Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 13
1.1.Характеристика и биологическая роль некоторых стероидных соединений . 13
1.2.Важнейшие базовые стероидные соединения, получаемые микробиологической трансформацие стероидов 19
1.3. Сырье для получения базовых стероидных соединений 23
1.4.Механизм деградации стеринов микроорганизмами 25
1.4.1.Микробиологическое расщепление стероидного ядра 30
1.4.2.Микробиологическое расщепление боковой цепи стеринов . 31
1.5.Взаимодействие микроорганизмов с гидрофобными стероидными субстратами 36
1.5.1.Использование циклодекстринов и их производных в микробиологических трансформациях стероидов . 37
1.5.2.Применение иммобилизованных биокатализаторов 40
1.6.Подбор штамма-трансформатора . 44
1.7.Процесс микробиологического 9-гидроксилирования. 45
1.8.Применение смешанных культур микроорганизмов . 46
2.Материалы и методы 50
2.1.Микроорганизмы и методы их культивирования 50
2.2.Условия проведения микробиологических трансформаций . 52
2.2.1. Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. neoaurum .. 52
2.2.2.Проведение процесса трансформации АД с помощью R. erythropolis 53
2.3.Реактивы для выращивания культур и проведения процесса трансформации 54
2.4.Выделение продуктов микробиологической трансформации 54
2.5.Методы анализов, используемые в микробиологических трансформациях 55
2.5.1.Тонкослойная хроматография (ТСХ) 55
2.5.2.Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 55
2.5.3.Протонный магнитный резонанс (ПМР) 56
2.5.4.Определение содержания глюкозы 56
2.5.5.Определение содержание СО2 56
2.6.Метод иммобилизации клеток бактерии R. erythropolis 57
2.7.ПЦР гена 16S рРНК, секвенирование полученных продуктов и анализ последовательностей 16S rРНК. 57
3.Результаты и обсуждение 59
3.1.Микробиологическая трансформация фитостерина (ФС) с помощью М. neoaurum 59
3.1.1.Определение оптимальных условий микробиологической трансформации ФС с помощью M. neoaurum 60
3.1.1.1. Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. neoaurum 61
3.1.1.2.Влияние концентрации глюкозы и характера перемешивания культуральной жидкости М. neoaurum на процесс трансформации ФС в АД 63
3.1.1.3Влияние концентрации гидрокарбонатного иона на полноту биоконверсии ФС в АД с помощью М. neoaurum 64
3.1.1.4.Исследование зависимости скорости накопления АД от дозы
посевного материала М. neoaurum . 68
3.1.2.Трансформация ФС с нагрузкой 20 г/л помощью культуры M. neoaurum 70
3.1.3.Трансформация ФС с нагрузкой 30 г/л с помощью культуры M.neoaurum 71
3.1.4.Трансформация ФС культурой M. neoaurum при повышенной нагрузке (50 г/л)
3.2.Микробиологические трансформации стероидов с помощью бактериальной культуры R. erythropolis ВКПМ Ас-1740 74
3.2.1.Идентификация нового штамма R. erythropolis 75
3.2.2.Определение оптимальных условий проведения трансформации AД при нагрузке 4 г/л штаммом с помощью нового штамма R. erythropolis 78
3.2.3.Трансформация AД до 9-ОН-AД культурой R. erythropolis с нагрузкой субстрата 6-20 г/л 81
3.2.4.9-гидроксилирование AД культурой R. erythropolis с нагрузкой субстрата 50 г/л 83 3.2.5.Гидроксилирование стероидов ряда андростана и прегнана культурой R. erythropolis. 83 3.3. Трансформация АД иммобилизованной культурой R. erythropolis 89
3.4.Трансформация ФС в 9-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis в присутствии солюбилизатора 92 3.4.1.Трансформация ФС до 9-ОН-АД смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis без солюбилизатора 93
3.5.Получение нового 9-гидроксилирующего штамма Rhodococcus 94
3.6.Микробиологическая трансформация 3-метилового эфира ХС до 3-метилового эфира ДГЭА культурой М. neoaurum. 96
3.7.Апробация микробиологического метода получения АД с помощью
М. neoaurum и в 9-ОН-АД с помощью R. erythropolis в ферментере 97
Заключение 99
Выводы. 101
Список публикаций по теме диссертации 102
Список используемой литературы
- Сырье для получения базовых стероидных соединений
- Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. neoaurum
- Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. neoaurum
- Трансформация АД иммобилизованной культурой R. erythropolis
Введение к работе
Актуальность темы.
Стероиды, будучи регуляторами многих жизненно важных процессов в организме человека, нашли широкое применение в качестве лекарственных препаратов в онкологии, заместительной гормональной терапии, как противовоспалительные и антиаллергические средства, а также для решения таких социальных программ, как безопасное планирование семьи. Большая часть из них входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств [Машковский М.Д., 1997].
Потребность в стероидных лекарственных препаратах, как в мире, так и в России с каждым годом возрастает. Это связано с ухудшением общей экологической ситуации и соответственно с возрастающим количеством аллергических и воспалительных заболеваний. Несмотря на растущий спрос на стероидные лекарственные препараты, за последние 20 лет в России производство стероидных субстанций практически прекращено. Дефицит стероидного сырья возмещается за счет импорта, что в значительной степени влияет на стоимость готовых лекарственных форм, которые становятся недоступными для потребителей.
В настоящее время основным стероидным сырьем являются стерины
растительного - фитостерины (ФС) и животного - холестерин (ХС)
происхождения [Андрюшина В.А. и др., 2004]. Большинство
фармацевтических гигантов в области производства стероидных препаратов, такие как Upjohn, Serl (США), Schering (Германия), Mitsubishi (Японии) и другие используют стерины в качестве сырья для стероидного синтеза.
Для нашей страны наиболее перспективным и доступным видом стероидного сырья является ФС, получаемый из сульфатного мыла - отхода переработки древесины. Этот источник сырья для России практически неограничен. Содержание ФС в сульфатном мыле достаточно высокое – около 3% [Conner A., 1976]. Рассматривается также возможность получения ФС из отходов производства рапсового и соевого масел.
Синтез стероидов из стеринов включает в себя окисление и деградацию боковой цепи стеринов.
Несмотря на имеющиеся достижения по химическим методам окисления боковой цепи стеринов, их использование в качестве стероидного сырья становится экономически выгодным только при наличии микробиологического способа окисления боковой цепи ФС (ХС) до 17-кетоандростанов: андростендион (АД), 9-гидрокси-АД (9-ОН-АД), андростадиендион (АДД), и дегидроэпиандростерон (ДГЭА) – ключевых промежуточных продуктов в синтезе практически всей номенклатуры стероидных препаратов из стеринов [Feng-Qing Wang et al., 2011, Donova M.V., Egorova O.V., 2012].
Поэтому важной задачей является разработка эффективных
микробиологических способов получения этих базовых продуктов (АД, АДД, 9-ОН-АД, ДГЭА) из доступного отечественного сырья.
Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлась разработка экспериментального подхода к получению базовых соединений для
синтеза фармацевтических стероидов из стеринов. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:
1.Определить оптимальные условия проведения микробиологического расщепления боковой цепи стеринов до АД и с помощью культуры Mycobacterium neoaurum разработать метод получения АД при повышенных нагрузках ФС (до 50 г/л).
2.Провести селекционирование культур Rhodococcus для получения
штаммов, обладающих высокой 9-гидроксилизной активностью и с их помощью разработать эффективный метод получения 9-ОН-АД при повышенных нагрузках АД (до 50 г/л).
3.Исследовать 9-гидроксилирующую способность культуры Rhodococcus erythropolis на примере стероидов ряда андростана и прегнана.
4.На основе иммобилизованных клеток культуры R. erythropolis создать метод получения 9-ОН-АД.
5.С помощью смешанных культур актинобактерий M. neoaurum и R. erythropolis разработать одностадийный метод получения 9-ОН-АД из ФС.
6. Cоздать одностадийный способ получения 3-метилового эфира ДГЭА (Ме-ДГЭА) из 3-метилового эфира ХС (Ме-ХС) c помощью культуры M. neoaurum.
Научная новизна работы.
Впервые определены оптимальные условия микробиологического
расщепления боковой цепи стеринов с помощью культуры M. neoaurum до АД в условиях насыщения среды гидрокарбонатным ионом.
Впервые с помощью культуры M. neoaurum показана возможность проведения микробиологической трансформации ФС до АД – ценного ключевого соединения для фармацевтической промышленности – при высоких нагрузках, достигающих 50г/л.
Селекционированием микроорганизмов получены 2 новых
высокопродуктивных гидроксилирующих штамма, в которых отсутствует
фермент 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназа. Штамм Rhodococcus erythropolis с
высокой 9-гидроксилазной активностью, устойчивый к высоким
концентрациям диметилформамида в реакционной среде, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Ас-1740 и защищен патентом РФ № 2351645 (Бюллет изобрет №10 10.04.2009). Информация об идентификации штамма Rhodococcus voyshvillii, обладающего устойчивостью к гентамицину, внесена в международную базу данных Genbank для дальнейшего депонирования в ВКПМ.
Впервые с помощью актинобактерии Rhodococcus erythropolis проведено 9-гидроксилирование стероидов ряда андростана и прегнана. Получено 11 новых фармацевтически перспективных 9-гидрокси-аналогов андростанового и прегнанового ряда. Структура новых соединений подтверждена данными ПМР-спектров.
С помощью биокатализатора длительного действия с включением в гранулы клеток оригинальной культуры R. erythropolis разработан новый способ получения 9-ОН-АД.
Впервые с помощью смешанных культур M. neoaurum и R. erythropolis проведена микробиологическая трансформация ФС до 9-ОН-АД без стадии химического выделения полупродукта – АД и применения дорогостоящих солюбилизаторов и токсичных органических растворителей.
С помощью культуры M. neoaurum разработан новый способ микробиологического получения фармакологически ценного стероидного соединения – Ме-ДГЭА.
Практическая значимость работы.
Усовершенствование процесса микробиологической трансформации
стеринов с помощью культур M. neoaurum и R. erythropolis до АД, 9-ОН-АД,
ДГЭА позволило значительно поднять концентрацию стеринов и выход
целевых продуктов, которые являются исходными субстратами для
промышленных технологий получения высокоактивных стероидных
лекарственных препаратов как у нас в стране, так и за рубежом.
Получен оригинальный селективный штамм R. erythropolis и на его основе разработан новый микробиологический метод получения стероидных лекарственных препаратов, который используется в промышленном синтезе высокоактивных стероидных лекарственных препаратов, в том числе и фторированных.
С помощью нового штамма R. erythropolis получены новые фармацевтически-перспективные 9-гидрокси - аналоги андростанового и прегнанового ряда, а использование смешанных бактериальных культур M. neoaurum и R. erythropolis позволило разработать эффективный способ получения 9-ОН-АД непосредственно из ФС, позволяющий избежать дополнительных стадий химического выделения и очистки, что значительно позволяет сократить временные и трудовые затраты, а также экологические характеристики процесса.
Разработан новый способ получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры M. neoaurum.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Осуществление экспериментального микробиологического подхода
получения АД из ФС с использованием культуры M. neoaurum.
2. Исследование 9-гидроксилазной активности культуры R. erythropolis и
разработка метода получения 9-ОН-АД из АД с помощью данного
микроорганизма-трансформатора.
3.Использование смешанных культур M. neoaurum и R. erythropolis для получения 9-ОН-АД из ФС.
4. Создание метода получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры M. neoaurum.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 7 статей, 6 из которых – в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент РФ.
Личный вклад автора в результаты исследования
Состоит в разработке и проведении экспериментальных исследований на всех этапах диссертационной работы, интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на российских и международных
конференциях: на Всероссийской научно-технической конференции-выставке
«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их
реализации» (2004, Санкт-Петербург), III международном конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2005, Москва),
международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и
биоинженерия» (2005, Москва), XX зимней международной молодежной
научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии» (2005, Москва), I Всероссийской научно-практической
конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для
биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные
аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной
школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и
технология» (2008, Миасс), International Scientific Conference on «Chemistry for
Development and Integration» (2008, Hanoi), VI международном конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2012, Москва), VII
международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы
развития» (2013, Москва), V Международной научно-практической
конференции (2013, Ростов), «Научная кафедральная конференция», кафедра биохимии РУДН (Смирнова И.П., Карпова Н.В.)(2013, Москва).
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей главу описание материалов и методов исследования, главу изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемых литературных источников (142), из которых 120 зарубежные. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, иллюстрированная 13 таблицами, 32 рисунками.
Сырье для получения базовых стероидных соединений
Из АДД получают эстрогены и 19-норстероиды. Остальной спектр стероидных лекарств получают из АД, 9-ОН-АД и ДГЭА. Андростендион (АД– андрост-4-ен-3,17-дион) – один из первичных андрогенов, выделяемых надпочечниками человека вместе с ДГЭА. Они на пару отвечают за 5-10% андрогенной активности у взрослых мужчин. АД впервые был изолирован в 1935 году, а в конце пятидесятых годов было обнаружено, что АД обладает слабой андрогенной активностью и может превращаться в активные стероиды – тестостерон и дегидротестостерон или эстрогены в гормонозависимых чувствительных тканях и органах (Ruta L., et al., 2011) Несмотря на то, что в норме воздействие АД уступает воздействию других мужских половых гормонов (в первую очередь тестостерона), его значение возрастает при развитии «вирилизующих» синдромов. Измерение концентрации АД применяется для дифференциальной диагностики и контроля лечения этих заболеваний. Кроме того, «слабые» андрогены играют ведущую роль в метаболизме пациентов с низкой концентрацией тестостерона в норме (например, мальчиков до периода полового созревания). АД также является основным стероидным гормоном женщин в постменопаузе.
Организм вырабатывает андростендион двумя различными путями: или из ДГЭА, или из 17-гидроксипрогестерона (рис.3).
Для фармацевтической промышленности АД получают микробиологическим отщеплением боковой цепи стеринов. АД является важнейшим ключевым соединением, из которого может быть получена большая часть стероидных препаратов: 1.Минерало- и глюко-кортикоиды: гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, кортинеф; 2. Андрогены: метилтестостерон, эфиры тестостерона и др.; 3.Гестагены: ацетомепрегенол, мегестрола ацетат, эфиры 17-гидроксипрогестерона и др.; 4. Диуретики: спиронолактон, канренон и др.; 5. Анаболики: метандростенолон. Дегидроэпиандростерон (ДГЭА)- 3-гидроксиандрост-5 ен-17-он) или прастерон и его сульфатный эфир (ДГЭА-S), являются естественными и одними из самых важных гормонов, вырабатываемые надпочечниками и гипофизом.
В последнее десятилетие наблюдается огромный интерес в изучении биологической роли этих гормонов, имеющих разнообразные физиологические, биологические и биохимические эффекты, охватывающие различные типы клеток, тканей и органов. (Kalimi M., et al., 1994)
ДГЭА и ДГЭА-S, как известно, оказывают основные физиологические и патологические эффекты на когнитивные функции и память (Shealya C. N., 1995). Интересно, что уровни ДГЭА и ДГЭАпостепенно снижаются в процессе старения (Shealya C. N., 1995; Jennifer L., et al., 2013). Это снижение связано процессами дегенерации нейронов и дисфункцией. Кроме того, ДГЭА недавно был идентифицирован как регулятор пролиферации нейронов стволовых клеток (Shealya C. N., 1995). В моделях на животных, ДГЭА показал защитные свойства против различных заболеваний, включая ожирение, диабет, иммунные нарушения, атеросклероз и рак. Существует ряд доказательств на положительные эффекты ДГЭА у больных с надпочечниковой недостаточностью (Shealya C. N., 1995; Krug A., et al., 2008).
По литературным данным ДГЭА может применяться при лечении астмы. ДГЭА предотвращает и смягчает аллергическое воспаление в дыхательных путях и не обладает нежелательными побочными эффектами глюкокортикоидов ( Kasperska-Zajac A., 2010).
ДГЭА производят из дефицитного стероидного сырья - диосгенина. Далее, используя гидроксилирующую способность микроорганизмов, получают гидроксипроизводные ДГЭА, обладающие уникальной биологической активностью и представляющие огромный интерес для медицины.
Из литературных источников известно, что 7-гидрокси-производные ДГЭА обладают в несколько раз более высокими иммунозащитными и иммунорегуляторными свойствами по сравнению с самим ДГЭА (Janeczko T., et al., 2009). А 7,15-дигидрокси-ДГЭА является ключевым промежуточным соединением для синтеза фармакологически активных стероидов, таких как антагонисты альдостерона, диуретики и препараты для лечения инекологических заболеваний. Это ключевой промежуточный продукт для синтеза дроспиренона, который является активным компонентом оральных контрацептивов последнего поколения, отличающихся отсутствием минералокортикоидного эффекта. Химически получить данное гидроксипроизводное очень сложно, и поэтому используют способ микробиологического дигидроксилирования с помощью грибной культуры Colletotrichum lini ( Hui Li, et al., 2013). 9-гидроксиандроста-1,4-диен-3,17-дион (9-OH-АД) - ключевой предшественник в синтезе большого числа высокоактивных противовоспалительных и антиаллергических стероидных препаратов, фторированных по С9, таких как - дексаметазон, синафлан, триамцинолон и др.(Ниу L. D., et al., 2014). 9-ОН-АД обладает антиандрогенной и анти-эстрогенной активностью. Впервые 9-гидроксипроизводное АД описано в американском химическом журнале в 1958 году (Slijkhuis Н., Marx A. F., 1992). В настоящее время 9-ОН-АД получают из стеринов двумя способами:
1)двухстадийный ферментативный процесс с получением AД из стеринов в процессе микробиологического синтеза бактериями рода Mycobacterium (Kennecke М., Weber А.,.1996., James Gomes J., 2008; Wei Wei, 2010), а затем -9-ОН-АД из AД в результате трансформации микроорганизмами (Kieslich К., 1983; Jiu J., et al., 1983; Malaviya A.; Wei Wei, 2010),
2) получение 9-ОН-АД из ФС ферментативным окислением боковой цепи мутантными микроорганизмами(Магх A. F., Slijkhuis Н. 1994; Slijkhuis Н., Marx A. F., 1992).
Сырье для получения базовых стероидных соединений. В настоящее время во всем мире резко увеличилось потребление стероидов, применяющихся в медицине и ветеринарии. Рынок 17-кетоандростанов превысил сотни млн. долларов США, и потребности фармацевтического рынка в этих соединениях продолжают расти (Donova М. V., Egorova O.V., 2012). Поэтому важными являются разработки технологий получения базовых соединений из доступного сырья.
Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. neoaurum
Формирование «комплексов включения» является одним из наиболее интересных свойств ЦД. Молекулярная инкапсуляция может происходить как в твердом, так и в растворенном состоянии. В твердом состоянии, «гостевые молекулы» могут быть заключены в полость молекулы ЦД, при этом изменяются физико-химические свойства молекулы «гостя» (Saenger W., Steiner T., 1998).
Нативные ЦД могут быть модифицированы путем гидроксиалкилирования, алкилирования и сульфоалкилирования с целью повышения растворимости исходных нативных циклодекстринов (Szejtli J., 2004).
Известно, что химическая модификация ЦД приводит к модулированию их свойств (Стелла В.Ж., Раевски Р., 1998). Электронейтральные ЦД описаны Parmerter и др. (Parmerter S. M., Allen E. E. JR., 1969) и Gramera и др. (Gramera R., Caimi R., 1969). Эти соединения были получены путем реакции конденсации циклодекстринов с различными эпоксидами или органическими галогенидами. В качестве примера приводится диметил--ЦД, который может образовывать высокорастворимый в воде комплекс включения со стероидами. Этот комплекс повышает растворимость стероида в 2800 раз и в 100 раз более растворим, чем комплекс стероид--ЦД.
Благодаря способности ЦД повышать растворимость гидрофобных соединений они могут быть использованы в процессах биотрансформации стероидов, поскольку основная проблема данных ферментативных реакций это низкая растворимость в воде и низкая скорость растворения, что приводит к плохой доступности субстрата для микроорганизмов-трансформаторов (Блуэ Э., 2011).
Впервые способность ЦД образовывать водорастворимые комплексы со стероидами была применена венгерскими учеными для увеличения концентрации стероидного субстрата в процессе микробиологической трансформации (Alekhina T. M., et al., 1993).
При исследовании ферментативных преобразований кортикостероидов в присутствии ЦД была показана возможность увеличения концентрации стероидного субстрата в среде, в результате чего наиболее значительные результаты были получены при трансформации гидрокортизона в преднизолон. Было показано, что скорость микробиологического расщепления боковой цепи стеринов в присутствии - и - ЦД может быть увеличена в несколько раз (Hesselink P.G., et al., 1989)
Низкая токсичность ЦД и его коммерческая доступность определяют широкий интерес к проблеме использования комплексов включения ЦД в в биоорганической химии и нанохимии, фармацевтике при создании лекарственных препаратов нового поколения, в технологиях капсулировния пищевых продуктов и косметических средств, в аналитических методиках по определению и разделению изомеров и др.
Применение иммобилизованных биокатализаторов. Важное качество микроорганизмов в закрепленном (иммобилизованном) состоянии – удивительная стабильность их ферментов. Иммобилизованные тем или иным способом клетки микроорганизмов-иммобилизованный биокатализатор (ИмК) удается использовать для проведения трансформации или биосинтеза ряда соединений в течение нескольких месяцев, и даже лет.
Особое внимание ИмК привлекли в конце 60-х – начале 70-х годов ХХ столетия. Использование микроорганизмов приобрело большое развитие в связи с открытием возможности их иммобилизации, в результате чего началось целенаправленное получение их закрепленных на носителе либо в геле (Nussinovitch A., 2010).
Это объясняется целым рядом преимуществ использования ИмК по сравнению с использованием иммобилизованных ферментов и обычных клеток (Давиденко Т. И., Бондаренко Г. И., 1990).
3.Более высокая стабильность и активность по сравнению с иммобилизованными ферментами и свободными клетками, так как иммобилизация защищает клетки от внешних воздействий. 4.Уменьшение затрат на выделение и очистку продуктов реакции, так как 5.Появление возможности создания непрерывных автоматизированных производств, при этом уменьшается ингибирование как субстратом, так и 6.Способность к длительному функционированию полиферментных систем и регенерация кофакторов.
Возможность уменьшения объемов реакций, проводимых иммобилизованными клетками по сравнению со свободными. 8. Улучшается возможность контроля за протеканием реакции. 9.Ожидается существенное уменьшение степени загрязнения окружающей среды. 10. Существенное снижение стоимости продуктов реакции.
Стероиды были одними из первых субстратов, которые трансформировали с помощью иммобилизованных клеток. Успехи химии стероидов, широко применяющей микроорганизмы, наглядно показали их преимущества перед химическими реакциями. Однако, применение свободных клеток микроорганизмов в целях направленной трансформации органических веществ существенно ограничивалось спецификой работы с ними, рассмотрением превращений определенных классов соединений, их лабильностью, трудностью отделения от продуктов реакции и в ряде случаев, низкой экономической эффективностью из-за однократного применения (Fukui S., Tanaka A., 1982)
Биотрансформация стероидов в целевое производное является очень сложным и длительным процессом ввиду низкой растворимости как стероидных субстратов, так и продуктов, в водных средах, что сильно мешает транспорту данных веществ в клетку и из нее. При этом реакционная система гетерофазна и многокомпонентна, она представляет собой суспензию клеток и образующегося со временем клеточного дебриса, частиц кристаллического субстрата и in situ кристаллизующегося продукта в сложной по составу буферной среде, что по окончании процесса требует удаления компонентов биомассы и многостадийной очистки конечного продукта. В результате клетки работают лишь однократно, большой процент полученного ценного вещества теряется безвозвратно во время его выделения. Когда же используются иммобилизованные клетки, то возникает проблема абразивного износа материала носителя, поскольку в реакторах с перемешиванием кристаллы субстрата и продукта действуют на носитель как частицы твердого абразива, поэтому имеется проблема адекватного выбора материала носителя.
Большое количество работ посвящено использованию ИБК в процессе 1,2 дегидрирования с помощью культуры Arthrobacter globiformis. Для проведения этой реакции описаны различные варианты иммобилизации с использованием таких носителей, как полиакриламидный гель (G.K.Skryabin, K.A.Koscheenko., 1978), альгинатные гели (Ohlson S., et al., 1979; Huang J.,), фотосшиваемые полимеры (Sonomoto K., et al. 1979) и др.
Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. neoaurum
Экспериментальные данные по оптимизации процесса трансформации ФС культурой M. neoaurum легли в основу метода получения АД при высокой нагрузке 50 г/л. Трансформацию ФС с нагрузкой 50 г/л проводили с использованием концентрированной биомассы M. neoaurum. Посевная доза составила 0,6 г/л. На 72 и 120 ч трансформации дополнительно вносили по 0,3 г/л инокулята и по 4,5 г/л глюкозы. Применение концентрированной биомассы позволило провести процесс трансформации ФС с нагрузкой 50 г/л за 240 ч с выходом АД 22,6 г/л (65,5%).
Полученные результаты могут послужить основой для создания эффективной технологии промышленного получения АД при высоких нагрузках ФС с помощью микробиологического метода ключевой интермедиат в синтезе фармацевтически значимых 11-гидрокси-9-галоидсодержащих стероидов, обладающих высокой противовоспалительной и антиаллергической активностями. На следующем этапе настоящего исследования были разработаны методы микробиологического получения 9-ОН-АД из АД и непосредственно из ФС (рис.22).
Совместно с сотрудниками группы молекулярной диагностики Центра «Биоинженерия» РАН у исследуемого штамма актинобактерии была определена почти полная последовательность (1417 нуклеотидов) гена 16S rРНК, что соответствует позициям с 11 по 1452 по номенклатуре E. coli. На построенном филогенетическом дереве (рис. 23) исследуемый родококк вошел в кластер штаммов, включая типовой, относящихся к виду R. erythropolis, с высоким уровнем сходства последовательностей (99,4-100%) и высоким значением «бутстреп» -поддержки достоверности ветвления (98). Уровень сходства последовательностей изучаемого штамма с типовыми штаммами других видов рода Rhodococcus был заметно ниже (94,9-98,7%). Обнаруженный высокий уровень сходства последовательностей (выше 99%) гена 16S rРНК исследуемого штамма с аналогичными последовательностями штаммов вида R. erythropolis, согласно существующим в настоящее время представлениям, позволил отнести сравниваемые штаммы к одному виду и не требует проведения дополнительных экспериментов по ДНК-ДНК гибридизации. Изучаемый штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов как R. erythropolis ВКПМ Ас-1740. 0.02 Rhodococcus erythropolis ATCC 13260, U81990 Rhodococcus erythropolis Rhodococcus erythropolis ATCC 53968, AF001265 Rhodococcus erythropolis DSM 43188т, X80618 Rhodococcus erythropolis ATCC 19566, U82667 100 Rhodococcus erythropolis ATCC 19565, U82666
Rhodococcus erythropolis DCL14, AJ131637 — Rhodococcus globerulus DSM 43954T, X80619 — Rhodococcus marinonascens ATCC 35653T, X81933 95 i— Rhodococcus percolatus HAMBI 1752т, X92114 — Rhodococcus opacus DSM 43205T, X80630 Rhodococcus fascians ATCC 12974T, X81930
Rhodococcus corynebacteroides DSM 20151T, X806 4 Rhodococcus rhodnii ATCC 35071T, X81935 Rhodococcus coprophilus ATCC 29080T, X81928 Rhodococcus zopfii ATCC 51349T, X81934 -- Rhodococcus ruber DSM 43338T, X80625 Rhodococcus rhodochrous DSM 43241T, X79288
Филогенетическое дерево Rhodococcus, показывающее положение нового штамма R. erythropolis. Цифрами показаны величины показателя «бутстреп»-анализа, значения менее 95 не указаны. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстояниям).
Штамм R. erythropolis ВКПМ Ас-1740 (рис. 24) не патогенен для человека, получен селекционным путем из штамма дикого типа. Относится к семейству Nocardiaceae. Рис.24. Колонии нового штамма R. erythropolis ВКПМ Ас-1740.
Культурально-морфологические особенности штамма. Хорошо развивается на синтетических средах с глюкозой, на кукурузно-глюкозной среде, рН 6,5-8,5. Растет на МПБ с глюкозой в виде хрупкой пленки, оставляя бульон прозрачным.
Молодые клетки палочковидные, слегка искривленные, иногда ветвящиеся, в поперечнике 0,6-0,7 мкм, длиной 8-10 мкм. Через 2 суток роста в жидкой среде клетки фрагментируются на кокковидные элементы, частично собранные в группы. На кукурузно-глюкозном агаре колонии средней величины грязно-розовые, матовые, с волнистым краем, слегка выпуклые, тестообразные, легко снимающиеся с агара, структура колонии однородная.
Клетки грамположительные, некислотоустойчивые, сохраняют жизнеспособность и стероидтрансформирующую активность при концентрации этанола 5%.
Оптимальная температура для роста и трансформации стероидов 25-32С. Отношение к углеводам: усваивает глюкозу, сахарозу. Отношение к органическим кислотам: усваивает уксуснокислый и лимонно-кислый натрий. Отношение к источникам азота: усваивает нитратный и аммонийный азот. Образует кислоту из многих спиртов. Крахмал не гидролизует, желатин не разжижает, молоко не ферментирует, сахарозу не инвертирует, нитраты не восстанавливает. Отличается от родительского штамма отсутствием 3-77 кетостероид-1,2-дегидрогеназы и не приводит к деструкции стероидной молекулы.
Определение оптимальных условий проведения трансформации AД при нагрузке 4 г/л штаммом с помощью нового штамма R. erythropolis. Для определения оптимальных условий микробиологического 9-гидроксилирования АД с нагрузкой 4 г/л культурой R. erythropolis изучали влияние на процесс трансформации таких факторов как: -способ внесения субстрата; - присутствие глюкозы в трансформационной среде.
Важным условием для проведения трансформации стероидов для клеток микроорганизма-трансформатора является доступность субстрата. По литературным данным, наиболее распространенными способами повышения доступности субстрата являются внесение стероидного субстрата в микронизированном виде и использование органических растворителей, смешивающихся с водой (Kennecke M, Weber A., 1996). Для проведения процесса 9-гидроксилирования АД вносили в виде мелкодисперсной суспензии или в виде раствора – в этаноле или ДМФА.
Л уч ший р езультат - полная конверсия АД (4 г/л) – был получен при наличии в среде10 г/л глюкозы и внесении AД в виде микрокристаллов с размером частиц 10-20 мкм либо в виде раствора в ДМФА (табл. 6). При этом за 24 ч трансформации с помощью культуры R. erythropolis образовывалось 3,8-3,9 г/л 9-ОН-АД. Самая низкая скорость 9-гидроксилирования наблюдалась в присутствии этанола. На вторые сутки инкубации имела место деструкция продукта реакции во всех вариантах.
Трансформация АД иммобилизованной культурой R. erythropolis
Анализ результатов, полученных с R.erythropolis дает основание считать, что для направленного гидроксилирования стероидов бактериями, так же, как и грибами, необходимо наличие в молекуле более одного кислородного заместителя.
Трансформация II и V сопровождалась дополнительным окислением 17 гидроксигруппы и образованием, соответственно, 9-ОН-АД и 9-гидрокси-19 нор-АД. Циангидринная группировка в III легко элиминировалась в условиях проведения ферментации, и конечным продуктом трансформации был также 9-ОН-АД (рис. 27). Трансформация III явилась единственным примером 9 гидроксилирования с низким выходом продукта реакции - не более 50% и высоким содержанием неконвертируемого АД. По-видимому, накапливающиеся в результате снятия циангидринной защиты цианиды ингибировали действие 9-гидроксилазы. У прегнанов восстановление кетогруппы наблюдалось лишь при трансформации IX, однако в этом случае, в отличие от III, имела место полная конверсии субстрата в 9-гидроксипроизводное.
Перспективным способом получения базовых гидроксисоединений является применение иммобилизованных культур микроорганизмов. Иммобилизованные биореагенты обеспечивают возможность многократного использования биомассы, создания длительных полунепрерывных и непрерывных микробиологических процессов, в которых существенно упрощаются способы выделения и очистки продуктов реакции (Fokina О.V. et al., 1996).
В результате включения бактерии R. erythropolis в криогель ПВС совместно с лабораторией криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН был получен гранулированный биокатализатор ИмК (рис.28), далее использованный в нескольких последовательных циклах трансформации АД.
В 9-ом цикле активность ИмК уменьшилась примерно на 30% (рис. 29). Из литературы известно, что снижение активности различных ИмК с увеличением числа рабочих циклов в периодических биотрансформационных процессах вполне обычный эффект, как правило, связанный с постепенным исчерпанием резерва кофакторов, если между циклами не проводится инкубации иммобилизованного биокатализатора в культуральной среде (Nedovic V., Willaert R.). Для микробных клеток Citrobacter intermedius, Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, включенных в макропористый криогель ПВС, аналогичный эффект в одноферментных биотрансформациях тоже известен (Алебян Г.П., и др., 1990; Ariga O., et al., 1993).
Полученные результаты позволяют рассматривать ИмК R. erythropolis Ac-1740 как эффективный биокатализатор многократного действия, снижающий «потребление» биомассы, существенно облегчающий выделение продукта реакции и хранения культуры, что особенно важно для целей масштабирования. Таким образом, период использования ИмК составил 451 ч, из них общее время трансформации 254 ч и время нахождения ИмК в нерабочем состоянии 197 ч. В шести циклах 2-7 трансформация закончилась без остаточного АД.
Трансформация ФС в 9-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis в присутствии солюбилизатора.
Использование метода смешанных культур позволяет упростить и удешевить технологию получения ценных стероидных веществ.
Трансформацию ФС до 9-ОН-АД смешанными культурами проводили в две последовательные стадии: 1) отщепление боковой цепи ФС культурой М. neoaurum с образованием АД, 2)трансформация АД без выделения его из культуральной жидкости до 9-ОН-АД культурой R. erythropolis. На первом этапе АД накапливался в среде в виде крупных кристаллов (рис. 30), многократно превышающих размером бактериальные клетки, и поэтому был недоступен для дальнейшей трансформации до 9-ОН-АД.
Рис.30. Кристаллы АД в культуральной жидкости М. neoaurum (увеличение в 800 раз). Для решения этой проблемы отщепление боковой цепи ФС в 9-ОН-АД проводили в присутствии МЦД, который образовывал водорастворимый комплекс включения с АД.
Трансформация ФС с помощью М. neoaurum при нагрузке 30 г/л в АД была проведена в оптимальных условиях: дробное внесение глюкозы и 0,45 г/л инокулята. Содержание АД через 6 сут составило 15,2 г/л. После добавления 0,3 г/л культуры R. erythropolis в культуральную жидкость через 22 ч трансформации был получен 9-ОН-АД. Продукт содержал по данным ВЭЖХ 80% 9-ОН-АД и 1,5% не вступившего в реакцию АД. Выход 9-ОН-АД в пересчете на трансформируемые ФС составил 56 %. Общее время трансформации составило 168 ч.
Трансформация ФС до 9-ОН-АД смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis без солюбилизатора. Поскольку МЦД является дорогостоящим реагентом, проводили процесс трансформации ФС с нагрузкой 30 г/л до 9-ОН-АД без солюбилизатора.
С целью предотвращения процесса укрупнения образующихся кристаллов АД (рис.30), зависящего в значительной степени от концентрации стероида, 9-гидроксилирующую культуру R. erythropolis вносили на 70 ч трансформации. Образовывающийся АД не накапливался, а сразу гидроксилировался до 9-ОН-АД. Время трансформации составило 168 ч, а 9-ОН-АД был получен с выходом 61%.
Помимо снижения стоимости процесса за счёт проведения его без дорогостоящего МЦД, преимуществом данного метода получения 9-ОН-АД является то, что процесс идет без образования побочных продуктов. Это объясняется тем, что на 70 ч трансформации при внесении 9-гидроксилирующей культуры R. erythropolis еще не накапливались побочные продукты, а образовавшийся в результате расщепления боковой цепи ФС в АД культурой М. neoaurum тут же гидроксилировался до целевого продукта. Получение 9-ОН-АД из ФС с помощью двух культур R. erythropolis и М. пеоаигит, осуществляющих последовательно отщепление боковой цепи ФС с образованием АД и его 9-гидроксилирование, можно рассматривать как эффективный способ промышленного получения 9-ОН-АД - исходного соединения для получения 11-гидрокси-9-галоидсодержащих аналогов ряда прегнана и ряда андро стана.
Получение нового 9а-гидроксилирующего штамма Rhodococcus. Из литературных данных известно, что гидроксилирующая активность микроорганизмов увеличивается, при получении их мутантов, которые устойчивы к воздействию различных экзогенных веществ (Wilmafiska D., et al., 1992).
Из культуры Rhodococcus sp. 11 путем ступенчатой селекции на среде, содержащей антибиотик гентамицин, был выделен штамм, обладающий устойчивостью к гентамицину (60 мкг/мл). На основании анализа последовательности его 16S гРНК штамм был охарактеризован как Rhodococcus voyshvillii и информация об идентификации размещена в международной базе данных Genbank для дальнейшего депонирования культуры в ВКПМ (рис.31).
С новым штаммом проведена трансформация АД с нагрузкой 10 г/л был получен 9-ОН-АД с выходом 98 % за 25 ч. В дальнейшем планируется продолжить работу с новым штаммом.
