Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 10
Глава 1. Лабораторные методы выявления М.tuberculosis 10
Глава 2. Молекулярно-генетические методы выявления M.tuberculosis 14
Глава 3. Полимеразная цепная реакция - как наиболее простой и эффективный молекулярно-генетический метод выявления M.tuberculosis 19
Часть 2. Собственные исследования 27
Глава 4. Материал и методы исследования 27
4.1. Пациенты и клинические образцы 27
4.2. Забор материала 28
4.3. Обработка образцов 28
4.3.1.Обработка осадков образцов для «Cobas Amplicor» 29
4.3.2.Обработка осадков образцов для «Нестед- ПЦР» 30
4.4. Проведение анализа 30
4.4.1. Приготовление реакционной смеси для ПЦР на «Cobas Amplicor» 30
4.4.2. Приготовление реакционной смеси для «Нестед- ПЦР» 31
4.5. Регистрация и анализ продуктов амплификации 34
4.5.1. Анализ результатов на «Cobas Amplicor» 34
4.5.2. Анализ результатов после проведения «Нестед- ПЦР» 34
4.6. Чувствительность и специфичность «Cobas Amplicor M.tuberculosis» теста 34
4.7.Определение чувствительности «Нестед-ПЦР» 35
4.8.Определение специфичности «Нестед-ПЦР» 36
4.9.Стандартные характеристики системы 36
Глава 5. Сравнительный анализ ПЦР с микробиологическими методами выявления M.tuberculosis 37
Глава 6. Эффективность выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза с помощью вариантов метода ПЦР 41
Глава 7. Результаты применения ПНР для контроля за эффективностью проводимого лечения 45
Глава 8. Результаты выявления M.tuberculosis с помощью ПЦР у пациентов в случае дифференциальной диагностики заболеваний легких 48
Заключение 52
Выводы 64
Список литературы 65
- Молекулярно-генетические методы выявления M.tuberculosis
- Полимеразная цепная реакция - как наиболее простой и эффективный молекулярно-генетический метод выявления M.tuberculosis
- Приготовление реакционной смеси для «Нестед- ПЦР»
- Эффективность выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза с помощью вариантов метода ПЦР
Введение к работе
Актуальность р^Зоты. В последние годы эпидемиологическая ситуация по туберкулезу как в России, так и за рубежом значительно ухудшилась, возросли заболеваемость и смертность [Приймак A.A., Шилова М.В., 1996; Сон И.М., 1997; Кучеров А.Л., 2000;]. Существенно увеличилось число больных с тяжелыми и хроническими формами, особенно с лекарственно-устойчивым туберкулезом [Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Colston M.J., 1997].
Диагностические затруднения при туберкулезе общеизвестны. Это связано в первую очередь с клинической универсальностью туберкулеза, способного поразить любые органы и ткани, с разрывом по частоте между инфицированием и развитием туберкулеза как болезни, медленным ростом возбудителя и сложностью его выделения непосредственно из клинического материала, трудностью выявления измененных, ультрамелких форм, способных персистировать в организме человека [Нестеренко JI.H., Аксенов М.Ю., 1994; Борисов С.Е., 2000].
В связи с этим проблема раннего выявления возбудителя туберкулеза в последние годы стала особенно актуальной. Классические методы диагностики туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления Mycobacterium tuberculosis (МБТ) [Радюк С.Н., Рыжов К.А., 1998].
Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобакте- рий в клинических образцах. Наиболее широко распространенным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в основе которой лежит амплификация специфического участка ДНК возбудителя. Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МБТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце) [Shinnick Т., Jonas V., 1994; Ramon 1., Sandin R.,1996].
Существуют различные тест-системы для ПЦР-диагностики туберкулеза, которые позволяют обнаружить возбудитель за короткий промежуток времени даже у больных со скудным бактериовыделением или в случаях, когда возбудитель находится в латентной фазе или в замороженных образцах. Все они высокоспецифичны. Чувствительность же, по данным из разных литературных источников, составляет 70 - 96% [Dalovisio J., Montenegro J., 1996; Hengtier M., Klaveln P. 1996]. В то же время эффективность выявления M.tuberculosis методом ПЦР существенно колеблется при различных формах туберкулеза и в зависимости от стадии процесса и эффективности лечения [Стаханов В.А., Леви Д.Т., Владимирский М.А., 2000; Черноусова J1.H., Ларионова Е.Е., 2000]. Эти данные весьма противоречивы и, по существу, нет работ, в которых была бы сделана попытка обобщения результатов применения различных вариантов ПЦР и ее сравнения с другими современными методами диагностики, прежде всего культуральными, что и явилось целью данного исследования.
Цель работы - определить эффективность выявления M.tuberculosis в различных клинических образцах от больных разными формами туберкулеза с помощью тест-систем «Cobas Amplicor» и «не- стед-ПЦР».
Задачи работы.
Проанализировать выявляемость M.tuberculosis с помощью ПЦР по сравнению с другими лабораторно-диагностическими тестами, прежде всего культуральными методами определения микобактерий.
Оценить эффективность использования ПЦР для выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза.
Провести сравнительный анализ двух тест-систем - «Cobas Amplicor» и «нестед-ПЦР» по выявлению M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза.
Изучить вероятность использования ПЦР, для дифференциальной диагностики туберкулеза и ряда других заболеваний легких.
Установить возможности метода ПЦР для контроля за эффективностью лечения туберкулеза основными противотуберкулезными препаратами.
Научная новизна работы заключается в разработке молекулярно- биологического комплекса тестов для выявления M.tuberculosis у больных туберкулезом на разных фазах процесса, мониторинга проводимого лечения и дифференциальной диагностики с другими заболеваниями легких.
В клинической практике для диагностики ряда форм туберкулеза была применена неизвестная ранее собственная тест-система - «нестед- ПЦР», не уступающая по эффективности коммерческой тест-системе, но значительно более дешевая.
Кроме того, в связи с тем, что используемая нами коммерческая тест-система «Cobas Amplicor» (Hoffman La Roche) предназначена для выявления микобактерии туберкулеза в респираторных образцах (мокрота, бронхоальвеолярные секреты), была решена задача адаптирования ее для выявления M.tuberculosis в нереспираторных образцах (кровь, экссудат, спинномозговая жидкость).
Практическое значение работы. Разработаны надежные и эффективные методы раннего выявления M.tuberculosis в различном клиническом материале при разных формах туберкулеза легких. Это позволяет своевременно назначить больным адекватное лечение, что в свою очередь способствует уменьшению пребывания больных в стационаре и соответственно сокращает стоимость лечения каждого больного.
Положен!«, которые выносятся на защиту:
Результаты сравнения выявления Mtuberculosis методом ПЦР с другими лабораторно-диагностическими методами, прежде всего культуральным, показали, что использование ПЦР повышает выявляе- мость M.tuberculosis на 30 % по сравнению с культуральным методом и на 50 % - с бактериоскопией.
Эффективность выявления M.tuberculosis методом ПЦР наиболее высока у больных с деструктивными формами туберкулеза - фиб- розно-кавернозным, инфильтративным. Выявляемость ДНК M.tuberculosis снижается при очаговых и внелегочных формах туберкулеза.
Результаты сравнения «Cobas Amplicor» и «нестед-ПЦР» показали, что «нестед-ПЦР» более чувствительная тест-система, однако больше подвержена контаминации. Использование же двух ПЦР тест- систем на разные участки ДНК уменьшает риск появлению ложноотри- цательных результатов.
Использование метода ПЦР, как одного из методических подходов для дифференциальной диагностики туберкулеза, позволило ускорить постановку диагноза и назначить адекватное лечение у больных с подозрением на рак легких и в случае неспецифических заболеваний легких. В случае дифференциальной диагностики с саркоидозом, об абсолютной эффективности подобного метода определения M.tuberculosis трудно говорить, тем более что этиология заболевания не известна. Для анализа экссудативных плевритов метод, в используемом нами варианте, оказался недостоверным.
Применение ПЦР для контроля эффективности лечения туберкулеза основными противотуберкулезными препаратами способствовало быстрой и достоверной оценки результатов лечения, особенно у больных с отрицательными результатами бактериоскопии и культураль- ного посева и у, так называемых, абациллярных больных.
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты, в настоящее время, используются в практической работе Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения Москвы по выявлению М^Ьегсикшв в клиническом материале для своевременной диагностики туберкулеза, в случаях неясного диагноза и для контроля за лечением. Материалы диссертации были использованы при составлении методических рекомендаций «Выявление ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (М.ШЬегсикшз и М.Ытв) методом полимеразной цепной реакции (Н-ПЦР) в различных биологических пробах», сданы в печать.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1Усъезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров, Йошкар-Ола, 1999; 3 Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000; на конференции памяти М.М. Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы», Москва, 2000.
Содержание работы. Диссертация изложена на 77 страницах машинописного текста и состоит из: введения, 3-х глав литературного обзора, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 11 таблиц. Библиография включает 118 источников литературы, из них 32 на русском и 86 на иностранных языках.
Часть I. Обзор литературы
Молекулярно-генетические методы выявления M.tuberculosis
Раннее выявление туберкулеза легких - одна из основных задач в борьбе с этой болезнью. Способы быстрого выявления МБТ чрезвычайно важны для своевременной постановки диагноза, выбора правильного лечения и предупреждения распространения заболевания [Приймак A.A., Шилова М.В., 1996; Радюк С.Н., Рыжов К.А., 1998]. К классическим методам диагностики туберкулеза, так называемому «золотому стандарту», относятся методы микроскопии и бактериологического культивирования. Кислотоустойчивое окрашивание в сочетании с микроскопическим исследованием мазков-препаратов с использованием световых микроскопов с иммерсионной системой, обычно является первым, наиболее простым и быстрым бактериологическим методом диагностики инфекции, вызванной туберкулезными бактериями или другими микобактериями [Рональд В., 1979]. Преимущество этого метода - в быстроте. Однако возможности его ограничены. Известно, что при прямой бактериоскопии мазка, МБТ могут быть обнаружены только при очень большом их количестве от 50 ООО - 100 ООО бактериальных клеток в 1 мл патологического материала. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в значительно меньшем количестве, тогда этот метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления [Хоменко А.Г., Корнеев В.Н., 1993].
В таких случаях применяют методы «обогащения» или «накопления» туберкулезных палочек. Наиболее распространенным является метод флотации. Принцип его заключается в том, что микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, извлекаются из водной суспензии исследуемого материала с помощью углеводородов. Микобактерии прилипают к капелькам углеводорода и удерживаются на их поверхности. Капельки всплывают, образуя пену, в которой концентрируются микобактерии туберкулеза. Но этот метод требует большой затраты времени [Козулицына Т.Н., Макаревич Н.М., 1978].
В последние годы широко применяют люминесцентную микроскопию, как ценную диагностическую процедуру. Она представляет собой микроскопию с использованием кислотоустойчивых красителей, содержащих флюорохром. После обработки образца таким красителем происходит свечение объекта под действием УФ лучей или коротковолнового синего света. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований, так как дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 1000 микробных клеток на 1 мл материала, и позволяет проводить исследование без иммерсии, при меньших увеличениях микроскопа и, следовательно, просматривать в короткий срок значительно больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой. Люминесцентная микроскопия позволяет увеличить процент находок приблизительно на 17 % по сравнению с другими методами микроскопии [De Wit D., Maartens G., Steyn L., 1992; D Amato R. et al., 1995; Takagi N., Hasegawa J., 1998]. Однако микроскопическое обнаружение кислотоустойчивых микобактерий не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса МБТ (возбудители туберкулеза) от нетуберкулезных («атипичных») микобактерий - возбудителей микобактериозов [Борисов С.Е., 2000].
Культуральные методы выявления микобактерий туберкулеза имеют больше преимуществ по сравнению с методами бактериоскопии и являются более информативными. На выросших культурах может быть определена чувствительность к противотуберкулезфм препаратам, изучена вирулентность и другие свойства микроорганизма [Козулицына Т.Н., Макаревич Н.М., 1978]. В качестве унифицированного международного стандарта с 1955 г. используется среда Левенштейна-Йенсена. Также для посева патологического материала используют другие плотные среды: Финна 2, Гельберга, Петраньяни, Мордовского. Все перечисленные среды мало отличаются по химическому составу, физическим свойствам и состоят из солевой основы с добавлением желтков куриных яиц. Соответственно высеваемость и скорость роста микобакте- рий на различных средах незначительно расходятся в ту или иную сторону [Нуратинов Р.А., 1999]. Например, среда Финна 2 отличается от среды Левенштейна - Йенсена тем, что вместо L - аспарагина используются глютамат натрия. Это позволяет определять МБТ на несколько дней раньше и увеличить выявляемость на 6-8 % (при наличии в посадочном материале от 100-500 жизнеспособных клеток).
Несмотря на наличие такого количества вариантов питательных сред для роста МБТ, в настоящее время получили развитие новые направления, связанные с конструированием питательных сред на других химических основах [Голышевская В.И. и др., 1996]. В качестве источников питания микобактерий, з новых средах используют глутаминовую кислоту, ферментолизаты биомассы микроорганизмов и липидные компоненты микробной массы. Такие среды имеют преимущество по частоте выделения и скорости роста культур микобактерий по сравнению с традиционными. Недостатком же культуральных методов, с использованием плотных сред, является их длительность. Ответ о наличии туберкулезной инфекции можно дать лишь через несколько недель (4-12 недель).
Использование жидких сред позволило сократить сроки выявления МБТ (до 7-14 дней), идентифицировать микобактерии из всего комплекса МБТ и получить антибиотикограмму [Пунга В.В., 1997]. В настоящее время используют две системы с жидкими средами: «MGIT BBL MGIT System» (Becton - Dickinson) и МВ/ВасТ (Organon Teknika). Принцип действия этих систем заключается в оценке изменения степени свечения флюоресцентного индикатора, который включен в каждый флакон со средой и реагирующего на рост возбудителя туберкулеза. В системе MGIT Bactec 960 такой индикатор реагирует на изменение концентрации кислорода (во время роста микобактерий идет поглощение кислорода), а в системе МВ/ВасТ на изменение концентрации СО2 (увеличение концентрации СО2 в процессе роста возбудителя туберкулеза). В обеих системах базовой средой является бульон Middlebrook 7Н9, обогащенный дополнительно питательными веществами, антиоксидантом и пятью неспецифическими антибактериальными препаратами. Время детекции микобактерий на Bactec MGIT 960 составляет, по данным различных авторов, 10,7-12, а на МВ/ВасТ 16-18,7 дней, сравнение эффективности детекции МБТ со стандартными плотными средами показало, что из всех полученных культур 87% выявлялись на Bactec MGIT 960, 81% - МВ/ВасТ и 76% - на плотных средах [Иртуганова О. А. и др., 1998; Rivera A., Tupasi Т., 1997].
Полимеразная цепная реакция - как наиболее простой и эффективный молекулярно-генетический метод выявления M.tuberculosis
Для этих целей используется NaOH и NALC (N-ацетил-Ь-цистеин). Для разрушения микробной клетки применяют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты (SDS, NaCL, тритон х 100), протеиназу К и гуани- дин тиоционат с последующей сорбцией ДНК на микропористом стекле [Buck G., О Нага L., Summersgill J., 1992; Eisenach К., 1992]. Экстрагируют ДНК МБТ, используя фенольно-хлороформный метод с последующей преципитацией этанолом для концентрирования ДНК в образце. При этом достигается хорошая очистка ДНК, особенно от ингибиторов Taq-полимеразы [Eisenach К. et al., 1988; Brisson-Noel А. et al., 1989], однако происходит количественная потеря ДНК, что не приемлемо для образцов, полученных от больных со скудным бактериовыделением. Кроме того, метод слишком громоздкий для поточной системы обработки образцов. Исследователи выбирают метод выделения ДНК согласно поставленным задачам [Cooper G. et al.,1989; Victor Т. et al., 1992; Kocagoz T. et al., 1993; Sandin R., 1996]. Для поточной системы необходим простой метод, с минимумом операций для избежания контаминации.
Поскольку метод ПЦР является высоко чувствительным, появляется риск возникновения ложноположительных результатов, которые могут получаться в связи с попаданием в реакционную смесь следовых количеств ДНК (ампликонов, ДНК из клинических образцов, ДНК- стандарта из положительного контроля). Для исключения ложноположительных результатов используют дезоксиуридинтрифосфат и урацил- N-гликозилазу [Longo М., Berninger М., Hartly J., 1990]. Этот фермент отщепляет урацил из цепи ДНК и разрушенные ампликоны уже не могут быть матрицей для синтеза. После первого прогрева урацил-N- гликозилаза инактивируется и далее синтез осуществляется с искомой матрицей ДНК (ЗДапкаг Р. еХ а1.,1991]. Ингибирование фермента Тац- полимеразы, во время прохождения реакции амплификации, может привести к появлению ложноотрицательных результатов. Для решения этой проблемы используют внутренний контроль, матрицей для которого служит фрагмент ДНК. Образующийся на такой матрице ампликон будет меньше по размеру, чем искомый ампликон. Отсутствие синтеза такого ампликона будет указывать на наличие в исследуемом образце ингибиторов ПЦР [Кох I. е1 а1.,1994].
Данные литературы по клиническому применению ПЦР весьма ограничены. Клинические испытания метода ПЦР показали, что выяв- ляемость МБТ этим методом варьирует от 50 % до 98 % в зависимости от формы туберкулеза и уровня бацилловыделения [Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., 2001]. Так, при деструктивных формах туберкулеза легких (кавернозный, фиброзно-кавернозный, цирроти- ческой), когда идет массивное бацилловыделение, выявляемость МБТ составляет 92,2 - 98,0 %. При очаговых формах (туберкулома, очаговый, ТВГЛУ) выявляемость МБТ падает и составляет 70,0 - 80,0 %, а у оли- гобациллярных и абациллярных больных до 50,0 % [Журавлев В.Ю., Соловьева Т.Н., Суворов А.Н., 2000]. Тем не менее, это существенно выше по сравнению с бактериологическими показателями выявления МБТ. Особенно ярко проявляются преимущества ПЦР в случае внеле- гочных форм туберкулеза, когда необходима верификация диагноза туберкулезного менингита, туберкулезного экссудативного плеврита. По литературным данным чувствительность ПЦР при исследовании спинномозговой жидкости на наличие МБТ составляет 48 % [Кох 1995], плеврального выпота - 60-81 % [Эе Э., МааПепв в., 81еуп Ь., 1992; Агога 8., ВаЬи Ы., Лпс1а1 8., 2000], а при исследовании материалов биопсии плевры - 89 % [Така1 Ы., НаБеа\уа 5., 1998]. Кроме того, ПЦР использовали при поиске этиологического агента саркоидоза, поскольку есть мнения, что возбудитель туберкулеза является причиной возникновения этого заболевания [Saboor S. et al., 1992]. По литературным данным, выявляемость ДНК МБТ у саркоидозных больных составляет 51 % [Eckert Н., 1988].
Использование крови, как материала для выявления МБТ при диагностике туберкулеза, всегда интересовало клиницистов и исследователей. Это связано с тем, что сбор и обработка респираторных образцов повышает риск заражения туберкулезом медицинского персонала, с трудностями получения мокроты у больных со скудным ее выделением, а периферическую кровь всегда можно использовать для исследований. Но литературные данные эффективности и использования метода ПЦР по выявлению ДНК МБТ в крови очень разноречивы. Одни авторы утверждают, что выявление возбудителя в этом типе образцов малоэффективно [Aguado J. et al., 1996], другие имеют противоположное мнение [Condos R., McClune A., William N. et al., 1996].
Таким образом, основной характеристикой ПЦР метода для диагностики туберкулеза является его быстрота, высокий уровень чувствительности и специфичности, точное обнаружение микроорганизмов, присутствующих в малых количествах [Cheng S., Ma Y., Pan Y., 1993]. Метод ПЦР позволяет выявлять измененные, ультрамелкие формы МБТ, которые способны персистировать в организме человека, дифференцировать МБТ от условно-патогенных микобактерий, а также используется для идентификации микобактерий в эпидемиологических исследованиях [Otal I., Martin С., Vincent-Levy-Frebault V., 1991; Stauffer F. et al., 1998; Guliang H., Tefu L., 1998]. Исходя из вышесказанного видно, что метод полимеразной цепной реакции является перспективным в диагностике туберкулеза и имеет больше преимуществ по сравнению с традиционными методами, а также с некоторыми другими молекулярно- биологическими методами из-за несложности постановки реакции и доступности применяемого оборудования.
Приготовление реакционной смеси для «Нестед- ПЦР»
Неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по туберкулезу и увеличение количества случаев заболевания с признаками множественной лекарственной устойчивостью требует разработки и внедрения современных методов для более быстрой и ранней диагностики туберкулеза. Существующие лабораторные методы детекции МБТ, основанные на прямом или косвенном выявлении возбудителя туберкулеза, весьма эффективны, но либо недостаточно чувствительны, либо характеризуются длительностью получения ответа. К прямым методам относятся бактериоскопия и культуральные бактериологические исследования, которые направлены на поиск и идентификацию возбудителя.
Бактериоскопическое исследование является первым, наиболее быстрым и дешевым методом выявления кислотоустойчивых микобак- терий. Однако возможности его ограничены. Даже при использовании самой совершенной оптической техники обнаружение МБТ возможно только при наличии не менее 1000 микробных тел в мл материала. Такое количество микобактерий содержится в мокроте больного с выраженными деструктивными процессами, тогда как большинство больных выделяют МБТ в количестве ниже предела метода бактериоскопическо- го исследования. Кроме того, при этом виде исследования не представляется возможным дифференцировать микобактерии туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий.
Культуральный метод обладает большими возможностями и является более информативным. Он позволяет выявлять возбудитель туберкулеза при наличии не менее 100 жизнеспособных клеток в посадочном материале. Так же на выделенных культурах может быть осуществлена идентификация микобактерий, определена чувствительность МБТ к противотуберкулезным препаратам, изучена вирулентность и другие свойства микроорганизмов. Посев патологического материала осуществляют на различные плотные питательные среды (Левенштейна- Йенсена, Финна, Гельберга и др.), а также на вошедшие недавно в практику, полностью автоматизированные системы культивирования МБТ на жидких средах: ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ (Organon Teknika). Основным недостатком плотных сред является весьма медленный рост на них МБТ. Использование жидких сред позволило сократить сроки выявления МБТ до 7-14 дней против 4-12 недель на плотных средах [Иртуганова O.A. и др., 2001; Bruce А. et al., 1999]. Однако существует ряд факторов, который ограничивает широкое применение этих новейших культуральных методов. Это сложности, связанные с обработкой патологического материала перед посевом, а также использованием дорогостоящих жидких питательных сред и оборудования. Все это снижает эффективность внедрения данных методов в клиническую практику.
К непрямым методам определения наличия МБТ в организме больного относятся современные тесты серодиагностики туберкулеза [Литвинов В.И. и др., 1995; Литвинов В.И., Гергерт В.Я., Мороз A.M., 1999]. Наиболее перспективным является ИФА, основанный на определении в различных биологических секретах антител к МБТ. Чувствительность ИФА позволяет определять минимальные количества (нано- граммы) вещества. Однако большое разнообразие и многочисленность антигенных детерминант у МБТ приводит к перекрестным серологическим реакциям и тем самым снижает специфичность метода. Его, в основном, используют для скрининга туберкулеза и отбора больных для дальнейшего обследования.
Таким образом, недостатки перечисленных методов показывают, что использование их в диагностике туберкулеза имеет свои ограничения. А появление морфологически измененных (зернистых, ультрамелких и L-форм) микобактерий еще больше осложняет выявление МБТ. Все выше сказанное подчеркивает необходимость использования новых более совершенных методов обнаружения МВТ, сочетающих высокую специфичность и быстроту детекции. В этом отношении одним из наиболее перспективных направлений в развитии методов прямой детекции МБТ является использование технологий, основанных на обнаружении ДНК микобактерий туберкулеза. Наиболее широко применяются в практике методы ДНК-ДНК гибридизации, изотермальной амплификации при смещении цепи ДНК (80А), изотермальной амплификация посредством транскрипции (ТМА), обратная транскрипция и амплификация (ИТ-РСЯ), лигазная цепная реакция и полимеразная цепная реакция. Все они направлены на выявление в биологическом материале специфических нуклеотидных последовательностей, находящихся в геноме МБТ. С помощью этих методов можно быстро определить возбудитель туберкулеза в диагностическом материале, дифференцировать МБТ между собой в микобактериальном комплексе или от других нетуберкулезных (атипичных) микобактерий, использовать для штаммовой идентификс. ции [ аиЯег Р. е1 а1., 1998; Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., 2001]. Эти методы используются исследователями для решения узких научных проблем. Для выявления МБТ при большом потоке клинического материала, они оказываются слишком громоздкими.
Наиболее эффективным и удобным, для прямого обнаружения нуклеиновых кислот возбудителя туберкулеза в клиническом материале, оказался метод ПЦР. Полимеразная цепная реакция радикально снижает время проведения анализа, обладает высокой чувствительностью (от 1 до 10 клеток в образце) и специфичностью (обладает избирательной амплификацией генетического материала МБТ или МБТ-комплекса). Кроме того, ПЦР имеет особое преимущество при выявлении возбудителя, находящегося в латентной фазе или в малых количествах, когда не удается его обнаружить традиционными методами. Для детекции МБТ в клинических образцах разработаны и используются несколько тест- систем, которые в качестве мишени для амплификации используют различные участки генома МБТ: области повторяющихся последовательностей IS6110 и IS986; фрагменты ДНК-генов, кодирующие микобактери- альные антигены - белок 65 кДа, МРВ 64, антиген Ь; фрагмент гена 16s РНК. Оценка диагностической значимости каждой из систем амплификации показала, что чувствительность метода ПЦР составляет 80-97 %. Совместное использование в ПЦР анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность до 98 %, а использование трех образцов от каждого пациента до 100 % [Andersen A. et al., 1993; Yamazaki T., Nakamura R., 1993; Sandin R., 1996].
Эффективность выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза с помощью вариантов метода ПЦР
При работе с образцами крови собственные исследования показали, что для цельной крови необходима многократная отмывка осадка промывающим раствором для С А при высоких оборотах центрифугирования. Такая тщательная обработка материала необходима, поскольку гемоглобин является мощным ингибитором амплификации [Gamboa F., Manterola J., Lonca J., 1997]. Полученные результаты выявления ДНК МБТ из крови методом ПЦР демонстрируют, что метод может быть полезным в диагностике туберкулеза и использоваться для скрининга и отбора больных с подозрением на туберкулез для последующего тщательного обследования [Mittermayer Н., Tuncer S., 1997; Tuncer S. et al., 1997].
Таким образом, проведенные исследования демонстрируют необходимость использования двух ПЦР тест-систем на разные участки ДНК МБТ при анализе клинического материала на наличие МБТ. Это связано с преимуществами и недостатками каждой из используемых тест- систем. Также желательно исследовать различный биологический материал от одного больного в связи с возможными потерями МБТ при заборе и обработке клинических образцов.
Самым существенным фактором, обеспечивающим успешное лечение больных туберкулезом, является контроль за эффективностью действия лекарственных препаратов. Для оценки эффективности лечения у больных с разными формами туберкулеза был проведен сравнительный анализ выявления возбудителя туберкулеза методом ПЦР с традиционными методами диагностики в зависимости от сроков лечения (глава 7). Метод ПЦР оказался самым эффективным, так как после проведенной терапии, когда результаты культурального и бактериоскопиче- ского тестов были отрицательными, с помощью ПЦР до 3-х месяцев лечения в среднем по всем формам туберкулеза удавалось обнаружить МБТ в 30 % случаях, а после 3-х месяцев в среднем в 23 % (см.табл. 8). Кроме того, по результатам исследования больные были условно разделены на четыре группы: пациенты, у которых лечение было оценено как не эффективное, поскольку результаты ПЦР и культурального посева оставались положительными; пациенты, у которых лечение проходило с эффектом. Результаты ПЦР и культурального посева после 3-х месяцев лечения были отрицательными; пациенты, у которых только по результатам ПЦР можно подтвердить диагноз туберкулеза и оценить эффективность проводимого лечения. Это группа так называемых «абациллярных больных»; пациенты, которых можно отнести к группе риска реактивации туберкулеза в случае приостановки лечения на этом этапе, поскольку при отрицательных результатах бактериоскопии и культурального посева, ПЦР оставалась положительной. Таким образом, полученные результаты подчеркивают возможность и необходимость использования ПЦР для мониторинга лечения. Для оценки эффективности выявления МБТ методом ПЦР в случае дифференциальной диагностики заболеваний легких были исследованы клинические образцы, полученные от больных с предварительным диагнозом злокачественных новообразований легких, саркоидоза и неспецифических заболеваний легких, а также в случае установления этиологии экссудативного плеврита (глава 8). Полученные результаты показали, что в группе больных с первичным диагнозом рак легких использование ПЦР весьма эффективно. Так из 27 больных с предварительным диагнозом рак легких у 5 была обнаружена ДНК МБТ в диагностическом материале методом ПЦР и в дальнейшем у 4 из них был подтвержден диагноз туберкулеза. В одном случае на фоне старого неактивного очагового туберкулеза был обнаружен плоскоклеточный рак. В группе больных с предварительным диагнозом неспецифические заболевания легких применение ПЦР оказалось также весьма эффективным. Из 52 обследованных больных у 10 в клиническом материале были обнаружены МБТ методом ПЦР. В дальнейшем у 8 из них был поставлен туберкулез. В двух случаях произошла контаминация. Такой результат исследования может послужить для быстрой постановки диагноза и назначения адекватного лечения. В то же время, у больных с дифференциальным диагнозом саркоидоза и туберкулеза методом ПЦР ДНК МБТ была выявлена у 15 из 83 больных с гранулематозным поражением легких неясной этиологии. В дальнейшем, у 12 (14,5 %) был подтвержден диагноз саркоидоза, у 4 (4,8 %) - туберкулеза. Такой процент выявляемости микобактерий у больных саркондозом с одной стороны говорит об определенной роли МБТ в развитии этого заболевания [Saboor S., Johnson N., Me Fadden J., 1992] и с другой показывает трудности дифференцировки туберкулеза и саркоидоза. Применение метода ПЦР для выявления ДНК МБТ в этих случаях не является абсолютно эффективным. Используя экссудат для выявления МБТ методом ПЦР при дифференциальной диагностике плевритов, было установлено, что только в 50,3 % случаев с подтвержденным диагнозом туберкулезного плеврита ДНК МБТ была обнаружена в экссудате. Такой результат выявляемости недостаточен для верификации диагноза туберкулезный плеврит, что вероятно связано с тем, что у большинства больных этой формой туберкулеза МБТ в экссудате не выявляется никаким из известных лабора- торно-диагностических методов [Villegas М., Labrada L., Saravia N., 2000] и даже для такого чувствительного метода как ПЦР количество МБТ не достаточно. Это делает, с нашей точки зрения, недостаточно эффективным применение метода ПЦР в диагностике плевритов.
Таким образом, проведенные исследования демонстрируют возможности и пределы метода ПЦР в дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких.
Основные результаты проведенной работы заключаются в возможности быстрого выявления МБТ методом ПЦР из клинического материала больных с разными формами туберкулеза, в случае дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких и в адаптации тест-системы «Cobas Amplicor» для выявления МБТ в нереспираторных образцах (спинномозговая жидкость, кровь, экссудат).
Разработка надежных и эффективных методов раннего выявления МБТ в различном клиническом материале при разных формах туберкулеза позволяет значительно раньше назначить больным адекватное лечение. Кроме того, результаты ПЦР являются важным критерием эффективности проводимой специфической химиотерапии.
![Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза [Электронный ресурс]](/i/i/4598/199278.png "Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза [Электронный ресурс] Ефременко Дмитрий Витальевич")
