеолитических ферментов. Необходимость протеиназ для спорообразования показана с помощью применения ингибиторов этих ферментов (Dancer et al., 1977). В штаммах с делециями генов внеклеточных протеиназ наблюдается нарушение процесса споруляции (Ferrari et al., 1988). В литературе имеются данные, свидетельствующие о ведущей роли протеиназ в формировании споровых оболочек. Образование споровых оболочек идет при активном синтезе белка, в который вовлекаются аминокислоты и олигопептиды, образующиеся в результате расщепления протеиназами внеклеточных белков. Детали этих процессов в настоящее время не выяснены. Известно, что помимо участия в формировании строительных блоков, протеиназы задействованы в процессинге белков споровой оболочки, которые синтезируются в виде предшественников (Errington, 1993). Кроме того, по-видимому, протеиназы принимают участие и на этапе прорастания споры и автолиза спорангия. Протеолитические ферменты могут неспецифически расщеплять белки поверхностных структур материнской клетки, что способствует освобождению спор. Покоящиеся споры испытывают недостаток в потреблении аминокислот для прорастания. Показано, что благодаря деградации белков у покоящихся спор специфическими сериновыми эндопептидазами количество аминокислот и азота становится достаточным для биосинтеза новых белков и нуклеотидов. Эти протеазы специфичны только для запасающих белков и не влияют на другие споровые белки. Их активность быстро теряется при прорастании спор (Postemsky et al., 1978). Кислые внеклеточные протеиназы включены в деградацию полипептидных цепей клеточных стенок во время прорастания спор Dictyostelium discoideum (Jakcson et al., 1984). Однако необходимо отметить, что в литературе мало информации о внеклеточных протеиназах, секретирующихся на поздних стадиях спорообразования бацилл.
Участие в процессинге белков. Установлено, что внеклеточные протеиназы AprE, WprA и Vpr B.subtilis АТСС 6633 участвуют в процессинге пептидного антибиотика субтилина. В мутантных штаммах B.subtilis, дефицитных по восьми внеклеточным протеиназам, секреции субтилина не наблюдалось (Corvey et al., 2003). Показано, что желатиназа, секретируемая Enterococcus faecalis, осуществляет процессинг-активацию зимогенной формы внеклеточной глутамилэндопептидазы (Kawalec et al., 2005).
Внеклеточные протеиназы как факторы патогенности. В литературе имеется большое количество данных об участии внеклеточных протеиназ в патогенезе различных заболеваний человека, животных и растений. В частности, секретируемые бактериальные коллагеназы играют важную роль в этиологии ряда заболеваний человека. Активными продуцентами коллагеназ являются возбудители газовой гангрены (Clostridium perfringens, Clostridium histolyticum), периодонтоза (Porphyromonas gingivalis), гингивитов (Treponema denticola, Treponema viscentii), менингитов (Flavobacterium meningosepticum, Streptococcus pneumonia) и ряда других заболеваний (Harrington, 1996; Shaw et al., 2004). Ряд патогенов секретируют сериновые протеиназы. Например, S.aureus (Shaw et al., 2004; Rygoulay, 2005), Str.pneumoniae (Ibrahim, 2004), возбудители периодонтоза Actinobacillus actinomycetemcomitans и чумы. Yersinia pestis (Haar et al., 2006), низшие эукариоты - возбудитель малярии Plasmodium falciparum (Withers-Martinez et al., 2004), грибы-энтомофаги (Conidiobolus coronatus) (Bania et al., 2006), фитофаги (Fusarium culmorum) (Ивлева с соавт., 2006), возбудители риномикозов человека (Rhizopus microsporus)
Динамика роста, биосинтеза сериновых протеиназ и спорообразования культур B.amyloliquefaciens и B.pumilus
Влияние ингибиторов на активность протеиназ. Использовали диизопропилфторфосфат (DFP), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), О-фенантролин, хлорид ртути (HgCb), пара-хлормеркурибензоат (р-СМВ) в молярном соотношении 1:100. Утиный овомукоид, соевый ингибитор трипсина («Sigma»), ингибитор из морской анемоны, овальбумин, картофельный ингибитор, лейпептин применяли в соотношении 1:10 (для глутамилэндопептидаз) или 1:100 (для субтилизиноподобных протеиназ). Ингибирование проводили в течение 1 ч при 23, после чего определяли остаточную активность по гидролизу Z-Ala-Ala-Leu-pNA или Z-Glu-pNA в стандартных условиях.
Субстратная специфичность протеиназ. Специфичность субтилизиноподобных протеиназ определяли по гидролизу Glp-Ala-Ala-pNA, Glp-Ala-Phe-pNA, Z-Gly-Ala-Phe-pNA, Z-Pyr-Phe-Ala-pNA, Z-Ala-Ala-Pro-pNA; специфичность глутамилэндопептидаз определяли по гидролизу Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA, Z-Ala-Alarp-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA, Z-Ala-Alarp-Asp-pNA, Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA, Z-Ala Ala-Phe-Asp-pNA, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA, Z-Glu-pNA (Люблинская с соавт., 1987).
Специфичность протеиназ определяли по гидролизу В-цепи окисленного инсулина (Leshchinskaya et al., 1997). К 1 мг/мл раствору субстрата в 0,02 М NaHCCb, рН 8,5 добавляли 10 мкл раствора фермента (1 мг/мл) в том же буфере и инкубировали смесь в течение 4 ч при 37. Высушенные лиофильно гидролизаты разделяли в режиме HPLC на колонке Ultrasphere Octyl (4,6x250 мм), используя линейный градиент водного раствора ацетонитрила 0-70% в присутствии 0,1% раствора трифторуксусной кислоты. Спектры элюатов регистрировали при 215 и 280 нм и анализировали их на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония).
Энзиматическая характеристика протеиназ. Исследование энзиматических свойств ферментов проводили с использованием субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNA и Z-Glu-pNA. рН-оптимум протеиназ определяли, растворяя субстрат в 0,05 М Tris-HCl буфере в диапазоне рН 7,2-9,5. При определении рН-стабильности проводили прединкубацию ферментов при комнатной температуре в течение 2 ч в 0,05 М Tris-HCl буфере в диапазоне рН 7,2-9,5 в присутствии и отсутствие 0,5 мМ СаС12 и определяли активность как описано выше. За 100% принимали активность ферментов, полученную без прединкубации. Температурный оптимум определяли, инкубируя реакционную смесь при температурах от +3 до 65 в присутствии и отсутствие 0,5 мМ Са . При изучении термостабильности раствор фермента предварительно прогревали 1 ч при температурах 22, 37, 45, 50 и 55 в присутствии и отсутствие 0,5 мМ СаСЬ и затем определяли активность как описано выше.
Фибринолитическую активность протеиназ определяли на фибриновых пластинках по методу Астропа-Мюллерца (Astrup Т. et al, 1952). К 9 мл 0,3%) раствора фибриногена добавляли 0,2 мл раствора тромбина («Биолар») (2 мг/мл в физиологическом растворе) и помещали смесь в чашки Петри. В течение 30 мин под действием тромбина растворимый фибриноген превращался в нерастворимый фибрин. Препарат ферментов в концентрации 1 мг/мл (20 мкл) помещали на поверхность прогретых (30 мин при 86) и непрогретых фибриновых пластинок. Инкубировали в течение 30 мин при 37, затем измеряли диаметр зон лизиса. Фибринолитическую активность протеиназ характеризовали по размеру зон лизиса фибрина (мм ) и выражали в ед/мг. За единицу активности принимали количество фермента, образующее зону лизиса фибриновой пластины площадью 1 мм за 1 ч.
Тромболитические и антикоагулянтные свойства протеиназ изучали в условиях in vitro на плазме кролика с 3,8% цитратом натрия. Для определения тромболитической активности протеиназы 0,2 мл плазмы смешивали с 0,05 мл тромбина (2 мг/мл) в физиологическом растворе, инкубировали при 37 в течение 5 мин. К образовавшемуся сгустку добавляли 0,1 мл раствора фермента в концентрациях 0,01-1 мг/мл (в контрольную пробирку вносили 0,1 мл физиологического раствора). Отмечали время полного растворения тромба. Для оценки антикоагулянтных свойств протеиназы 0,2 мл плазмы инкубировали при 37 с 0,1 мл раствора фермента в концентрациях 0,1 и 0,25 мг/мл и отмечали время образования тромба в контрольной и опытных пробирках.
Синтез пептидной связи с помощью субтилизиноподобной протеиназы B.amyloliquefaciens. Ферментативный синтез пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA проводили следующим образом: к раствору 31 мг (0,1 мМ) Z-Ala-Ala-ОСНз (Sigma) и 25 мг (0,1 мМ) Leu-pNA (Sigma) в 0,1 мл диметилформамида и 0,01 мл этилацетона добавляли 0,08 мл раствора фермента (2 мкг), реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Осадок растворяли в 2 мл этилацетата и промывали 3% раствором NaHC03, Н20 и 0,5 н НС1. Полученный раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNA в этилацетате упаривали. Чистоту продукта анализировали с помощью метода тонкослойной бумажной хроматографии в системах бензол-ацетон-уксусная кислота (100:25:4) и хлороформ-метанол (4:1). Применяли качественную реакцию на свободные группы pNA (обработка хроматограммы нингидрином - желтое окрашивание, детектируемое при УФ-излучении) и на соединения с пептидными связями (обработка хроматограммы свободным хлором, образованным при действии соляной кислоты на перманганат калия, затем промывание 0,5 М раствором йодида калия - фиолетовое окрашивание).
Синтез ксилулозы с помощью альдолаз проводили в 50 мМ глицилглициновом буфере с 1 мМ DTT, рН 8,5 с использованием различных субстратов: 1) 100 мМ фруктозо-6-фосфата и 100 мМ гликольальдегида, 2) 200 мМ дигидроксиацетона и 130 мМ гликольальдегида. Параллельно проводили ряд негативно-контрольных реакций (в отсутствие фермента или одного из субстратов) в тех же условиях. Реакционные смеси инкубировали при 37 и отбирали пробы через 0, 2, 4, 8, 12, 24 ч. Продукты реакций разделяли на колонке Aminex НРХ87Н («Biorad») в системе HPLC. Спектры регистрировали при 192 нм и анализировали в программе Millenium .
Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде «Microsoft Excel» путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а 15%. Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью комплекса программ ВЮРТ [12].
Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз B.amyloliquefaciens и B.pumilus
Широкое использование протеиназ в промышленности и медицине обуславливает неослабевающий интерес к поиску новых продуцентов этих ферментов. Известно, что представители рода Bacillus секретируют в среду нейтральные и щелочные протеиназы, многие из которых подробно охарактеризованы (Руденская, 1994; Руденская, 1998). Ранее из различных штаммов B.amyloliquefaciens и B.pumilus были выделены и изучены субтилизиноподобные протеиназы, гены некоторых из этих ферментов были секвенированы (Wells et al., 1983; Ayoma et al., 2000; Pan, Huang, 2004). Показано, что различные штаммы одного и того же вида могут выделять протеиназы, различающиеся по физико-химическим свойствам. Так из разных штаммов B.pumilus выделены субтилизиноподобные протеиназы, различающиеся по рН- и Т-оптимуму действия, стабильности в присутствии различных детергентов (Huang et al., 2003; Aoyama et al., 2000; Han, Damodaran, 1997), что может быть важным с точки зрения применения этих ферментов. Однако в литературе мало данных об особенностях биосинтеза этих протеиназ.
Нами показано, что штаммы B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62 секретируют в среду сериновые протеиназы. С помощью специфических хромогенных субстратов были идентифицированы субтилизиноподобные протеиназы и глутамилэндопептидазы. В настоящей работе впервые выявлено, что B.amyloliquefaciens и B.pumilus является продуцентами глутамилэндопептидаз. Глутамилэндопептидазы (Glu-, Asp-специфические протеиназы), являясь ферментами с узкой субстратной специфичностью, привлекают внимание как инструменты для исследования структуры белковых молекул, для специфического расщепления фузион-белков, а также являются перспективными катализаторами синтеза олигопептидов (Okamoto et al., 1997; Bonger et al., 1994). В настоящее время арсенал продуцентов глутамилэндопептидаз невелик и в литературе немногочисленны сведения об особенностях биосинтеза этих ферментов.
Исследование динамики роста культур и биосинтеза исследуемых ферментов выявило, что синтез субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз B.amyloliquefaciens и B.pumilus имеет двухфазный характер. Ферменты начинают синтезироваться в стадии замедления роста и достигают своего максимума в стационарной фазе роста. Обнаружены два максимума накопления ферментов в ранней и поздней стационарной фазе развития культур. Это свидетельствует о том, что согласно модели Колемана, исследуемые протеиназы являются катаболическими ферментами поскольку максимальный синтез протеиназ наступает в период замедления роста культуры и перехода ее в стационарную фазу роста. Сходные закономерности биосинтеза были выявлены для субтилизиноподобных протеиназ B.intermedius 3-19 (Ицкович с соавт., 1995; Балабан с соавт., 2001). Максимумы накопления субтилизиноподобной протеиназы B.amyloliquefaciens приходятся на 28 и 46-48 ч роста, как у B.intermedius (26 и 44-46 ч). Интересно, что культура B.pumilus значительно позже переходит в стационарную фазу роста, чем B.amyloliquefaciens и B.intermedius. Поэтому первый максимум накопления активности субтилизиноподобной протеиназы также приходится на более поздние часы (32-34 ч). Для биосинтеза глутамилэндопептидаз обеих культур также характерны два максимума накопления внеклеточной активности, приходящиеся на 22 и 48 ч роста у B.amyloliquefaciens, 24 и 48 ч роста у B.pumilus. Видимо, такой характер синтеза и накопления внеклеточной активности может быть связан с физиологической ролью этих ферментов. В литературе имеются данные о взаимосвязи синтеза протеиназ с процессами спорогенеза у бацилл (Errington et al., 1993; Шарипова с соавт., 2002). На стадиях созревания спор и автолиза спорангия протеиназы могут неспецифически участвовать в расщеплении белков, образующих поверхностные структуры материнской клетки, способствуя освобождению эндоспор. Ранее для B.intermedius с использованием фермента р-галактозидазы в качестве маркера было показано, что протеиназы поздней стационарной фазы роста являются секретируемыми, а не накапливаются в среде в результате лизиса клеток (Balaban et al., 2002). Мы предполагаем, что «поздние» ферменты B.amyloliquefaciens и B.pumilus также являются секретируемыми, поскольку исследование динамики спорообразования показало, что к моменту активного синтеза протеиназ поздней стационарной фазы роста обеих культур, количество спор невелико и не превышает 10-15%, а значительное увеличение количества спор начинается после 56-60 ч роста (рис. 4, 6). Это может свидетельствовать о том, что максимум накопления протеиназ, приходящийся на 46-48 ч роста культур, связан с секрецией протеиназ, а не с их выходом в среду в результате массового лизиса клеток. Обнаруженный нами третий максимум накопления ферментов в культуральной жидкости B.amyloliquefaciens и B.pumilus, соответствующий 70-76 ч роста, по-видимому, обусловлен массовым лизисом клеток, поскольку число спор в это время достигает 75-80%.
Исходной для культивирования B.amyloliquefaciens и B.pumilus является среда, разработанная ранее для B.intermedius (Ицкович с соавт., 1995). Однако продуктивность культур в отношении синтеза субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы была невысока, что обусловило необходимость повышения продуктивности культур для получения исследуемых протеиназ в препаративных количествах. Известно, что синтез внеклеточных протеолитических ферментов сильно зависит от состава питательной среды, а подбор оптимальных условий синтеза позволяет добиться увеличения выхода протеиназ в десятки раз (Puri et al., 2002). Поэтому на первом этапе работы мы проводили оптимизацию питательной среды для синтеза сериновых протеиназ бацилл. В ряде работ показано, что внеклеточные протеиназы активно синтезируются на средах с высоким содержанием пептона (Ицкович с соавт., 1995; Балабан с соавт., 20036; Adinarayana et al., 2002). Синтез протеиназ B.intermedius 3-19 и B.intermedius 9А активируется в присутствии в среде культивирования неорганического фосфора (Ицкович с соавт., 1995; Знаменская с соавт., 1986).
