Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1. Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия 10
1.1.1. Переход бактерий в пшомстаболическое состояние при стрессовых воздействиях ...11
1.1.2. Соединения группы алкилрезорцннов как аутоиндукторы покоящегося состояния бактерий 16
1.1.3. Процесс мутагенеза в покоящихся клетках 28
1.1.4. Жизнеспособность бактерий при стрессах 32
1.2. Плот постно-зависимые процессы у микроорганизмов и их регуляция 37
1.2.1. Регуляторные системы бактерий, чувствительные к изменению плотности популяции (кворум-эффект), и их сигнальные молекулы 38
1.2.1.1. Кворум-зависимые системы с участием ацилированных лактонов гомоссрина 39
1.2.1.2. Кворум-зависимые процессы с участием пептидных сигнальных агентов 41
1.2.1.3. Кворум-зависимые процессы с участием факторов аминокислотной природы 42
1.2.1.4. Кворум-зависимые процессы с участием иных сигнальных молекул 44
Экспериментальная часть 48
2. Материалы и методы исследований 48
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы 48
2.1.1. Регуляторные факторы микроорганизмов 48
2.1.2. Бактериальные штаммы 50
2.1.3. Иные материалы, используемые в работе 50
2.2. Химические методы анализа 51
2,2,1. Количественное определение алкилрезорцннов 51
2.3. Микробиологические методы анализа..,. 51
2.3.1. Оценка жизнеспособности бактерий при длительном инкубировании и голодании 51
2.3.1.1.Тест Kogure для определения числа жизнеспособных, но некультивируемых клеток 52
2.3.2. Оценка токсических эффектов гексилрезорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания 53
2.3.3. Изменение вирулентности S. aureus под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина 53
2.3.4. Индукция образования R-форм у бактерий под действием исследуемых факторов 54
2.3.4.1. Тест на определение изменения устойчивости S- и R-форм S. typhhnurhun ТА100 к сальмонеллезному бактериофагу 54
2.3.4.2. Определение сохранения плазмиды у S- и R-форм S. typhimurium ТА100 при действии гексилрезорцина 55
2.3.4.3. Определение динамики роста S- и R-форм S. typhimurium ТЛ100 при
действии гексилрезорцина 55
2.4. Методы биотсстирования 56
2.4,1. Опенка токсического действия исследуемых соединений по отношению к тсстерным микроорганизмам 56
2.4.2. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах 56
2.4.2.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций без метаболической активации.. 57
2.4.2.2. Тест на прямое повреждение бактериальной ДНК 57
2.4.2.3. SOS-хромотест 58
2.4.3. Тестирование па генотоксичность in vivo 59
2.4.3.1. Тест на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей ш vivo 59
2.5. Статистическая обработка результатов 60
3. Результаты и обсуждение 61
3.1. Токсические и генотоксические эффекты микробных регуляторов 61
3.1.1. Токсические эффекты исследуемых факторов 61
3.1.2. Способность микробных регуляторов к индукции мутаций 61
3.1.3. ДНК-повреждающая активность микробных регуляторов роста 62
3.1.4. SOS-индуцирующая способность исследуемых соединений 63
3.1.5. Индукция микроядер в эритроцитах периферической крови мышей 67
3.2. Изменение физиологической активности бактерий при длительном инкубировании и голодании 71
3.3. Токсические эффекты гексил резорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания 81
3.4. Изменение вирулентности S. aureus под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина и без него 83
3.5. Индукция образования R-форм у бактерий под действием исследуемых факторов , 86
3.6. Изменение устойчивости S- и R-форм S, typhimurium ТЛЇ00 к сальмонеллезному бактериофагу 91
3.7. Сохранение плазмиды у S- и R-форм S. typhimurium ТА100 при действии гексилрезорцина 92
3.8. Особенности роста S- и R- форм S. typhimurium в присутствии гексилрезорцина 93
Заключение 97
Выводы 103
Список литературы 105
- Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия
- Соединения группы алкилрезорцннов как аутоиндукторы покоящегося состояния бактерий
- Используемые в экспериментальной работе материалы
- Токсические и генотоксические эффекты микробных регуляторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Биологически активные вещества эндогенного и экзогенного происхождения, не вовлекаясь непосредственно в основной метаболизм клеток, могут оказывать разнообразное влияние на функции клеток. В области исследований устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям в последние годы наблюдается очевидный интерес к изучению формирования клеточного ответа, которое осуществляется с участием внеклеточных метаболитов популяционного и межпопуляционного действия. Спектр ауторегуляторных молекул, сопрягающих изменение условий окружающей среды с внутриклеточными реакциями, служит важным триггерным элементом адаптивных систем микроорганизмов. Стрессовые условия могут приводить к образованию различных диссоциативных форм микроорганизмов и форм с иным метаболическим статусом (в частности, некультивируемых). В настоящее время хорошо известна способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды - почвах, водоемах и др. Феномен перехода в некультивируемое состояние привлекает внимание исследователей, поскольку образование таких форм может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды [Романова, Гинцбург, 1993; Романова, Гинцбург, 1996; Романова с соавт., 2002]. Способность к переходу в некультивируемое состояние к настоящему времени выявлена у многих патогенных бактерий, но механизмы этого процесса остаются неясными. В клинической практике известно, что устойчивые формы возбудителей плохо поддаются выявлению и элиминации, поэтому актуальным представляется создание теоретической базы для управления процессами перехода микроорганизмов, в том числе патогенных и условно-патогенных, в некультивируемое состояние. Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, позволят обосновать новые технологические подходы к решению этой проблемы.
Цель и задачи исследований. Целью работы является оценка вовлеченности авторегуляторов физиологического состояния микроорганизмов в процессы неспецифической регуляции физиологической активности бактерий и установление механизмов действия этих веществ как триггерных молекул в адаптивных реакциях бактерий. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Охарактеризовать токсические эффекты регуляторов группы алкилрезорцинов и гомосеринлактона при воздействии их на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.
-
Исследовать возможность повреждения генетического материала
КЛеТОК про- И ЭукарИОТ гинтатидягдгими яндпрта^и ^уТОИНДуктОрОВ
рос. национальная]
! библиотека {
>И I і і— Ц.І.Ж *
анабиоза бактерий, алкилрезорцинами, и плотностно-зависимым регулятором - гомосеринлактоном.
-
Охарактеризовать процесс индукции гипометаболического состояния различных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий экзогенными алкилрезорцинами и гомосеринлактоном.
-
Выяснить возможность модификации токсигенных свойств патогенных бактерий, их фагоустойчивости и антигенных детерминант при воздействии гексилрезорцина. '
-
На основе полученных данных обосновать предполагаемый механизм действия индукторов гипометаболического состояния бактерий. і
Научная новизна. Значение синтетических аналогов регуляторов физиологического состояния микроорганизмов (алкилрезорцинов) и плотностно-зависимого регулятора у бактерий (гомосеринлактона) впервые охарактеризовано с точки зрения медицинской практики. Впервые показана возможность регуляции физиологического и метаболического статуса патогенных и условно-патогенных бактерий с помощью описанных соединений. Впервые установлена возможность взаимоперехода диссоциативных форм бактерий с участием экзогенных микробных ауторегуляторов. Впервые показано изменение вирулентности, фагоустойчивости и способности к размножению (колониеобразованию) различных штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в результате стрессовых воздействий под действием алкилрезорцинов и гомосеринлактона. Впервые выявлены генотоксические эффекты исследуемых соединений в серии тест-систем с использованием микроорганизмов: в тесте Эймса, SOS-хромотесте, тесте на прямое повреждение ДНК, а также в тесте на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей. Впервые обнаружена связь между повреждающим действием ауторегуляторов на геном и индукцией морфогенеза. Впервые получены данные, позволяющие оценить участие данных ауторегуляторных молекул как триггерных в системе адаптивных реакций у бактерий.
Практическая значимость. Регулирование перехода
микроорганизмов в состояние покоя имеет огромное значение для биотехнологии и медицины. Прикладной аспект этой проблемы связан с потенциальной возможностью управления такими процессами, как образование некультивируемых форм патогенов, устойчивых к различным стрессовым условиям, в том числе к фармакологическому воздействию, и сохранение целевой активности промышленных штаммов микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ. Использование экзогенных алкилрезорцинов возможно в любой области
микробиологической практики, где требуется создание условий для образования устойчивых к внешним воздействиям форм микроорганизмов. Полученные результаты позволят создать более полное представление об универсальном ответе микроорганизмов на стрессовые воздействия и сделать соответствующие выводы о потенциальной возможности направленной регуляции патогенности бактерий.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733). Исследования автора по тематике работы были отмечены дипломом Минобразования РФ (2002) и поддержаны грантами НОЦ REC007 (2001-2003), НИОКР АН РТ (2003-2004). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Автоматическую регистрацию ростовых параметров бактерий осуществляли на базе РЦПБ СПИД эксперименты с животными выполнены в ЛБИ ИОФХ им. А.Е. Арбузова.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005), ХШ международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), 79-й Всероссийской студенческой конференции к 1000-летаю Казани (2005), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». (Казань, 2004), на XI Туполевских чтениях (Казань, 2003), международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань, 2001), 7-9-ых Всероссийских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003-2005), II, III конференциях НОЦ REC007 «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2001-2002), 39-ой международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001), а также на итоговых конференциях КГУ (2001-2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 16 рисунков. Библиография содержит 196 наименований российских и зарубежных авторов.
Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия
Устойчивость микроорганизмов к стрессовым воздействиям связана с формированием клеточного ответа, в котором участвуют внеклеточные метаболиты популяциошюго и межпопуляционного действия. Ауторегуляторные молекулы, сопрягающие изменение условий окружающей среды с внутриклеточными реакциями, служат важным триггерным элементом адаптивных систем бактерий. Стрессовые условия могут приводить к образованию различных диссоциативных форм микроорганизмов и форм с измененным метаболическим статусом (в частности, некультивируемых). В настоящее время хорошо известна способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды - почвах, водоемах и др. Феномен перехода в некультивируемое состояние привлекает внимание исследователей, поскольку образование некультивируемых форм может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды. Способность к переходу в некультивируемое состояние к настоящему времени выявлена для многих патогенных бактерий, но механизмы этого процесса остаются неясными [Романова, Гинцбург, 1997]. Остаются также открытыми вопросы, в каких пределах может варьировать фенотипическая изменчивость микроорганизмов, определяемая как морфологически, так и по биохимическим критериям; связано ли такое варьирование с изменением генотипа, или обусловлено временной модификацией клеточных компонентов в ответ на внешние условия. Собственно факт образования некультивируемых форм как у неспорообразующих микроорганизмов, так и у спор о образующих при репрессии спорообразования, заслуживает пристального внимания с точки зрения фундаментальной биологии, биотехнологии и медицины, поскольку предполагает расшифровку возможностей регуляции этого процесса.
Анабиоз — состояние организма, при котором жизненные процессы резко замедляются, что способствует выживанию его в неблагоприятных условиях температуры, влажности и др. Покоящиеся формы микроорганизмов - формы или стадии развития с резко сниженным обменом веществ и энергии (гипобиоз, анабиоз) [Бутова с соавт., 2003]. У покоящихся форм отсутствуют рост и размножение, они не выделяют токсинов, эктоферментов, других биологических веществ, более устойчивы к различным повреждающим факторам внешней среды (в т.ч. к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам, температуре) и иммунным факторам организма хозяина, способны долгое время переживать во внешней среде или в организме хозяина. Покоящиеся формы -разновидность гипометаболических форм, которые характеризуются общим снижением скорости метаболических процессов и повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды [Головлев, 1998]. Ряд авторов по-разному разделяет формы с пониженной метаболической активностью и предлагают индивидуальные схемы, характеризующие глубину состояния покоя и соответствующие типы бактериальных клеток [Бутова с соавт., 2003; Головлев, 1998; Романова, Гинцбург, 1996; Kell et al., 1998]. На основе проделанной экспериментальной работы и компиляции данных литературы нами предложена собственная терминологическая схема (табл.10), обсуждение которой приводится на стр. 97-99.
В естественных местах обитания микроорганизмов высока вероятность возникновения стрессовых ситуаций, характеризующихся, например, дефицитом пищевых компонентов [Kolter et al,, 1993; Бельков, 2002; Ждан-Пушкина, Вербицкая, 1989]. Однако микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, таким как исчерпание питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей, действие различных токсикантов в нелетальных дозах, изменение температурных условий, влажности и т.д. В ответ на стрессовые условия микроорганизмы или продолжают размножаться, но со сниженной скоростью, или стратегия микробного роста заменяется стратегией переживания, которая реализуется за счет образования форм с повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. Следует отметить, что специализированные формы, такие как эндо- и экзоспоры, миксоспоры, цисты и акинеты, известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов, и поэтому вопрос об образовании покоящихся форм неспорообразующими микроорганизмами остается открытым, а исследования в этой области не теряют актуальности [Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин с соавт., 1997].
Соединения группы алкилрезорцннов как аутоиндукторы покоящегося состояния бактерий
У микроорганизмов различных таксономических групп обнаружена способность синтезировать в процессе своего развития ауторегуляторные внеклеточные метаболиты, оказывающие влияние на их рост и дифференциацию. Ингибирование метаболических процессов в целом приводит к образованию гипометаболических форм. Индукторами гипометаболизма могут выступать ауторегуляторные факторы фенольной природы [Капрельянц с соавт., 1987; Мулюкин с соавт., 1996; Hofmann, Hammer, 1999], некоторые белки [Шлеева с соавт., 2003], и ряд соединений неидентифицированной природы [Николаев, 1997].
В работах группы профессора ИНМИ (Москва) Эль-Регистан [Мулюкин с соавт., 1996] показано, что некоторые микроорганизмы обладают специфической системой ауторегуляции роста и развития, включающей аутостимуляторы автолиза - факторы d2 (свободные жирные ненасыщенные кислоты) и аутоиндукторы анабиоза - факторы d[ (производные алкилоксибензолов, в частности алкилрезорцины) [Мулюкин, 1998]. Предложена гипотеза [Мулюкин с соавт., 1997], заключающаяся в том, что автолиз микробных культур должен рассматриваться не только как фаза отмирания микробной популяции, но и как стадия развития, предшествующая и необходимая для образования покоящихся форм. Скорость и глубина автолиза, зависящие от уровня внеклеточных аутостимуляторов автолиза, определяют динамику накопления внеклеточных аутоиндукторов анабиоза за счет их дополнительного к первоначальному уровню поступления из автолизирующихся клеток. Это, в свою очередь, является эндогенным фактором индукции образования покоящихся форм микроорганизмов той частью популяции, которая потенциально способна к их формированию и наиболее чувствительна к действию факторов d]. Следует подчеркнуть, что биосинтез и активность ауторегуляторов dt и d2, безусловно, зависят от внешних факторов, а в экспериментах - от условий культивирования.
Ранее было показано, что ряд неспорообразующих бактерий и дрожжей образуют цистоподобные клетки, обладающие всеми характеристиками покоящихся форм [Дуда с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996]. Образование этих форм зависит от концентрационного уровня и активности факторов d] (дифференцировки клеток), относящихся у некоторых микроорганизмов к алкилрезорцинам [Осипов с соавт., 1985; Мулюкин с соавт., 2001]. Повышение концентрационного уровня факторов dj в клеточной суспензии индуцирует образование цистоподобных клеток, что было продемонстрировано для Bacillus cereus, Pseudomonas carboxydoflava, Methylococcus capsulatus и Saccharomyces cerevisiae. Эти клетки, формирующиеся под воздействием факторов db были отнесены к новому типу анабиотических форм микроорганизмов. Для отнесения их к покоящимся формам необходимы доказательства, что их образование является естественной стадией в циклах развития микробных культур [Мулюкин, 1998]. Снижение интенсивности обмена веществ вегетативных клеток -динамический процесс, который может быть усилен веществами -индукторами гипометаболического состояния. Накапливаются данные, подтверждающие участие в этом процессе ряда химических факторов эндогенного происхождения, в частности, алкилрезорцинов [Грязнова с соавт., 1985; Мулюкин с соавт., 1997; Дорошенко, 2002].
Ауторегуляторные факторы присутствовали в культурах изученных микроорганизмов в виде смесей изомеров и гомологов, отличающихся положением заместителей в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала [Мулюкин с соавт., 2001], Кроме того, было показано, что от длины радикальной цепи алкилрезорцинов зависит их биологическая активность по отношению к клеткам бактерий, в том числе и генотоксичность этих соединений [Ильинская с соавт., 2002].
Используемые в экспериментальной работе материалы
В работе исследовали соединения класса алкилрезорцинов (AR): химические аналоги ауторегуляторных факторов dj бактерий — метилрезорцин (Met) (Sigma, М.м. = 124) и гексилрезорцин (Hex) (Sigma, М.м. = 196). Для сравнения токсических и генотоксических эффектов первоначально работали также с коммерческим препаратом резорцином (R) (Sigma). Для установления возможного неспецифического действия ауторегуляторного фактора микромицетов по отношению к бактериям был выбран пара-2-гидроксиэтилфенол (D), идентифицированный как регулятор группы di у дрожжей [Батраков с соавт., 1993]. Также в экспериментах использовали индуктор включения /ш:/-/ш;й-оперона -гомосеринлактон (HSL) (Aidrich, М.м. = 182), который является зависимым от плотности культуры регулятором физиологического состояния бактерий [Givskovera/., 1998].
Исходный раствор алкилрезорцинов готовили в диметилсульфоксиде (DMSO) в концентрации 10мг на 1мл DMSO, далее работали с концентрациями от 10 до 1000 мкг на 1мл дистиллированной воды, Гомосеринлактон и пара-2-гидрокс и этил фенол изначально растворяли в дистиллированной воде.
Методика обнаружения алкилрезорцинов [Мулюкин с соавт., 1996; Tluscik et al., 1981] основана на их способности взаимодействовать с диазотиевой солью 1,3 — диметоксибензидина с образованием окрашенных в красный цвет комплексов. В работе применяли коммерческий реактив Fast Blue В salt (FBB) (Sigma).
2.5 мг FBB растворяли в 5 мл 5% уксусной кислоты (раствор А) и хранили в холодильнике при 0С в темной посуде. Рабочий реактив В получали разбавлением 1 части реактива А в 4-х частях я-пропанола (до 25 мл). Для определения алкилрезорцинов брали 1.5 мл реактива В и 0.5 мл исследуемого раствора. Оптическую плотность проб измеряли на ФЭК-33 (КФК-2-УХЛ 4.2) при длине волны 490 нм.
Объектом исследования служили грамположительные бактерии: мутантный по спорообразованию штамм В. sitbtilis spoOE и штамм S. aureus ОіС(табл.І).
Исходный титр бактерий в суспензии, полученной смывом культур с L-arapa, составлял для бацилл 3,4x10 и для стафилококков 6,1x10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1мл дистиллированной воды. Суспензию инкубировали в стационарных условиях при 30"С в колбах на 100мл, содержащих 30 мл дистиллированной воды с каждым из исследуемых веществ (50 мкг/мл, опытный вариант) и без вещества (контрольный вариант).
Каждые 2 недели проводили оценку общего числа клеток (ОЧК) и КОЕ с описанием морфологии колоний. 0,1 мл суспензии наносили на поверхность L-arapa в чашки Петри и распределяли равномерно по поверхности агара. При высеве использовали метод предельных разведений. Параллельно исследовали инкубируемый материал на наличие спор (для штамма В. subtilis spoOE) и некультивируемых клеток (для штамма S. aureus), с использованием теста Kogure (см.2.3.1.1). 2.3.1.1. Тест Kogure для определения числа жизнеспособных, но некультивируемых клеток [Kogure et я/., 1979]
Тест основан на положении о том, жизнеспособные клетки, не образующие колоний на твердой питательной среде, при добавлении питательного субстрата в присутствии налидиксовой кислоты, блокирующей деление, увеличиваются в размерах. Увеличенные жизнеспособные клетки под микроскопом легко отличить от мелких, "неотзывчивых" клеток [Kogure et ai, 1979]. Модификация теста, используемая в работе, заключается в окраске препаратов витальными красителями для возможности определения не только числа увеличенных (живых), но и мелких неокрашенных (жизнеспособных) и мелких окрашенных (мертвых) клеток.
Методически эксперимент осуществлялся следующим образом: в водную суспензию исследуемых микроорганизмов добавляли 250мкг/мл дрожжевого экстракта, 20мкг/мл налидиксовой кислоты и инкубировали 4ч и 24ч при 30С в темноте, затем каплю из суспензии фиксировали на предметном стекле, предварительно окрашивая мазок метиленовым синим красителем. Число различных по морфологии клеток регистрировали под микроскопом в 20 полях зрения и выражали как среднюю величину. Неокрашенные клетки (живые, не пропустившие краситель через мембрану), но при этом не увеличившиеся в размере (неспособные реагировать на питательный субстрат) считали популяцией жизнеспособных, но некультивируемых клеток и выражали в процентах от общего числа клеток.
Объектом исследования служили грамположительные (В. subtil is SKI) и грам отрицательны е (S. typhimiirium TAIOO и E. coli K12) бактерии (табл.1).
Ход эксперимента:
1) 18-часовые культуры микроорганизмов выращивали на питательном бульоне Мюллера-Хинтона;
2) работали с культурами плотностью 10 кл/мл (необходимую плотность получали методом серийных разведений). Для определения жизнеспособности при культивировании на богатой питательной среде разведения культур делали в бульоне Мюллера-Хинтона. Для аналогичных исследований при голодовом стрессе разведения культур делали в дистиллированной воде;
3) в опыте использовали плашку для микроисследований на 96 лунок. В лунки вносили по 150мкл культур рабочих штаммов из нужного разведения и 50мкл гексилрезорцина в исследуемом диапазоне концентраций. В качестве негативного контроля использовали растворитель — дистиллированную воду;
4) замеряли рост на приборе «iEMS-Reader» в программе «Микроб-автомат» в течение 18 часов при 37С.
Токсические и генотоксические эффекты микробных регуляторов
Определение интервала концентраций, приемлемых для использования в тесте Эймса, определено по учету токсичности ауторегуляторов по отношению к штамму S. typhimurium ТА 100. Установлено, что гексилрезорцин обладал выраженным действием по отношению к микроорганизмам в концентрациях 100 мкг/мл и выше (% погибших клеток составил в среднем от 30 до 92% соответственно увеличению концентраций). Метилрезорцин проявил токсический эффект только в самой высокой концентрации - 1000 мкг/мл (22% погибших клеток). Резорцин оказался токсичным в двух наиболее высоких концентрациях (65 и 93%). Дрожжевой d-фактор и гомосеринлактон не показали токсических эффектов ни в одной из исследуемых концентраций (табл.2).
Регуляторы, различающиеся по структуре молекул — метилрезорцин, гексилрезорцин, дрожжевой d-фактор, неалкилированный резорцин и гомосеринлактон, обладали разным мутагенным эффектом в диапазоне исследованных концентраций (10 - 1000мкг/мл). Для гексилрезорцина мутагенность удалось зафиксировать только в концентрациях 50 и 100 мкг/мл, так как более высокие концентрации проверять в тесте Эймса было некорректным ввиду высокой токсичности препарата. То же самое можно сказать и о резорцине в концентрации 1000 мкг/мл. У последнего мутагенный эффект был выявлен в концентрациях 100 и 500 мкг/мл. Три других регулятора не показали мутагенного действия ни в одной из исследуемых концентраций (табл.2). Тем не менее, можно предположить, что дальнейшее увеличение концентраций гомосеринлактона могло привести к выявлению мутагенного эффекта данного ауторегулятора, так как его индекс мутагенности дозозависимо увеличивался, однако даже в концентрации 1000 мкг/мл оставался в пределах нормы (1,7±0,2).
Оценка ДНК-повреждающего действия исследуемых ауторегуляторов показала, что только высокие концентрации гексилрезорцина (100 и 50мкг/мл) угнетали рост штамма E.coli uvrA , то есть для восстановления повреждений, вызванных гексилрезорцином, необходимо участие эксцизионной (uvr) репарации (табл.3). Однако, необходимо отметить, что ДНК-повреждающий эффект был слабо выраженным. Остальные препараты не проявили ДНК-повреждающего действия, что доказано по полному w контроля, давал зоны ингибирования роста 9мм для дикого штамма и 11 - 13мм для мутантных.
Величины факторов индукции для исследованных факторов представлены на рис. 2. Показано, что факторы индукции SOS-ответа для метилрезорцина, гомосеринлактона и пара-2-гидроксиэтилфенола в концентрациях от 10 до 100 мкг/мл были значительно ниже порогового значения, что указывает на отсутствие генотоксических свойств этих препаратов. Для неалкилированного резорцина также не было выявлено индукции SOS-функций, хотя в максимальной из использованных концентраций значение IF достигает нижнего порогового уровня «2» (рис.2). Для гексилрезорцина были показаны высокие значения IF в концентрациях 100 и 50 мкг/мл, причем даже в концентрации 10 мкг/мл фактор индукции SOS-ответа достигал IF, близкого к пороговому.
