Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Характеристика лактофлоры тела человека: биологические свойства и роль в организме (обзор литературы) 11
1.1. Общая характеристика рода Lactobacillus 11
1.2. Факторы, определяющие способность лактобацилл к переживанию в биотопах тела человека ... 18
1.3. Роль лактобацилл в организме человека и обеспечение колонизационной резистентности биотопов 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Общая характеристика, методы выделения и идентификации штаммов, использованных в работе 41
2.2. Методы изучения биологических свойств лактобацилл 45
2.2.1. Метод изучения антилизоцимной активности лактобацилл 45
2.2.2. Метод определения лизоцимной активности лактобацилл 48
2.2.3. Метод определения чувствительности лактобацилл к антибиотикам 48
2.2.4. Метод определения адгезивной способности лактобацилл 49
2.2.5. Метод определения бактериоциногенности и бактериоциночувствительности лактобацилл 50
2.3. Методы статистической обработки полученных результатов 52
ГЛАВА 3. Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных из ротовой полости 53
ГЛАВА 4. Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных из кишечника 67
ГЛАВА 5. Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных из влагалища 81
ГЛАВА 6. Сравнительная характеристика биологических свойств лактобацилл, выделенных из разных биотопов 96
Заключение 108
Выводы 118
Список литературы 120
- Факторы, определяющие способность лактобацилл к переживанию в биотопах тела человека
- Общая характеристика, методы выделения и идентификации штаммов, использованных в работе
- Метод определения бактериоциногенности и бактериоциночувствительности лактобацилл
- Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных из кишечника
Введение к работе
Лактобациллы - один из доминирующих компонентов микрофлоры тела человека (Шендеров Б.А.,1998), чаще всего встречаются в ротовой полости, кишечнике и женском репродуктивном тракте.
Как представители нормофлоры, лактобациллы играют важную роль в поддержании нормального состояния биотопов тела человека, выполняя многообразные функции (Шендеров Б.А, 1998). Известна роль лактофлоры кишечника и женского репродуктивного трактов в обеспечении устойчивости этих биотопов к колонизации патогенными и условно- патогенными микроорганизмами (Ленцнер А.А. с соавт.,1987). Значимо участие лактобацилл в метаболических процессах в тонком и толстом кишечнике (Gustafsson В. Е., 1982; Simon G.L., Gorbach S.L.,1986). Видовой и количественный состав лактофлоры биотопов различен и может изменяться в зависимости от состояния организма (Rosenstein I. J. et al.,1996; Черкасов СВ., 1998).
Изменение содержания лактофлоры является одной из форм дисбиотических нарушений в нормобиоценозах биотопов человека, что позволяет использовать количественную характеристику лактобацилл в качестве одного из основных диагностических критериев при оценке состояния кишечника и женского репродуктивного тракта (Соколова К.Я. с соавт.,1988). Кроме количественных сдвигов наблюдается изменение видового состава, которое выражается как в появлении или исчезновении видов лактобацилл, так и в повышении или снижении их удельного веса в микробиоценозе. В то же время качественные характеристики лактофлоры при дисбиотических состояниях различных экониш до сих пор не изучены.
С другой стороны, в мировой литературе имеются данные, свидетельствующие о возможности развития микроэкологических нарушений и на фоне нормального содержания лактофлоры (Pahlson С, Larsson P.G.,1991). К сожалению, отсутствует комплексный подход в изучении биологических свойств лактобацилл, что не позволяет практически оценить состояние лактофлоры различных биотопов тела человека. Поэтому важным представляется изучение свойств лактобацилл, которые могли бы служить дополнительными диагностическими критериями при дисбиотических состояниях.
Не выяснены механизмы выживания лактобацилл в биотопах тела человека в условиях постоянного воздействия большого количества клеточных и гуморальных факторов защиты организма (Seow W.K. et al., 1992;NarhiT.O.etal.,1994).
В последние годы появились данные, свидетельствующие, что ряд представителей аутохтонной микрофлоры тела человека обладает факторами персистенции (Валышев А.В., 1996; Елагина Н.Н., 2000), способствующими длительному переживанию этих микроорганизмов в организме хозяина, хотя у лактобацилл эти свойства не описаны.
Открытым остаётся вопрос о роли видового состава и биологических характеристик лактобацилл в формировании эу - и дисбиотических состояний экониш человека. В этой связи интерес представляют особенности видового состава и комплекса биологических характеристик лактобацилл различных биотопов человека в норме и в условиях сниженной колонизационной резистентности. Решение этого вопроса позволило бы разработать дополнительные критерии определения состояния биотопов, а также расширить представления о роли лактобацилл в формировании нормо - и патобиоценозов.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение видового состава и биологических свойств лактобацилл, выделенных из ротовой полости, кишечника и женского репродуктивного тракта в норме и при дисбиотических состояниях, и разработка критериев определения состояния биотопов.
Задачи исследования:
Определить видовой состав оральной, фекальной и вагинальной лактофлоры людей и сравнить его качественные и количественные характеристики в норме и при дисбиозах.
Оценить комплекс биологических характеристик (антилизоцимную активность, лизоцимную активность, адгезивную способность, антибиотикорезистентность, бактериоциногенность, бактериоциночувствительность, рН) лактобацилл, выделенных из разных биотопов человека.
Разработать метод определения колонизационной резистентности биотопов человека.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые на основе использования единых методических подходов прозедено комплексное изучение биологических характеристик лактобацилл, изолированных из разных биотопов человека в норме и при дисбиозах.
Представлена сравнительная оценка колонизирующей способности лактобацилл в зависимости от состояния микробиоценоза и источника их выделения.
Установлено, что колонизирующая способность лактобацилл связана с выраженностью их адгезии и антилизоцимной активности.
Показатель микробной обсеменённости (ПМО) прямо коррелировал со значениями указанных признаков. Микроорганизмы, выделенные в норме, характеризовались не только выраженным колонизирующим потенциалом, но и высокой лизоцимной активностью и низкой антибиотикорезистентностью по сравнению со штаммами, выделенными при дисбиозе. Высокие значения биологических свойств лактобацилл, определяющие их колонизирующую способность, были характерны для всех штаммов выделенных у лиц с высоким ПМО.
Отмечено, что адгезивная способность и антилизоцимная активность лактобацилл наиболее выражены у вагинальных штаммов изолированных от здоровых и характеризуют их как основную микрофлору в биотопе.
Оценено значение бактериоциногении и
бактериоциночувствительности в формировании видовой структуры лактофлоры. Наиболее часто встречающиеся виды лактобацилл характеризовались высокой бактериоциногенией и низкой бактериоциночувствительностью.
Представлена характеристика микроэкологического статуса в зависимости от видового состава лактофлоры. Установлено, что вид L. fermentum наиболее характерен для нормомикробиоценозов, а вид L. rhamnosus чаще выделяется при дисбиозах.
Для оценки стабильности состояния микробиоценозов предложен «Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека» (Патент на изобретение № 2175673 от 10.11.2001), основанный на выявлении антагонистического действия аутохтонных микроорганизмов по отношению к тест - штаммам (S.aureus и E.coli).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Полученные результаты расширяют знания в области микроэкологии, способствуя пониманию механизмов формирования лактофлоры тела человека.
Практическая ценность работы характеризуется возможностью использования биологических характеристик лактофлоры для дифференциации штаммов по их колонизирующей способности и изучения состояния микробиоценозов.
Для повышения эффективности ранней диагностики дисбиотических состояний в клинической и лабораторной практике рекомендован разработанный «Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека», для определения уровня колонизационной резистентности биотопов человека.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Лактофлора различных биотопов человека в норме и при дисбиозах характеризуется особенностями видового состава лактобацилл и свойств внутриродового антагонизма.
Колонизирующий потенциал лактобацилл зависит от выраженности адгезивной способности и их антилизоцимной активности и определяет формирование микробиоценозов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Результаты проведенных исследований доложены на II Российской конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 1997), областной научно-практической конференции врачей-
бактериологов (Оренбург, 1999), конференции «Репродуктивное здоровье населения, микробиологические и иммунологические аспекты» (Оренбург, 1999), региональной конференции молодых учёных и специалистов (Оренбург, 1999), III Российской конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 2000).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, получен патент на изобретение № 2175673 от 10.11.2001 "Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека".
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 55 отечественных и 177 иностранных научных источников. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 16 рисунками.
Факторы, определяющие способность лактобацилл к переживанию в биотопах тела человека
Лактобациллы относятся к резидентным микроорганизмам, формирующим пристеночную микрофлору различных экониш тела человека. Одним из наиболее значимых механизмов, определяющих способность лактобацилл переживать в организме человека, является их способность адгезироваться на слизистых оболочках (Lee Y.K., Salminen S., 1995). Видовая и анатомическая специфичность адгезии лактобацилл столь выражена, что, например, штаммы, выделенные из слепой кишки крыс не способны фиксироваться к эпителиальным клеткам кишечника других животных (Шендеров Б. А., 1998).
Существует несколько механизмов, определяющих способность лактобацилл адгезироваться на слизистых оболочках тела человека. Наиболее хорошо изученными на данный момент являются механизмы, позволяющие лактобациллам фиксироваться на эпителиальных клетках желудочно- кишечного тракта (Тарабрина Н.П., 1980; Kirjavainen P.V. et al., 1998; Rinkinen M. et al., 1999), и существенно меньше сведений касается штаммов, выделяемых из ротовой полости и женского репродуктивного тракта. Так, на примере кишечных штаммов, подробно описаны специальные органеллы - адгезины, с помощью которых происходит фиксация штаммов на поверхности эпителия. Адгезины лактобацилл представлены ресничками диаметром от 0,02 до 0,06 мкм и длиной до 1 мкм. Реснички расположены радиально и входят в состав особого внеклеточного, поверхностного субслоя с диффузной структурой - гликокаликса (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я.,1996). Поверхность лактобацилл может нести как минимум два вида адгезинов, один из которых активен только в присутствии ионов кальция. Активность второго вида не зависит от Са ++ (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я.,1996). Адгезины лактобацилл чаще всего имеют белковую и полисахаридную природу. Рядом учёных было продемонстрировано, что обработка бактериальных клеток протеазами заметно снижает их адгезивную способность, что подтверждает наличие белковых адгезинов (Chauviere G.,1992; Cocconier M.-H.et al., 1992; Bernet et al., 1993; Greene and Klaenhammer T.R., 1994; Adlerberth et al., 1996). С другой стороны, было доказано, что адгезины могут иметь и полисахаридную природу у некоторых штаммов, так как окисление углеводов метапериодатом также приводит к угнетению адгезии (Green J.R., Klaenhammer T.R., 1994). Conway P.L. и Henriksson F. (1992), изучавшие природу компонентов, ответственных за адгезию различных штаммов L.fermentum к поверхности эпителиальных клеток, выявили, что у одних штаммов процесс адгезии зависел от наличия протеина, ассоциированного с клеточной стенкой, в то время как другие представители рода L.fermentum секретировали продукт белковой природы.
Установлено, что многие штаммы L. casei и L.plantarum имеют выраженный добавочный слой - гликокаликс, который можно рассматривать в качестве их адгезина. В то же время штаммы L. fermentum и L.acidophilus гликокаликса не имеют или же он слабо выражен, и адгезия последних связана с другими структурами клеточной оболочки лактобацилл (Брилис В.И., 1983).
Известно, что одним из механизмов адгезии лактобацилл является их связывание с белками внеклеточного матрикса эпителиоцитов человека путём специфических лиганд- рецепторных взаимодействий. Kapczynski D.R. с соавт. (2000), изучавшие способность лактобацилл адгезироваться к эпителиоцитам кишечника экспериментальных животных методом флюоресцентной микроскопии с использованием антифибронектиновых антител, обнаружили, что все исследуемые штаммы локализовались в участках слизистой, где определялся фибронектин.
При изучении способности лактобацилл связываться с некоторыми растворимыми белками и лект-.:нами, Е.М. Горская с соавт. (1994) выявили, что изученные штаммы обладали достаточно высоким уровнем прикрепления к иммобилизованному фибронектину и конканавалину А, причём адгезия лактобацилл к фибронектину находится в обратной коррелятивной связи с адгезией их к муцину.
В результате сравнительного изучения адгезивности лактобацилл к различным типам эпителиальных клеток тонкой и толстой кишки А.Ю.Лихачёвой с соавт. (1991) обнаружено, что большинство штаммов лактобацилл обладает более высокой адгезией к колоноцитам, чем к энтероцитам, что свидетельствует о наличии большего количества рецепторов к адгезинам лактобацилл на колоноцитах по сравнению с энтероцитами. Какой либо достоверной разницы в прикреплении лактобацилл к эпителию пейеровых бляшек и рядом расположенных зон установлено не было.
Изучение способности лактобацилл адгезироваться к эпителиоцитам толстого кишечника, изолированным у людей разных возрастных групп выявило, что все штаммы в гораздо большем количестве адгезировались к клеткам слизистой взрослых по сравнению с детьми и новорожденными (Kirjavainen P.V.et al., 1998).
Была выявлена способность Lactobacillus plantarum адгезироваться и непродолжительное время существовать на поверхности миндалин людей (Stjernquist-Desatnik А. С соавт.,2000). Способность лактобацилл адгезироваться зависит от многих моментов и может изменяться под воздействием тех или иных факторов (Шендеров Б.А., 1998). При изучении влияния изменения рН на адгезивный процесс было выявлено, что при рН 5,5 адгезия бактерий к энтероцитам пейеровых бляшек или достоверно повышается, или имеет тенденцию к возрастанию (Лихачёва А.Ю.,1991). Вероятно, продукция лактобациллами молочной кислоты служит одним из факторов, способствующих адгезии этих микроорганизмов.
К основным факторам, определяющим адгезивную способность лактобацилл женского репродуктивного тракта, можно отнести содержание гликогена в эпителиальных клетках и гормональный статус. В работе Брилене Т. А. (1988) были представлены результаты, демонстрирующие, что половые гормоны могут оказывать влияние на адгезивность лактобацилл in vitro, причём изменение адгезивных свойств зависело от свойств штамма, вида и концентрации препарата. Брилис В.И. с соавт. (1985) показано, что адгезивные свойства лактобацилл ингибируются под действием ряда антибиотиков. Так, адгезивность лактобацилл под действием карбенициллина снижалась в среднем до 54%, пенициллина - до 66%, ампициллина - до 70% и бициллина - до 73% от исходного уровня. Ouwehand А.С. с соавт. (2000) было продемонстрировано, что адгезивная способность лактобацилл не изменяется после воздействия ультрафиолетового излучения, но может снижаться в результате кипячения, автоклавирования, обработки пепсином и трипсином (Tuomola Е.М. et al., 2000).
Общая характеристика, методы выделения и идентификации штаммов, использованных в работе
Набор исследуемого материала проводили на базе отделения челюстно-лицевой хирургии муниципальной 1 городской клинической больницы скорой помощи, отделения гастроэнтерологии МСЧ №1 «Оренбурггазпром» и Оренбургского областного Центра планирования семьи и репродукции.
Материалом для исследования послужил 601 штамм лактобацилл. Было выделено 176 штаммов из ротовой полости 68 здоровых людей и 52 больных хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом (96 штаммов от здоровых и 80- от больных), и 169 штаммов - из фекалий 105 человек с дисбактериозом кишечника. Из женского репродуктивного тракта было изолировано 256 штаммов, из которых 116 штаммов от 73 здоровых, а 140 - от 93 больных женщин, страдающих дисбактериозом влагалища.
Для выделения чистых культур лактобацилл из ротовой полости собирали содержимое защёчных мешков стерильным тампоном, смоченным в физиологическом растворе, и высевали на плотную селективную питательную среду LBS ("Difco", США) не позднее 2 часов с момента взятия материала. Рассев производили бактериологической петлей методом секторных посевов в соответствии с рекомендациями Ю.М. Фельдман с соавт. (1984). Посевы инкубировали 48 часов при 37 С в микроаэрофильных условиях. Для выделения чистых культур лактобацилл из женского репродуктивного тракта вагинальное содержимое собирали из заднего свода влагалища тампоном и рассевали вышеописанным способом. Количество бактерий на 1 мл исследуемого материала подсчитывали по таблице Ю.М. Фельдман с соавт. (1984). Результаты исследований представляли в lg колониеобразующих единиц на 1 мл исследуемого материала. На основании учета бактериальной обсеменённости выделяли 3 степени дисбиоза влагалища.
Дисбиоз I степени (умеренный) характеризовался незначительным снижением количества лактобацилл до lg 4 - lg З КОЕ/мл. Дисбиоз II степени (выраженный) - снижением количества лактобацилл до lg 2 КОЕ/мл. Дисбиоз III степени - резким угнетением лактофлоры до полного ее отсутствия. Для выделения чистых культур лактобацилл и количественного определения обсеменённости толстого кишечника использовали метод Р.В.Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1977). Из исследуемого материала готовили десятикратные разведения от 102 до 108 на физиологическом растворе. Из каждого разведения делали посевы по 0,1 мл на плотную селективную среду LBS и культивировали, как было описано ранее. Количественное содержание лактобацилл в 1 г фекалий определяли по числу выросших на питательной среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения по формуле: N= n-k-d, где N - количество микроорганизмов в 1 г фекалий, КОЕ/г; п - число колоний, выросших на питательной среде; к - коэффициент посевной дозы (при посеве 1 мл к = 1, при посеве 0,1 мл к = 10, при посеве 0,05 мл к = 20); d - степень разведения посевного материала. Степень дисбактериоза оценивали в соответствии с методическими рекомендациями "Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника" (М, 1986). Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Все выделенные штаммы принадлежали к роду Lactobacillus, так как являлись неподвижными, грамположительными, неспорообразующими, каталазонегативными палочками, способными утилизировать глюкозу. Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов использовали плотную питательную среду с 0,3% бромкрезолового зелёного, предложенную Т.В. Карки с соавт. (1994), с добавлением следующих углеводов и шестиатомных спиртов: глюкозы, арабинозы, фруктозы, галактозы, лактозы, мальтозы, маннита, маннозы, рамнозы, сорбита, сахарозы, раффинозы, ксилозы, целлобиозы (Sigma, Германия). Для проведения идентификации 0,1 г каждого из углеводов разводили в 1 мл дистиллированной воды, добавляли 9 мл вышеуказанной среды и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего и тщательно высушенного агара, содержащего каждый из углеводов, бактериологической петлёй наносили взвеси 109 КОЕ/мл исследуемых штаммов. После культивирования при 37 С в течение 24 часов в микроаэрофильных условиях оценивали способность исследуемых штаммов утилизировать углеводы по изменению цвета среды вокруг колоний с зелёного на жёлтый. Определение видовой принадлежности изучаемых штаммов проводили по таблице 2.
Изучение антилизоцимной активности лактобацилл проводили по методике Б.Я. Усвяцова (1986) в модификации В.Ю. Соколова и А.П. Луда (1987). Для этого взвесь бактериальной культуры троекратно отмывали в физиологическом растворе, суспендировали в 0.2 М фосфатном буфере (рН= 6,2) до оптической плотности 0,5 ед. на фотометре "Домбиплейт"("Элми", Латвия, А==540 нм). Полученную взвесь в трёх параллельных пробах смешивали в равных объёмах (0,5: 0,5 мл) с раствором яичного лизоцима (объединение "Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова, ФАО "Ферейн", г. Москва) на 0.2 М фосфатном буфере (рН= 6,2) в концентрации 20 мкг/ мл так, что конечная концентрация в пробе составляла 10 мкг/мл. В качестве первой контрольной пробы использовали 0.2 М фосфатный буфер (рН= 6,2), в качестве второй контрольной пробы - смешанные в равных объёмах (0,5: 0,5 мл) 0.2 М фосфатный буфер и рабочий раствор лизоцима. После инкубации при 37С в течение 30 минут бактериальные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/ мин и в надосадочной жидкости по степени изменения оптической плотности взвеси тест-штамма определяли остаточную концентрацию лизоцима. В качестве тест-штамма использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus NCTC 2665.
Метод определения бактериоциногенности и бактериоциночувствительности лактобацилл
Набор исследуемого материала проводили на базе отделения челюстно-лицевой хирургии муниципальной 1 городской клинической больницы скорой помощи, отделения гастроэнтерологии МСЧ №1 «Оренбурггазпром» и Оренбургского областного Центра планирования семьи и репродукции.
Материалом для исследования послужил 601 штамм лактобацилл. Было выделено 176 штаммов из ротовой полости 68 здоровых людей и 52 больных хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом (96 штаммов от здоровых и 80- от больных), и 169 штаммов - из фекалий 105 человек с дисбактериозом кишечника. Из женского репродуктивного тракта было изолировано 256 штаммов, из которых 116 штаммов от 73 здоровых, а 140 - от 93 больных женщин, страдающих дисбактериозом влагалища.
Для выделения чистых культур лактобацилл из ротовой полости собирали содержимое защёчных мешков стерильным тампоном, смоченным в физиологическом растворе, и высевали на плотную селективную питательную среду LBS ("Difco", США) не позднее 2 часов с момента взятия материала. Рассев производили бактериологической петлей методом секторных посевов в соответствии с рекомендациями Ю.М. Фельдман с соавт. (1984). Посевы инкубировали 48 часов при 37 С в микроаэрофильных условиях. Для выделения чистых культур лактобацилл из женского репродуктивного тракта вагинальное содержимое собирали из заднего свода влагалища тампоном и рассевали вышеописанным способом. Количество бактерий на 1 мл исследуемого материала подсчитывали по таблице Ю.М. Фельдман с соавт. (1984). Результаты исследований представляли в lg колониеобразующих единиц на 1 мл исследуемого материала. На основании учета бактериальной обсеменённости выделяли 3 степени дисбиоза влагалища. Дисбиоз I степени (умеренный) характеризовался незначительным снижением количества лактобацилл до lg 4 - lg З КОЕ/мл. Дисбиоз II степени (выраженный) - снижением количества лактобацилл до lg 2 КОЕ/мл. Дисбиоз III степени - резким угнетением лактофлоры до полного ее отсутствия. Для выделения чистых культур лактобацилл и количественного определения обсеменённости толстого кишечника использовали метод Р.В.Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1977). Из исследуемого материала готовили десятикратные разведения от 102 до 108 на физиологическом растворе. Из каждого разведения делали посевы по 0,1 мл на плотную селективную среду LBS и культивировали, как было описано ранее. Количественное содержание лактобацилл в 1 г фекалий определяли по числу выросших на питательной среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения по формуле: N= n-k-d, где N - количество микроорганизмов в 1 г фекалий, КОЕ/г; п - число колоний, выросших на питательной среде; к - коэффициент посевной дозы (при посеве 1 мл к = 1, при посеве 0,1 мл к = 10, при посеве 0,05 мл к = 20); d - степень разведения посевного материала. Степень дисбактериоза оценивали в соответствии с методическими рекомендациями "Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника" (М, 1986). Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Все выделенные штаммы принадлежали к роду Lactobacillus, так как являлись неподвижными, грамположительными, неспорообразующими, каталазонегативными палочками, способными утилизировать глюкозу. Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов использовали плотную питательную среду с 0,3% бромкрезолового зелёного, предложенную Т.В. Карки с соавт. (1994), с добавлением следующих углеводов и шестиатомных спиртов: глюкозы, арабинозы, фруктозы, галактозы, лактозы, мальтозы, маннита, маннозы, рамнозы, сорбита, сахарозы, раффинозы, ксилозы, целлобиозы (Sigma, Германия). Для проведения идентификации 0,1 г каждого из углеводов разводили в 1 мл дистиллированной воды, добавляли 9 мл вышеуказанной среды и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего и тщательно высушенного агара, содержащего каждый из углеводов, бактериологической петлёй наносили взвеси 109 КОЕ/мл исследуемых штаммов. После культивирования при 37 С в течение 24 часов в микроаэрофильных условиях оценивали способность исследуемых штаммов утилизировать углеводы по изменению цвета среды вокруг колоний с зелёного на жёлтый. Определение видовой принадлежности изучаемых штаммов проводили по таблице 2.
Изучение антилизоцимной активности лактобацилл проводили по методике Б.Я. Усвяцова (1986) в модификации В.Ю. Соколова и А.П. Луда (1987). Для этого взвесь бактериальной культуры троекратно отмывали в физиологическом растворе, суспендировали в 0.2 М фосфатном буфере (рН= 6,2) до оптической плотности 0,5 ед. на фотометре "Домбиплейт"("Элми", Латвия, А==540 нм). Полученную взвесь в трёх параллельных пробах смешивали в равных объёмах (0,5: 0,5 мл) с раствором яичного лизоцима (объединение "Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова, ФАО "Ферейн", г. Москва) на 0.2 М фосфатном буфере (рН= 6,2) в концентрации 20 мкг/ мл так, что конечная концентрация в пробе составляла 10 мкг/мл. В качестве первой контрольной пробы использовали 0.2 М фосфатный буфер (рН= 6,2), в качестве второй контрольной пробы - смешанные в равных объёмах (0,5: 0,5 мл) 0.2 М фосфатный буфер и рабочий раствор лизоцима. После инкубации при 37С в течение 30 минут бактериальные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/ мин и в надосадочной жидкости по степени изменения оптической плотности взвеси тест-штамма определяли остаточную концентрацию лизоцима. В качестве тест-штамма использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus NCTC 2665.
Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных из кишечника
В мировой литературе имеется большое количество данных, свидетельствующих о том, что лактобациллы являются одним из важных компонентов микрофлоры желудочно- кишечного тракта (Mitsuoka Т, Опо К., 1977; Kimura К et al., 1997). Известно, что нормальное количество лактобацилл в фекалиях здоровых людей составляет КГ10 КОЕ/ г (Шендеров Б.А.,1998). Однако исследования многих авторов указывают на то, что содержание этих микроорганизмов в кишечном содержимом может колебаться оті О3 до 109 КОЕ/ г в зависимости от пола, возраста, национальности (Коршунов В.М.с соавт., 2001; Rosebury Т., 1962; Mitsuoka Т. et al., 1975). Частота встречаемости лактобацилл также широко варьирует и может составлять от 2 до 23% в разных возрастных группах (Коршунов В.М.с соавт., 2001; Sghir A. et al., 2000). Несмотря на то, что показатель микробной обсеменённости лактобацилл не является основным диагностическим критерием нормального состояния микробиоценоза желудочно- кишечного тракта, роль этих микроорганизмов в обеспечении нормального микроэкологического статуса названного биотопа не вызывает сомнений. Обладая выраженным антагонистическим потенциалом, лактобациллы способны оказывать подавляющее действие по отношению к большому количеству патогенных и условно- патогенных микроорганизмов (Coconier М.-Н. et al., 1993; Drago L. et al., 1997; Hudault S. Et al., 1997), не влияя при этом на качественный и количественный состав нормальной микрофлоры. Вместе с тем, низким (Б) показателем микробной обсемененности
Ouwehand A.C. et al (2000) было установлено, что некоторые виды кишечных лактобацилл способствуют более эффективному прилипанию бифидобактерий к поверхности энтероцитов.
Учитывая, что лактобациллы являются нормальными представителями кишечной микрофлоры, обеспечивающими колонизационную резистентность данного биотопа, нам представилось целесообразным изучить комплекс биологических свойств, способствующих переживанию представителей лактофлоры в занимаемом ими эпитопе.
Было выделено 169 штаммов из фекалий 105 людей. В связи с тем, что все штаммы лактобацилл были изолированы от пациентов с 1 и 2 степенями дисбиоза, мы условно выделили две исследуемые группы. К первой группе лактобацилл были отнесены штаммы, ПМО которых составлял 6,0 и более lg КОЕ/мл, а ко второй группе - 5,0 и менее КОЕ/мл. Так, 54 штамма, выделенных от 30 пациентов, относились к первой исследуемой группе, а 115 штаммов от 75 пациентов - ко второй группе. При анализе видового состава лактофлоры фекалий выявлено, что штаммы из первой исследуемой группы принадлежали к четырём видам: L.acidophilus, L.fermentum, L. casei, L.brevis, в то время как лактофлора второй группы была более разнообразна и характеризовалась присутствием шести видов лактобацилл: L.acidophilus, L. rhamnosus, L.fermentum, L. plantarum, L. casei, L.brevis (Рисунок 6). Наиболее часто в первой группе встречались лактобациллы, относящиеся к видам L.fermentum (37%) и L.acidophilus (37%), и почти в три раза реже L.brevis (13%) и L. casei (13%). Видовой состав лактофлоры второй группы характеризовался доминированием штаммов L.acidophilus (39%) и значительно меньшим содержанием видов L.plantarum (18%), L. casei (14%), L.fermentum (12%), L.brevis (12%) и L.rhamnosus (5%).
На рисунке 7 продемонстрировано, что ПМО лактобацилл, относившихся к первой группе, составлял в среднем 6,0± 0,01 lg КОЕ/мл, в то время как во второй группе лактобацилл значения данного показателя достоверно снижались и составляли 4,65± 0,09 lg КОЕ/мл. Обсеменённость штаммов L.acidophilus (6,0± 0,01 lg КОЕ/мл) (таблица 4), L.fermentum (6,0± 0,02 lg КОЕ/мл) , L. casei (6,0± 0,01 lg КОЕ/мл) и L.brevis (6,0± 0,02 lg КОЕ/мл) в первой группе была одинаковой. Во второй группе лактобацилл наиболее выраженная обсеменённость наблюдалась у L. casei (5,0 ± 0,03 lg КОЕ/мл) и L.acidophilus (4,71± 0,14 lg КОЕ/мл), L.plantarum (4,63± 0,26 lg КОЕ/мл) и L.fermentum (4,6 ± 0,25 lg КОЕ/мл) характеризовались промежуточными значениями этого признака, а наименьший ПМО отмечался у L.brevis (4,4 ± 0,4 lg КОЕ/мл).
Определение рН супернатантов фекальных лактобацилл показало, что средние значения этого признака у штаммов первой группы (рН= 4,02) и второй группы (рН= 4,14) достоверно не отличались.
Проведенное изучение адгезивной способности выявило, что все штаммы первой группы лактобацилл обладали этим свойством. Установлено, что штаммы первой группы характеризовались средними и высокими значениями ИА, а у лактобацилл второй группы этот показатель был высоким, средним или низким.
