Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Роль лептотрихий в общей патологии человека 14
1.1. Таксономическое положение Leptotrichia и Leptothrix 15
1.2. Биологические характеристики Leptotrichia 22
1.3. Клиническое значение лептотрихий в патологии человека 27
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Направления исследования 38
2.2. Материал и объект исследования 44
2.3. Методы исследования 47
2.3.1. Микробиологические методы 47
2.3.2. Эпидемиологическая статистика 48
2.3.3. Иммунологические методы 52
2.3.4. Статистические методы 54
Глава 3. Колонизация биотопа полости рта бактериями рода Leptotrichia 59
3.1. Этапы заселения Leptotrichia слизистых полости рта у детей 59
3.2. Распространённость Leptotrichia среди населения региона 70
3.3. Роль иммунной системы в реализации механизмов колонизации полости рта Leptotrichia 3.3.1. Особенности клеточного звена иммунитета 78
3.3.2. Особенности гуморального звена иммунитета 83
3.3.3. Характеристика фагоцитарных реакций и оценка эффективности показателей фагоцитоза 87
3.3.4. Состояние местного иммунитета полости рта 89
Глава 4. Фенотипический профиль региональных изолятов рода Leptotrichia 92
4.1. Морфологический профиль 92
4.1.1. Типы морфоваров Leptotrichia 92
4.1.2. Морфология Leptotrichia при лептотрихиозах СОПР и других патологических процессах 93
4.2. Физиологический профиль 95
4.2.1. Культивирование Leptotrichia и температурный диапазон 95
4.2.2. Типы дыхания Leptotrichia 99
4.3. Изучение факторов патогенности штаммов Leptotrichia 100
4.3.1. Антилизоцимная активность 102
4.3.2. Антиинтерфероновая активность 104
4.3.3. Антикомгшементарная активность 106
4.3.4. Естественная гистадгезивная и коадгезивная активность Leptotrichia 108
4.4. Антибактериальная чувствительность Leptotrichia 118
4.5. Бактерицидная активность антисептических растворов 125
Глава 5. Роль Leptotrichia в патологии полости рта 127
5.1. Лептотрихиоз - определение понятия, клинические проявления и критерии диагностики 129
5.2. Динамика и структура лептотрихиозов и кандидозов СОПР 135
5.3. Возрастное и сезонное распределение встречаемости ЛСОПР 142
5.4. Leptotrichia как маркер поражённости кариесом зубов у детей 148
5.5. Leptotrichia как маркер патологии желудочно-кишечного тракта 162
Заключение 164
Выводы 183
Практические рекомендации 185
Список литературы 187
Приложения 215
- Биологические характеристики Leptotrichia
- Этапы заселения Leptotrichia слизистых полости рта у детей
- Культивирование Leptotrichia и температурный диапазон
- Leptotrichia как маркер поражённости кариесом зубов у детей
Введение к работе
Актуальность исследования. Микрофлора полости рта является высокочувствительной индикаторной системой и нарушение биологического равновесия между макроорганизмом и микроорганизмами нормальной микрофлоры может приводить к развитию патологических процессов. (Царёв В. Н., 2009; Ушаков Р. В., Царев В. Н., 2002; Кондрашова З. Н., 1996; Борисов Л. Б., Фрейдлин И. С., 1987). Одной из актуальных проблем современной стоматологии продолжают оставаться воспалительные заболевания слизистых оболочек полости рта (Боровский Е. В., 2001; Engelkirk P. G. et al 1992). Этиологическими агентами этих процессов являются условно-патогенные микроорганизмы, большинство которых – представители нормальной микрофлоры организма человека (Воробьев А. А., 1994; Кочемасова З. Н. и соавт. 1988 г.; Колесов А. П. и соавт., 1989). Микроорганизмы полости рта становятся источником потенциально патогенных возбудителей кариеса, гингивита, стоматита, острых воспалительных заболеваний слизистых полости рта (Царёв В. Н., 2007; Борисов Л. Б., Фрейдлин И. С., 1987). Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы могут способствовать изменению защитных сил организма и приводить к возникновению воспалительных заболеваний полости рта (Бухарин О.В. 2006; Кулагина Г. М. 2004; Бухарин О. В., 2002; Мороз А. Ф. 2001).
Актуальность настоящей работы определяется распространием в регионе Хабаровского края РФ воспалительных заболеваний слизистых оболочек полости рта /СОПР/, вызванных Leptotrichia buccalis и недостаточной изученностью этих микроорганизмов. Рост числа больных, длительность заболевания, устойчивость к терапии, требуют детального изучения биологических особенностей бактерий рода Leptotrichia, подтверждения их этиологической значимости в развитии лептотрихиозов как локальной Leptotrichia-инфекции. Анализ литературы показал, что отсутствуют данные о частоте выделения возбудителя лептотрихиоза, нет четкого критерия, указывающего на диагноз лептотрихиоз слизистых оболочек полости рта. В практических лабораториях края не ведутся бактериологические исследования лептотрихиозов в связи с отсутствием алгоритма диагностики заболевания. Биологические особенности рода Leptotrichia в регионе изучены мало, данных о колонизации полости рта, факторах патогенности микроорганизмов, изучение чувствительности к антибиотикам и антисептикам не обнаружено.
Данные об иммунобиологических изменениях при лептотрихиозе слизистых оболочек полости рта /ЛСОПР/ противоречивы.
Из вышесказанного следует, что исследование проблемы лептотрихиоза в нашем регионе, состояния иммунного статуса больных ЛСОПР, и, прежде всего, биологических характеристик Leptotrichia buccalis, является высоко значимым и актуальным. Поэтому мы сочли целесообразным исследовать штаммы Leptotrichia buccalis, циркулирующие в регионе Хабаровского края.
Цель исследования состояла в углублённом изучении биологических особенностей потенциальных патогенов рода Leptotrichia, выявлении их этиологической значимости в патологии полости рта.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи.
Задачи исследования:
-
Выявить роль представителей рода Leptotrichia в патологии полости рта с учётом их естественного ресурса и таксономии. Исследовать частоту встречаемости лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта, выяснить взаимосвязь Leptotrichia buccalis со степенью активности кариеса зубов у детей и патологией желудочно-кишечного такта.
-
Изучить этапы колонизации анаэробами слизистых оболочек полости рта у детей, распространённость Leptotrichia buccalis среди населения региона, разработать способ культивирования Leptotrichia.
-
Исследовать роль иммунной системы в реализации механизмов колонизации и распространённости Leptotrichia в биотопе полости рта.
-
Определить фенотипический профиль Leptotrichia buccalis, факторы патогенности, персистентности, чувствительность к антимикробным химиопрепаратам.
Научная новизна работы
1. Впервые формально обосновано употребление термина «лептотрихиоз» слизистых оболочек полости рта для определения локальных Leptotrichia-инфекций.
2. Исследованы этапы заселения Leptotrichia и другими анаэробами полости рта новорожденных и детей в регионе, впервые изучена и доказана всеобщая распространённость Leptotrichia buccalis среди населения Хабаровского края.
3. Разработан новый способ культивирования Leptotrichia buccalis на искусственной питательной среде «Уриселект».
4. Выделены региональные штаммы Leptotrichia buccalis, изучены их факторы персистенции, адгезивный потенциал, исследована продукция ими -лактамаз. Определена региональная антибиотикограмма лептотрихий. Показано, что высокая биологическая пластичность микроорганизмов, колонизирующих слизистые оболочки, и высокая чувствительность слизистых к воздействию микроорганизмов позволяют использовать изменения в их состоянии как критерий оценки риска заболевания лептотрихиозом.
5. Выявлена взаимосвязь Leptotrichia buccalis с риском развития суб/декомпенсированной степеней активности кариеса зубов у детей и повышением риска развития патологии желудочно-кишечного тракта: гастродуоденита, язвенной болезни желудка и 12-ти перстной кишки.
6. Проведено сравнительное изучение факторов патогенности (адгезивной, антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активности) у штаммов Leptotrichia buccalis, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, при исследовании микробиоценоза полости рта у больных ЛСОПР.
7. Выявленные изменения иммунного статуса у больных лептотрихиозами позволяют оценить реализацию механизмов колонизации и распространённости лептотрихий в биотопе полости рта, обосновать критерии развития лептотрихиоза, прогнозирования рецидивирующих форм заболевания.
Практическая значимость:
Результаты исследований позволили обосновать необходимость микробиологического исследования микрофлоры полости рта для выявления ранних нарушений микробиоценоза организма в условиях развития лептотрихиоза. В ходе проведенных исследований от больных лептотрихиозами слизистых оболочек полости рта выделены региональные изоляты бактерий Leptotrichia buccalis, изучены их морфологические, культуральные, колонизационные свойства, дана оценка чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам.
- Доказана этиологическая роль бактерий Leptotrichia buccalis как возбудителей локальных Leptotrichia-инфекций - лептотрихиозов СОПР.
- Обосновано использование и внедрены в работу учреждений Министерства здравоохранения края термин Leptotrichia buccalis v.s. Leptothrix buccalis и термин «лептотрихиоз» v.s. «лептотрихоз».
- Изучение биологических свойств Leptotrichia buccalis можно использовать для обнаружения ранних признаков изменения защитных сил организма, оценки степени тяжести поражения слизистых при лептотрихиозах, риска перехода ЛСОПР в хроническую форму и коррекции выявленных нарушений у больных.
- Дана комплексная оценка изменения показателей иммунного статуса при острых и хронических формах лептотрихиозов СОПР. Полученные результаты являются основанием для включения иммунобиологических критериев в прогнозирование хронизации инфекционного процесса и/или развития лептотрихиозов у иммунокомпрометированных лиц.
- Разработаны методические рекомендации по оценке адгезивной активности лептотрихий, которые внедрены в работу ГУЗ Хабаровского края и помогают в диагностике лептотрихиозов СОПР.
- Зарегистрированы 2 заявки на изобретение в ФИПС: «Способ лечения хронических рецидивирующих воспалительных заболеваний, вызванных лептотрихиями», № 200913268/14 (045691) от 21.08.2009 г. и ««Способ культивирования Leptotrichia на искусственной питательной среде «Уриселект», № 2010110394 (014610) от 18.03.2010 года, 7 рационализаторских предложений.
- Результаты научно-исследовательской работы внедрены в работу 8 государственных учреждений Министерства здравоохранения Хабаровского края, Военного госпиталя МВД РФ г. Хабаровска, ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН НИИ Охраны материнства и детства.
- Результаты исследовательской работы внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, стоматологии детского возраста, инфекционных болезней и эпидемиологии ДВГМУ, включены в программу усовершенствования врачей-бактериологов ФПК и ППС ДВГМУ, ГУЗ Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения Хабаровского края в качестве лекционного и дополнительного учебно-методического материала.
Апробация материалов диссертации.
Материалы диссертации доложены на различных научных форумах международного, всероссийского, межрегионального уровня: 11-ом Международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии-России и стран Северо-восточной Азии (Ниигата, Япония, 2004), 12-ом Международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии-России (Красноярск, 2005), научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию НГМА «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2005), межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию стоматологической службы республики Саха (Якутия) «Актуальные проблемы и перспективы развития стоматологической службы» (Якутск, 2005), областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской стоматологии в Амурской области» (Благовещенск, 2006), всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», посвящённой 55-летию Читинской гос. медицинской академии (Чита, 2008), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 50-летию стоматологического факультета Кемеровской государственной медицинской академии, (Кемерово, 2009), научно-практической конференции «Актуальные проблемы стоматологии», посвящённой 30-летию стоматологического факультета Дальневосточного государственного медицинского университета (Хабаровск, 2009), XI международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2009).
Результаты диссертационного исследования обсуждены на заседаниях общества бактериологов Хабаровского края 2005-2009 г.г., на расширенном межкафедральном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, инфекционных болезней и эпидемиологии, детских инфекционных болезней, стоматологии детского возраста, нормальной физиологии, гистологии, патологической физиологии, ДВГМУ, ЦНИЛ ДВГМУ, ФГУН «Хабаровский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора», ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН НИИ Охраны материнства и детства, 12 мая 2010 года, протокол № 5.
Личный вклад автора. Автором осуществлена систематизация и анализ материалов по частоте выявляемости и структуре лептотрихиозов. Лично автором проведено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам штаммов лептотрихий. При непосредственном участии автора подготовлены и проведены иммунологические исследования, все методы статистической обработки выполнены автором лично. Подготовлены публикации, рационализаторские предложения и заявки на изобретения. Доля участия в накоплении материала составляет 85%, в обобщении материала – до 100%.
Протокол научно-плановой комиссии № 8 от 18 мая 2004 года.
Номер государственной регистрации темы: 01.2.007 00903.
Публикации:
По теме настоящей диссертации опубликовано 16 научных статей, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 2 методических пособия.
Объём и структура диссертации:
Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций для внедрения результатов работы в медицинскую науку и практику здравоохранения, учебный процесс и приложений. Список литературы содержит 263 источника, из которых 90 отечественных и 173 иностранных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Leptotrichia buccalis являются потенциальными патогенами человека, вызывающими лептотрихиозы слизистых оболочек полости рта. Заселение представителями рода Leptotrichia полости рта у детей в основном происходит в период после прорезывания зубов. Leptotrichia можно отнести к маркерным микроорганизмам для выявления риска развития суб/декомпенсированных форм кариеса зубов у детей и развития гастродуоденита и язвенной болезни желудка и 12-ти перстной кишки.
2. Leptotrichia buccalis из числа региональных изолятов обладают выраженным патогенным потенциалом: ведущими факторами персистенции, адгезивной и коадгезивной активностью. Leptotrichia чувствительны к -лактамным антибиотикам, цефалоспоринам, метронидазолу, проявляют устойчивость к аминогликозидам, фторхинолонам, макролидам, продуцируют бета-лактамазы.
3. Частота встречаемости лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта за многолетний период увеличилась, возрастает число микст-инфекций и хронических форм. Возрастное распределение - лептотрихиозы СОПР характерны для лиц старше 46 лет и детей 1-3 лет, сезонность весенне-летняя.
4. Иммунобиологические изменения показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета могут стать достоверными критериями прогноза развития лептотрихиоза и/или перехода заболевания в хроническую форму.
Биологические характеристики Leptotrichia
Leptotrichia по морфологии прямые или слегка изогнутые палочки/ «пруты» шириной 0,8-1,5 мкм и длиной 5-15 мкм (rod /англ./ - прут, палочка). Концы палочек могут быть закруглены или заострены, клетки могут объединяться в септированные нити различной длины до 200 мкм. Палочки обычно располагаются парами, соприкасающиеся концы уплощены.
Leptotrichia неподвижные, грамотрицательные, неспорообразующие организмы. Клеточная стенка грамотрицательного типа, но отличается от типичной [35]. У молодых культур клеточная стенка грам-положительная, что затрудняет правильную идентификацию. Старые культуры грам-негативные, вдоль оси клетки располагаются гранулы, которые могут быть грамположительными [13, 35]. В микропрепарате нитчатые палочки состоят из чередующихся светлых и темных участков, напоминая поперечную исчерченность «шлагбаум» [13].
Robin (1853) описывает Leptotrichia как прямые или изогнутые неподвижные филаменты, концы в виде тупого угла, с аморфногранулярной стромой, ответвлений нет, длиной 0,02-0,1 мм, шириной 0,0005 мм [154].
Trevisan (1879) считал Leptotrichia бактериями, имеющими цилиндрическое тело, более или менее отчётливо соединёнными между собой, их тонкие, длинные, нитевидные, прямые, свободно лежащие клетки напоминают пучок [150]. Leptotrichia вызывают осаждение солей кальция из слюны, тем самым участвуют в формировании зубной бляшки. Бесцветные, окрашиваются йодом в тускло жёлтый цвет[174]. По мнению Американского общества микробиологов (1917), это толстые, длинные, прямые или изогнутые нити, одним концом часто соединены, другой конец суживается. Неподвижны. Нити не ветвятся, иногда содержат гранулы. [150].
Thjerta, Hartmann, В0е (1939) описывали Leptotrichia как прямые или слегка изогнутые палочки длиной около 10 мкм, шириной 0,7-1,2 мкм. Длина очень вариабельна: палочка может быть 3 мкм, нити из культуры, выращенной в жидкой среде до 200 мкм. Как правило, две палочки соединены в один короткий филамент. Имеют суженный и мягко закруглённый конец. Утолщений нет. Две палочки образуют позицию, очень напоминающую фузобактерии. Leptotrichia грам-позитивны в очень молодых культурах, но быстро теряют это качество. Старые культуры грам-негативны.
Hamilton и Zahler (1957) указывали на Leptotrichia как на палочки, 5-15 ц в длину и 1-1,5 ц в ширину. Концы часто заострены. Две или более палочек формируют филаменты. Неподвижны, спор не образуют.
Gilmour, Howell, Bibby (1961) характеризуют Leptotrichia как прямые или слегка изогнутые палочки, концы их тупые или заострены. В молодых культурах, как правило, две палочки соединены в филаменты. В старых культурах нити достигают длины 200 и. Грам-позитивны в молодых культурах, грам-негативны в старых. Старые клетки часто содержат грам-позитивные гранулы. Утолщений и ответвлений нет.
N. Ivanova, S. Gronow, A. Lapidus et al. (2009) описывают Leptotrichia как крупные веретенообразные палочки, неподвижные, неспорообразующие. В молодых культурах, до 6 часов инкубации, грам-позитивные. Содержание Г и Ц в циклической молекуле генома Leptotrichia довольно низкое, 29,7 %. Геном имеет длину 2,345,610 bp/пар азотистых оснований/, состоит из 2367 генов, из которых 2306 кодируют бактериальные белки, 61 ген кодирует рРНК. Идентифицировано 86 псевдогенов. Примерно 64,5% генов предположительно кодируют функции белков [150]. Araujo et al. (1963), Gustafson et al. (1966) дополнительно доказали грам-негативную природу этих организмов, выделив эндотоксин Leptotrichia (Тог Hofstad, 1970).
Таким образом, большинство исследователей указывают, что Leptotrichia — это грам-негативные, прямые палочки, способные образовывать различной длины филаменты, неспорообразующие, неподвижные, в молодых культурах грам-позитивньте, в старых культурах клеточная стенка окрашивается грам-негативно.
Биотопами Leptotrichia, по мнению разных авторов, являются: поверхность языка, межзубные промежутки, полости кариозных зубов, ротовая жидкость, кишечный сок (Robin, 1853), зубы человека и зубы лошади (Trevisan, 1879), кариозные зубы (Trevisan и De Топу, 1879), полость рта (1-ое издание Bergey s manual, 1923; Gilmour, 1961; Е. R. К. Eribe, I. Olsen, 2008; E. Г. Зеленова и соавт., 2004; N. Ivanova, S. Gronow, A. Lapidus et al., 2009) генитоуринарный тракт и кишечник (Е. R. К. Eribe, I. Olsen, 2008; N. Ivanova et al., 2009), слюна, зубной камень (Е. Г. Зеленова, 2004; N. Ivanova et al., 2009), зубная бляшка (М. Reig, F. Baquero et al., 1985), зубной налёт у собак (D. С. Hirsh et al., 1979), зубная бляшка макак Резус, макак Циномолгус (К. S. Lofting, L. R.Brown, В. М. Levy, 1980).
Тип дыхания Leptotrichia по данным Kligler (1915) характеризуется как анаэробный, факультативно аэробный, г=+37С. В первичной изоляции бактерии анаэробы или микроаэрофилы, последующие изоляты растут в аэробных условиях [150]. По сведениям Американского общества микробиологов (1917), Leptotrichia характеризуются как анаэробы или факультативные анаэробы, паразиты или факультативные паразиты [118].
Thjota, Hartmann, В0е (1939); Hamilton и Zahler (1957); Gilmour, Howell, Bibby (1961) дают подробное и точное описание Leptotrichia как анаэробов в первой изоляции, которые растут в 95% N2 и 5% СОг или микроаэрофиллов, некоторые штаммы в последующих пересевах растут в аэробных условиях. Каталаза-негативные [154, 155]. Ферментируют глюкозу, маннозу, сукрозу, левулёзу, обычно ферментируют салицин и трегалозу до кислоты без образования газа. Дульцитол, маннитол и рамнозу, сорбитол и ксилозу не ферментируют. Могут продуцировать кислоту из галактозы, лактозы, глицерола, раффинозы и крахмала, молочную кислоту из глюкозы. Тест Фогес-Проскауэра отрицательный. Желатин не разжижают. Индол не продуцируют. Нитраты могут редуцировать до нитрита. Milagro Reig, Fernando Baquero et al. (1985) характеризуют бактерии как анаэробы, но некоторые штаммы способны расти аэробно в присутствии СОг Согласно 9-ому изданию Bergey s manual (1994), Leptotrichia растут в присутствии 5-10% С02 в жидкой питательной среде с дрожжевым экстрактом (0,3%), глюкозой (0,5%), гидрохлоридом цистеина (0.1%), сывороткой крови (5%), на среде Казаи. На кровяном анаэробном агаре колонии лептотрихий имеют форму «головы медузы», 1-2 мм [58, 170]. Главные продукты жизнедеятельности — DL-молочная (до 90%) и уксусная (до 10%) кислоты [6]. Leptotrichia от фузобактерий отличаются ярко выраженными сахаролитическими свойствами, образованием большого количества молочной кислоты [58, 170]. Ферментируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, маннозу, сахарозу с образованием кислоты без газа, могут ферментировать салицин, трегалозу, галактозу, лактозу, раффинозу, крахмал до кислоты. Не ферментируют арабинозу, дульцит, инулин, глицерин, манит, рамнозу, сорбит, ксилозу. Желатин не разжижают, индол и сероводород не образуют, нитраты не восстанавливают. Строгие анаэробы, t opt=+37C. При т.ниже +25С не растут, ор1 рН среды 7,2-7,4 [35].
Колонии Leptotrichia на кровяном пластинчатом агаре диаметром 0,5-3 мм, выпуклые, непрозрачные, поверхность неровная, напоминает извилины, по структуре редко волокнистые, серовато-коричневые, в старых культурах с тёмным центром, сухой консистенции [150, 170]. N. Ivanova, S. Gronow, A.Lapidus et al. (2009) характеризуют свойства Leptotrichia таким образом: от анаэробов до аэротолерантных, сахаролитики. На среде 104 DSMZ (DSMZ - Deutshe Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen /Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Германия) Leptotrichia образуют бесцветные, гладкие, блестящие, приподнятые над поверхностью колонии, по типу «головы медузы», за счёт филаментозного края, анаэробы в первой изоляции, аэротолерантные в последующих пересевах, и растут они в аэробных условиях или в присутствии СОг Таким образом, основным биотопом Leptotrichia является ротовая полость человека/животных. В большом количестве Leptotrichia обнаруживаются в зубном камне, на поверхности языка, у шейки зуба в десневом желобке. Следующими по значимости биотопами являются генитоуринарный тракт и кишечник человека. По типу дыхания Leptotrichia обычно анаэробы, но некоторые растут в аэробных условиях, в присутствии 5% СС«2, пластичный метаболизм Leptotrichia проявляется в аэротолерантности изолятов. Морфология колоний зависит от питательной среды. Культивируемые штаммы Leptotrichia, способны расти на искусственных питательных средах, их идентифицируют фенотипическими и генотипическими методами. Низкая выделяемость Leptotrichia из биосубстратов связана с трудностями культивирования и дифференциальной диагностики с Fusobacterium и Lactobacillus. Для некультивируемых форм Leptotrichia используются молекулярно-генетические методы идентификации.
Этапы заселения Leptotrichia слизистых полости рта у детей
Известно, что полость рта ребенка, являясь открытой экосистемой, формирует микрофлору под влиянием ряда экзогенных и эндогенных факторов [45, 74, 78, 83]. По данным Е. Кбпбпеп, S. Asikainen, Н. Jousimies-Somer (1992), который исследовал грам-негативные анаэробные бактерии полости рта, у 70% детей в возрасте от 1 до 7 месяцев (средний возраст 3 месяца) до прорезывания зубов бактериологическими методами обнаружены Prevotella melaninogenica, Fusobacterium nucleatum, Veillonella spp., непигментирующие Prevotella spp., Capnocytophaga spp., Prevotella (Bacteroides) intermedia у 60%, 57%, 57%, 13% и 7% детей соответственно. Leptotrichia spp. до прорезывания зубов выделены у 17% детей. После прорезывания зубов колонизация грам-негативными анаэробными бактериями резко увеличивается. У детей (средний возраст 32 месяца) по данным (Е. Kononen, S. Asikainen, М. Saarela et al. (1994) количество Leptotrichia spp. возрастает с 24% до 71% после прорезывания зубов.
Изучали этапы заселения лептотрихиями слизистых оболочек полости рта в 3 группах: первая группа - дети с 14 дней до 7 месяцев, до прорезывания первых резцов (средний возраст 4 месяца), всего 34 ребёнка; вторая группа с 5 до 17 месяцев (средний возраст 14 месяцев), на этапе прорезывания резцов и первых моляров, 32 ребёнка; третья группа с 18 до 34 месяцев, на этапе прорезывания клыков и вторых моляров (средний возраст 28 месяцев), 33 ребёнка. Учитывали титр лептотрихий 102КОЕ/см2 и более.
Результаты микроскопического и бактериологического исследования биоматериала полости рта детей показали, что заселение слизистых Leptotrichia у детей после рождения происходит постепенно и в основном связано с прорезыванием зубов. Корреляционная связь положительная, средняя, г=0,604. По сравнению с данными Kononen Е. et al., 1992, 1994 г.г. о выделении Leptotrichia со слизистых полости рта у 17-24% детей до прорезывания зубов, в нашем регионе лептотрихий обнаружены у 11,76% детей этого возраста путём микроскопии и у 2,94% методом бактериологического выделения.
До прорезывания зубов у детей титр Leptotrichia низкий, после прорезывания зубов титр увеличивается до 103-104 КОЕ/см2 (р 0,01). Бактериологическое подтверждение и микроскопические данные расходятся довольно значительно, что мы относим за счёт трудностей культивирования Leptotrichia. Тем не менее, и по результатам бактериологического метода, и по результатам микроскопии ясно видно, что до прорезывания зубов у детей, колонизация лептотрихиями имеет место примерно у 3%/12%, в то время как после прорезывания в среднем 5 зубов, примерно у 50%/69% детей (р 0,05). После прорезывания большей части зубов Leptotrichia обнаруживается примерно у 73%/98% детей, (р 0,05).
Гистограмма (рис.1) отражает динамику заселения полости рта Leptotrichia у детей до и после прорезывания зубов. Первый столбец гистограммы отражает среднее количество зубов у детей М±т, выраженное в процентах от возрастной нормы /20 зубов/ соответственно периоду 2,5 года. Микроскопически Leptotrichia выявлялись у 97,8% обследованных к 2,5 годам после прорезывания зубов, микробиологическое выделение составило 81,6%.
В трёх группах детей изучали зависимость сроков колонизации Leptotrichia слизистых полости рта у детей от различных причин, отличных от прорезывания зубов. Прежде всего, исследовались такие факторы, как грудное и искусственное вскармливание, гигиена полости рта с оценкой индекса гигиены по Фёдорову-Володкиной, использование пустышки, как постоянное, так и время от времени, а также патология желудочно-кишечного тракта и наличие сахарного диабета у родителей и ближайших родственников - бабушки, дедушки, тёти, дяди.
Нами установлено, что искусственное вскармливание служит фактором, приводящим к отсрочке заселения полости рта детей анаэробными микроорганизмами, прежде всего Leptotrichia, корреляционная связь отрицательная, умеренная г= -367. Грудное вскармливание способствует естественному заселению полости рта лептотрихиями, корреляционная связь положительная, сильная г=0,754. Использование пустышки постоянно или время от времени достоверно не оказывает влияния на колонизацию облигатными анаэробами полости рта, корреляционная связь отрицательная, слабая, г= -251. В то же время имеется очень сильная положительная корреляционная связь между сроками колонизации Leptotrichia и патологией ЖКТ у родственников ребёнка. Все 100% детей, у которых в регионе города Хабаровска до прорезывания зубов обнаруживаются Leptotrichia, по данным амбулаторных карт и опроса родителей, имелись близкие родственники/родители с патологией ЖКТ: язвенной болезнью желудка и 12-ти перстной кишки, хроническими формами гастрита, гастродуоденита, колита, г=0,998. Сахарный диабет у родственников ребёнка влияет на колонизацию лептотрихиями полости рта, но незначительно, степень корреляции очень слабая, положительная, г=0,124.
Удовлетворительный уход за полостью рта ребёнка является фактором, препятствующим активной колонизации слизистых полости рта детей Leptotrichia, корреляционная связь отрицательная, слабая, г=-578. Общая характеристика корреляционных связей дана (по Ивантер Э.В., Коросову А.В., 1992).
Исследованные корреляционные связи отражены в рисунке 2.
В данных трёх группах детей проводили одновременно исследование и анализ заселения слизистых оболочек другими представителями микрофлоры полости рта, в зависимости от срока прорезывания зубов. Качественный и количественный состав микрофлоры полости рта проводили по методике Н. Haenel. Материал забирали натощак или через 3-4 часа после еды. В день взятия пробы обследуемому ребёнку не чистили зубы при их наличии, не применяли лекарственных средств и не полоскали рот. Техника взятия пробы биоматериала была следующая: смыв с тканей полости рта осуществляли одним стерильным тампоном фирмы «Сорап» в последовательности от внутренних поверхностей щёк, неба и дорсальной спинки языка (особенно тщательно протирали заднюю треть спинки языка в связи с тем, что она является естественным биотопом лептотрихий). Для определения общей микробной обсеменённости из исследуемого материала готовили серию десятикратных разведений в 0,85% растворе хлорида натрия. Из разведений делали высевы на соответствующие пластинчатые питательные среды, как специальные, так и селективные. Первичная микробиологическая карта исследуемых детей была составлена на основании культурального метода выделения микроорганизмов, соотнесённая с результатами идентификации на основании изучения тинкториальных, биохимических, антигенных свойств по общепринятым методикам. Ориентиром для определения нормального состава микробной флоры полости рта явились данные А.И. Левицкого, И.И. Мизиной [8], В.Н.Царёва [49], Е.В. Боровского, Е.В. Леонтьева [11], Е.Г. Зеленовой и соавт. [52].
Культивирование Leptotrichia и температурный диапазон
Способы культивирования бактерий рода Leptotrichia описаны в иностранной литературе, и состоят в использовании жидких и твёрдых питательных сред. Например, изоляция и культивирование Leptotrichia на сердечно-мозговом агаре (Difco) с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта [152, 170, 176], использование сердечно-печёночно-мозгового агара (Difco) с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта M.N. Gilmor, P.A. Hanter (1976), сердечно-мозгового бульона с 0,2% дрожжевым экстрактом (Difco) с добавлением 0,5% глюкозы [146, 152]. Однако авторы указывают на незначительную эффективность высеваемости/всхожести лептотрихий в первичной изоляции, при дальнейших пересевах штаммы теряются, всхожесть их ослабевает и утрачивается. Большинство учёных ссылаются на трудности бактериологической диагностики в связи с прихотливостью Leptotrichia, сложными ростовыми потребностями. Упоминаний о питательных средах для бактериологической верификации Leptotrichia в отечественных источниках не найдено.
Нами предложен способ культивирования бактерий рода Leptotrichia на искусственной питательной среде «Уриселект». Новый способ культивирования позволяет повысить эффективность изоляции Leptotrichia из клинического материала, увеличить качество культивирования микроорганизмов, упростить предварительную предположительную идентификацию Leptotrichia по изменению цвета субстрата, окрашиванию и характерной морфологии колоний, снизить потери штаммов при повторных пересевах, проводить накопление чистой культуры, хранить штаммы Leptotrichia в условиях холодильника при 4С, применить «золотой стандарт» для трудно культивируемых организмов, исследовать фенотипические свойства изолятов и аргументировано подтверждать этиологический фактор инфекционной патологии.
После забора клинического материала из полости рта пациента в кабинете стоматолога его помещали в транспортную среду для анаэробов и в течение 1-2 часов доставляли в бактериологическую лабораторию. Полученный материал разводили стерильным 0,85% физиологическим раствором 1:1000, 1:10000, 1:100000, делая первичные посевы клинического материала калиброванной бактериологической петлей (0,2 мм, ёмкость 0,005 мл) на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом секторных посевов на четыре сектора, каждый раз обжигая петлю, в чашки Петри диаметром 90 мм и далее инкубировали первичные посевы в анаэробных и микроаэрофильных (5% -10% С02) условиях, topt = +35+37С в течение 48-72 часов. В случае отсутствия роста чашки повторно выдерживались еще 24 часа для исключения ложно-отрицательных результатов, вызванных недостаточной инкубацией.
Современная коммерческая питательная среда «Уриселект» является неселективной, агаризированной средой для количественной и качественной оценки бактериурии. Среда позволяет изолировать и подсчитывать все уропатогенные микроорганизмы: E.coli, Enterococcus, Proteus по цвету колоний, оценивать KES-грушгу микроорганизмов (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Biomerieux (Франция), богатая пептоном и триптофаном, в состав которой входит крахмал. Наличие р-глкжуронидазы у бактерий отмечалось окрашиванием колоний в цвета от розового до пурпурного. Активность р-глкжозидазы (эскулиназы) проявлялась в изменении цвета колоний на зеленовато-синие. Использование сред такого типа необходимо для высева культур патогенных и условно-патогенных бактерий, а также удобно для контроля роста анаэробов полости рта в сочетании с микротестами на анаэробные бактерии, и, прежде всего, на лептотрихии.
По нашим данным, колонии Leptotrichia на пластинчатой среде «Уриселект» по размеру точечные и мелкие, диметром от 0,3 до 2 мм, реже достигают средних размеров до 2-3 мм. Окрашены, как правило, в яркий голубой цвет, матовые, в проходящем свете непрозрачные. R-формы колоний напоминают вросшие в агар фигуры цветов, колонии приподняты над поверхностью около 0,1-0,2 мм, не выпуклые, плоские, шероховатые, по консистенции суховатые, бактериальная петля скользит по колонии, забор материала части колонии проводится с трудом. После снятия материала колонии с поверхности среды, в агаре остаётся небольшое углубление. Край колонии неровный, фестончатый, структура колонии мелко волокнистая, при световой микроскопии колоний (увеличение х40) наблюдаются фигуры в форме окружности, по структуре и характеру напоминающие одуванчик голубого цвета, с ризоидньгм краем. Примерно в 20% случаев колонии Leptotrichia имели красно-пурпурный цвет или его оттенки. При этом морфологические свойства колоний были идентичны как по макро-, так и по микроскопическим признакам. Красного цвета колонии чаще при микроскопическом исследовании имели схожесть с розовым одуванчиком из центра которого исходили 3-4 ризоидных извива. Пересевы после 48-72 часового инкубирования при температуре 37оС в термостате, помещали в холодильник и изучали выживаемость бактерий в этих условиях. Выживаемость Leptotrichia при хранении в условиях холодильника на питательной среде «Уриселект» составляла в нашем эксперименте до 14 дней, в то время как по данным литературы, выживаемость Leptotrichia при 4С не превышает 5-7 суток на сердечно-мозговом агаре.
На среде «Уриселект» вырастали колонии других микроорганизмов оромикробиоценоза, окрашенных в цвета от тёмно-голубого до сине-зелёного. По отличающейся морфологии колоний, тинкториальным свойствам изолятов, характерной морфологии бактерий, по дополнительным тестам, пересевам на селективные среды, дифференцировали между Leptotrichia, Veilonella, Lactobacillus, Streptococcus. Колонии Enterococcus имели тёмно-фиолетовый цвет, от 1 до 5 мм, по морфологии круглые, с ровным краем, гладкие, блестящие. Микроскопически крупные грам-позитивные кокки, в скоплениях или цепочках. Колонии Veilonella мелкие, круглые, голубого цвета, выпуклые, гладкие. Микроскопически грам- кокки в упорядоченных скоплениях. Чистые культуры Leptotrichia выращивали в условиях термостата с целью определения температурного диапазона для региональных штаммов. Для этого создавали температуры от +18 С до +45 С, с рангом +2 С.
Ни один изолят рода Leptotrichia не растёт при температуре ниже +22 С и выше +43 С. Оптимум роста у 100% изолятов наблюдали в при температуре +36С+38С. В диапазоне температур +22С+34С дают рост 89% изолятов, в диапазоне +40С+42С - 93% изолята. Для культивирования Leptotrichia использовали температуру, обычную для мезофилов, t=+37C.
Все исследуемые штаммы 48-часовых культур Leptotrichia погибали после нагревания до +60 С в течение 30 минут.
Выживаемость Leptotrichia на питательной среде «Уриселект» при температуре холодильника 4С, составила 14 суток, что в среднем в 2 раза превышает показатели выживаемости на других питательных средах.
Leptotrichia как маркер поражённости кариесом зубов у детей
Комплексное стоматологическое обследование полости рта детей позволило выявить основные закономерности течения кариеса зубов, характер распределения степеней активности, провести ранжирование факторов риска и определить взаимосвязи. Для стандартизации результатов были взяты ключевые группы 3, 6 и 12 лет детей согласно рекомендациям ВОЗ.
В результате проведённых исследований была выявлена высокая распространённость кариеса среди детей 3-12 лет Хабаровского края, в среднем 95,45 ± 0,192%. Средняя интенсивность поражения кариесом зубов у детей 6-12 лет для компенсированной формы составляет 4,904±0,089 зубов, для субкомпенсированной и декомпенсированной форм кариеса 6,817±0,024 и 9,193±0,37 соответственно. Средняя интенсивность кариеса в детских группах 12 лет составляет 5,64±0,17 при средних показателях по Российской Федерации 2,91. Распространённость кариеса зубов у детей 3 лет составляет для городского 67,3% и сельского некоренного детского населения 72,4% (р 0,05).
Во второй группе исследуемых детей 6 лет, среди городского и сельского населения распространённость кариеса возрастала до 88% и 94%, интенсивность кариеса статистически достоверно (р 0,05) отличалась и составляла для группы городских детей 5,97, для группы сельских детей 8,01, в среднем 6,99±0,07.
Ещё более высокие показатели интенсивности кариеса были характерны для этнического населения Нанайского района и, несмотря на то, что средние показатели интенсивности составляли 6,753±0,26, 44,4% детей в этой группе страдали декомпепсированной формой (индекс КПУ 9 и более) кариозной болезни с интенсивностью кариеса 10,545± 0,398.
В третьей группе детей 12 лет распространённость кариеса достигает 91-97%, за счёт удельного веса нанайского населения, с другой стороны, интенсивность кариеса зубов преимущественно проявляется субкомпенсированными формами, которые достигают 49,88%, при поражении 9,91±0,22 зубов, средние значения интенсивности кариеса в группе 6,673±0,23.
В отдельные группы были выделены дети с субкомпенсированной и декомпенсировапной формой кариеса в тех же возрастных категориях для получения результатов сравнения со степенью обсеменённости Leptotrichia, морфологическими вариантами Leptotrichia и интенсивностью кариеса зубов у детей. Сравнивали показатели распространённости кариеса зубов с показателями распространённости Leptotrichia в популяции детского населения Хабаровского края.
После прорезывания большей части зубов к 2,5-3 годам Leptotrichia обнаруживается у 72,7% /96,9% детей по культуральным данным и данным микроскопии, в группе детей 3-6 лет Leptotrichia обнаруживается у 97,8% обследованных микроскопически, микробиологическое выделение составляет 81,6%. Высокая частота встречаемости Leptotrichia в полости рта сохраняется с 6 до 12 лет на уровне 79,8%±0,327% в группе городского населения, 83,5%±0,51% в группе сельского населения, 92,4%± 0,33% в группе коренного населения, 80,8%±0,33% в группе русского/пришлого населения (р 0,05). Положительные результаты микроскопии во всех группах значительно превышают положительные результаты культурального выделения Leptotrichia и составляют в среднем более 95% (95,36% ± 0,22%). Эти данные имеют прямую очень сильную корреляционную связь со средними показателями распространённости кариеса (95,5±0,19%), среди детей 6-12 лет в популяции Хабаровского края, г=0,908. В таблице 20 отражена зависимость распространённости Leptotrichia в оромикробиоценозе детей популяции Хабаровского края от показателя распространённости кариеса зубов у детей.
Из таблицы 20 видно, что тесная связь имеется между распространённостью Leptotrichia в полости рта в группах городского, сельского и коренного населения и высокой степенью распространённости кариеса в однородных социально-демографических группах.
Среди многочисленных теорий этиологии кариеса зубов одной из ведущих является микробиологическая, которая доказывает, что при прочих равных условиях кариес зубов не развивается без участия микроорганизмов, прежде всего, кариесогенных — Str. mutans, S. sanguis за счёт их способности к первичной адгезии на поверхность эмали зубов и высокой сахаролитической активности.
Считается доказанным участие лактобактерий в развитии кариеса зубов как активных продуцентов молочной кислоты. Учитывая, что Leptotrichia, являясь постоянным обитателем полости рта и активным микробом-сахаролитиком, продуцирующим большое количество молочной кислоты, способны влиять на патогенез кариеса зубов.
По данным нашего исследования, Leptotrichia обнаруживается в полости рта у детей 3-12 лет более чем в 95% случаев. В то же время у обследованных стоматологом детей распространённость кариеса зубов высокая и достигает 95% среди ключевых групп, рекомендованных ВОЗ. Можно предположить, что, вероятно, Leptotrichia вносит свой вклад в патогенез кариеса и обуславливает агрессивное развитие кариозной болезни у жителей региона. Влияние Leptotrichia на развитие кариеса подтверждается и литературными данными [145]. Для других регионов Российской Федерации не характерно ни столь высокое распространение Leptotrichia, ни столь высокая степень распространённости кариеса зубов среди ключевых групп населения.
В регионе Хабаровского края исследованы и определены многочисленные факторы риска развития кариеса у детей. Например, низкое содержание фтора в воде - 0,01 мг/л, длительный холодный период, экстремальные условия проживания, недостаток кальция и витаминов, кариесогенная диета и др. [44, 57, 78, 123]. По результатам данного исследования, высокая распространённость и обсеменённость полости рта Leptotrichia, вероятно, играет заметную роль в поддержании и усугублении кариозного процесса, поскольку коррелирует с распространённостью кариеса в регионе. Однако эта гипотеза требует более углублённого изучения.
С целью определения роли распространённости Leptotrichia в патогенезе кариеса зубов были рассчитаны факторы риска развития различных форм активности кариеса зубов, изложенные в гл.2. Обследованные дети были распределены на три группы в зависимости от степени активности кариозного процесса [29]. Были рассчитаны величины абсолютного, относительного/ОР, атрибутивного/АР риска по факторам, степень влияния которых на развитие кариеса была статистически достоверна (р 0,05, х,2о,05 = 3,84).
Рассчитывали ОР и АР развития кариеса в группах детей с положительными результатами микроскопии соскоба с корня языка, окрашенные методом Грама. Считали не менее 20 полей зрения. Учитывали количество и четыре морфоварианта Leptotrichia:
1. классические палочки, соединенные в пары, 10-15 мкм в длину;
2. удлинённые палочки, 20-25 мкм;
3. филаментоидные формы палочек, 30-40 мкм;
4. нити 50-100 и более мкм.
