Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Козырева, Варвара Константиновна

Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium
<
Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Козырева, Варвара Константиновна. Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.02.03 / Козырева Варвара Константиновна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН].- Смоленск, 2012.- 117 с.: ил. РГБ ОД, 61 12-3/1406

Содержание к диссертации

Введение

ЧАСТЬ I. Обзор литературы 13

Глава 1. Номенклатура рода Salmonella 13

Глава 2. Клиническое значение нетифоидных сероваров S. enter ica и эпидемиология сальмонеллеза 15

Глава 3. Применение антибиотиков для терапии инфекций, вызванных нетифоидными сероварами S. enterica 19

Глава 4. Антибиотикорезистентность у сальмонелл 21

Глава 5. Особенности эволюции генома сальмонелл и выбор методов исследования молекулярной эпидемиологии сальмонеллезов 28

ЧАСТЬ II. Собственные исследования 35

Глава 6. Материалы и методы исследования 35

Глава 7. Результаты исследования 50

Глава 8. Обсуждение 69

Выводы 83

Практические рекомендации 85

Список использованной литературы 87

Клиническое значение нетифоидных сероваров S. enter ica и эпидемиология сальмонеллеза

S. enterica подвид enterica является одной из главных причин пищевых инфекций во всем мире. Приблизительно в 95% случаев сальмонеллез у людей связан с потреблением зараженных продуктов питания таких, как мясо, птица, яйца, молоко, морепродукты и овощи. Прямой контакт с зараженным животным может также явиться источником сальмонеллезной инфекции [94].

Сейчас в Центрах контроля и профилактики заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) в США регистрируется приблизительно 30-40 тысяч случаев заболевания людей в год, вызванных нетифоидными се-роварами сальмонелл. Принимая во внимание предполагаемую долю незарегистрированных случаев, CDC оценивает заболеваемость сальмонеллезом в США приблизительно в 1,4 миллиона случаев в год [193], в том числе 17 тысяч случаев госпитализации и 585 летальных исходов ежегодно [94]. В Евросоюзе сеть эпидемиологического мониторинга Enternet сообщает, что на 1997 г. заболеваемость среди людей составила 100 000 случаев в год [154]. В последние годы, заболеваемость сальмонеллезами показывает непрерывный рост как по всему Европейскому союзу (73 000 случая в 2001 г.), так и в США, начиная с 1996 г. [193].

В Российской Федерации пик заболеваемости сальмонеллезом пришелся на 1992 год и составил 80,1 случаев на 100 тыс. населения. Несмотря на то, что после 1992 года в целом отмечалась тенденция снижения заболеваемости, последние 10 лет заболеваемость сальмонеллезами остается на стабильно высо 16 ком уровне- 30-35 случаев на 100 тыс. населения. В последние годы (начиная с 2005 года) опять наметился рост заболеваемости [1]. В 2003 и 2004 году было зарегистрировано соответственно 44918 и 48686 случаев сальмонеллеза; при этом с 2003 по 2004 гг. отметился рост заболеваемости с 33,1 человек на 100 тысяч населения до 33,9 [91]. В 2010 г. в России заболеваемость сальмо-неллезными инфекциями составила 35,79 на 100 тыс. населения (в том числе 14 летальных случаев), что на 1,7% выше, чем в 2009 году [1]. По последним данным Роспотребнадзора увеличилось и количество очагов групповой заболеваемости: 109 очагов сальмонеллеза зафиксировано в 2011 году по сравнению с 90 очагами в 2010 году [29].

В эпидемиологии заболеваний у человека доминирует всего несколько нетифоидных серотипов S. enterica [41]. В 2001 г. приблизительно 60% случаев у людей, зафиксированных в CDC, были вызваны четырьмя серотипами, а именно: S. Typhimurium (22.1%), S. Enteritidis (17.7%), S. Newport (10.0%) и S. Heidelberg (5,9%) [94, 193]. Такое доминирование выражено также во Франции, где более 70% случаев вызваны тремя серотипами 5. Enteritidis (33%), S. Typhimurium (32%) и S. Hadar (6%) [193]. Серовар Typhimurium в течение многих лет являлся наиболее часто выделяемым, по сравнению с другими сероварами сальмонелл, во многом благодаря всемирному распространению полирезистентного клона S. Typhimurium DTI04, что было признано угрозой мировому здравоохранению [75, 121]. В Российской Федерации с начала 80-х годов прошлого века в этиологической структуре сальмонеллезов преобладали сальмонеллы группы Д (по данным на 2010 г. - 83,8 %), прежде всего, Salmonella Enteritidis, но в последние годы появились данные о возрастающей роли сальмонелл группы С, в частности Salmonella Infantis [1,2].

В большинстве случаев инфекция, вызванная нетифоидными сальмонеллами, протекает как гастроэнтерит средней и легкой тяжести. Общими симптомами является диарея, боли в животе, рвота и лихорадка. Характерные симптомы проявляются в течение 6-72 часов от попадания бактерий в пищеварительный тракт. Заболевание обычно не нуждается в лечении антибиотиками и проходит само через 2-7 дней [19, 94]. В некоторых случаях сальмонеллы, относящиеся к нетифоидным сероварам, могут вызвать тяжелые формы заболевания, с сепсисом и инвазией во внутренние органы и ткани, что может приводить к остеомиелиту, пневмонии, менингиту [38, 48, 77] и заканчиваться летальным исходом [94]. В основном тяжелому течению инфекции подвержены дети, пожилые люди и пациенты с иммунодефицитными состояниями [10, 11, 27, 33, 94, 95, 193]. Большая часть таких осложнений приходится на долю но-зокомиальных инфекций [3, 5].

Понятие «нозокомиальная инфекция» впервые разработано Европейским региональным бюро ВОЗ в 1979 г. и первоначально предлагалось как «любое клинически распознаваемое инфекционное заболевание, которое развивается у пациента в результате его поступления в больницу, обращения в нее за лечебной помощью, или любое инфекционное заболевание сотрудника больницы, развившееся вследствие его работы в данном учреждении вне зависимости от времени появления симптомов заболевания (до или во время пребывания в больнице)» [20]. Комиссией по проведению обзорного исследова 18 ния частоты встречаемости нозокомиальных инфекций в Великобритании были предложены более четкие критерии нозокомиальной инфекции [49]: 1) если пациент повторно поступает в стационар с установленной инфекцией, явившейся следствием предыдущей госпитализации; 2) если инфекция развилась через 48 ч и более после поступления в лечебное учреждение.

В зависимости от действия различных факторов число больных, у которых развиваются нозокомиальные инфекции во время пребывания в стационаре, колеблется от 3 до 5% [20].

В отличие от пищевых инфекций, вызванных S. enterica, источником которых являются продукты питания, основным способом распространения но-зокомиального сальмонеллеза является контактный путь, который связан с прямой передачей возбудителя от человека к человеку. Высокая частота носи-тельства отдельных штаммов S. Typhimurium у пациентов стационаров и медицинских работников является важным фактором, способствующим клональ-ному распространению данных штаммов в нозокомиальной среде [5, 24, 36]. Кроме этого, эрадикации возбудителей сальмонеллеза в стационарах препятствует палатная пыль, в которой бактерии могут персистировать до 80 дней [5]. Дальнейшему распространению нозокомиальных клонов S. enterica способствует перевод пациентов между стационарами [5], подобные случаи были описаны при переводе пациентов между стационарами разных городов на юге США [114] и разных стран (из Филиппин в США) [156].

Антибиотикорезистентность у сальмонелл

Для детекции мутаций в QRDR области гена gyrA был использован новый метод ПЦР в реальном времени, основанный на эффекте переноса энергии флуоресценции между зондом и праймером, с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда (номер патента 2010149524). Метод предполагает амплификацию ультракоротких (50-80 пн) фрагментов ДНК с неэквивалентным соотношением праймеров (2:1—4:1) с целью обеспечения более эффективной амплификации одной из цепей ДНК, комплементарной зонду (ассиметричная ПЦР). «Избыточный» праймер (здесь, Sty_gyrA_Rpm, 0.8 мкМ, Табл. 2) содержит гаситель флуоресценции (RTQ1) на одном из нуклео-тидов внутри последовательности, ближе к 3 -концу, и достраивается полиме-разой с образованием цепи, комплементарной зонду (здесь, Sty_gyrA_Pb, 0,2 мкМ). Нуклеотидные последовательности зонда, содержащего флуорофор (FAM) на 3 конце, и праймеров выбираются таким образом, что связывание зонда с ДНК-мишенью осуществляется в участке, содержащем интересующие мутантные позиции (в данном случае 83 и 87 АА QRDR GyrA), на расстоянии 1-10 нуклеотидов между 3 -концами зонда и «избыточного» праймера (Рис. 1А). Таким образом, взаимодействие зонда с комплементарной цепью ДНК приводит к сближению флуорофора и гасителя и, следовательно, снижению флуоресценции по мере накопления продуктов ПЦР. Участки связывания зонда и второго (прямого) праймера (здесь, Sty_gyrA_Fpm, 0,2 мкМ) могут частично перекрываться (на 1 нуклеотид в данном случае), что позволяет уменьшить вероятность расщепления зонда за счет 5 -экзонуклеазной активности полимеразы. Описанный выше дизайн ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять идентификацию различных мутаций в области связывания зонда на основании анализа температуры его плавления (Тт). При полном соответствии последовательностей зонда и ДНК мишени (участку 82-88 АА QRDR GyrA, соответствующему дикому типу (WT) S. Typhimurium GenBank Асе. No. U21957) значение Tm является максимальным, а при наличии несовпадающих нуклеотидов - снижается в различной степени в зависимости от положения и характера мутации (Рис. 1Б). Расчет температур плавления (Тт) дуплексов зонда с WT и мутированными последовательностями целевого гена был произведен с помощью программного обеспечения MeltCalc (Е. Schiitz & N. von Ahsen, 1999). В состав ПЦР смесей общим объемом 25 мкл входили: 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы с коммерческим буфером (ИнтерЛабСервис, Россия), 2 мМ MgS04 и 3 мкл бактериальной ДНК, выделенной с помощью наборов InstaGene Matrix (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили с помощью системы RotorGene 2000 (Corbett Research, Австралия) согласно температурному протоколу, указанному в таблице 2. После завершения амплификации проводили анализ температуры плавления зонда путем регистрации его флуоресценции при увеличении температуры на 1 С каждые 10 секунд в диапазоне от 37

Б- Пример детекции мутаций в QRDR gyrA с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления зонда: 83-Phe/Tyr -мутация замены на аминокислоты Phe или Туг в 83 позиции QRDR GyrA; 87-Gly/Asn/Tyr - мутация замены на аминокислоты Gly, Asn или Туг в 87 позиции QRDR GyrA; WTQRDR- нет мутаций. Для всех изолятов характер выявленных мутаций в QRDR gyrA был установлен путем амплификации и прямого секвенирования внутреннего фрагмента гена gyrA с помощью праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT (табл. 2) [146]. Секвенирование проводили с использованием наборов BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США).

Конъюгационный перенос плазмид от исследуемых штаммов в реципи-ентный штамм E.coli АВ1456 (Rif ) [116] проводился при совместном культивировании клеток донора и реципиента в бульоне Мюллера-Хинтон при 35С в течение 20-24ч с последующим рассевом на плотные среды, содержащие ри-фампицин (100 мг/л) в комбинации с ампициллином (100 мг/л) или цефотак-симом (1 мг/л). Эффективность конъюгации рассчитывали как отношение количества колоний трансконъюгантов на чашках с комбинацией двух антибиотиков к количеству колоний реципиента на чашках с рифампицином.

СТХ-М-кодирующие плазмиды были выделены у исследованных штаммов и их трансконъюгантов с помощью наборов Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия). Компетентный лабораторный штамм Е. coli EPI300 был трансформирован полученной плазмидной ДНК путем их совместной инкубации сначала 10 мин при +4С, а затем 45 сек при 45С и снова 10 мин при +4С, после чего реципиентные бактериальные клетки инкубировались в жидкой, обогащенной глюкозой питательной среде (SOC) в течение 30 мин при 35-36С при непрерывном помешивании. Трансформанты затем были селекти 45 рованы путем посева бактериальной суспензии на плотную среду с цефотак-симом(1 мг/л).

Рестрикционный анализ плазмид, повторно выделенных от трансформантов, проводили с помощью эндонуклеаз Pstl (Promega, США) и Pvull (Amersham, США) [89]. Эндонуклеазы использовали в соотношении 10 Ед на 1мкг ДНК и инкубировали 3 ч при 37С. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически на приборе Ultraspec 3000 (Pharmacia Biotech, Швеция). Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле.

Плазмиды, по одной из каждого описанного рестрикционного профиля, были выделены от трансформантов и секвенированы с помощью генетического анализатора ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit для Сэнгеровской реакции. Нуклеотидная последовательность была прочитана непосредственно с плазмидной ДНК путем последовательного подбора праймеров внутри известной области плазмиды (секвенирование выполнено в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" ФМБА России). Предсказание генов в последовательности отсеквенированных плазмид выполнено с помощью программного обеспечения Artemis Version 8 (Sanger Institute, Великобритания). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнено в программе CLC Main Workbench v 5.7.1 (CLC bio, Дания) и путем поиска гомологии BLASTN и BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Материалы и методы исследования

На идентичность СТХ-М-5-кодирующих плазмид у всех исследованных изолятов указывают данные рестрикционного анализа и ПЦР-типирования. Консервативный генетический каркас у всех четырех выявленных типов плазмид включает характерную ассоциацию мобильного элемента ISEcpl и гена р-лактамазы СТХ-М-5, а также гены инициации репликации и mob оперона. Консервативный каркас плазмид имеет значительную (98%) гомологию нук-леотидной последовательности с небольшой (4995 пн) криптической плазми-дой pIGRW12, найденной в 2006 году в Польше у клинического штамма Escherichia coli (Асе. No. EF088686), а также проявляет 97-95% гомологию с плазмидами pS51B (Асе. No. АВ583678) и pECOl (Асе. No. АВ117929), описанными у Enterobacter cloacae в Японии, которые могут соответствовать плазмидному каркасу, до того, как были приобретены детерминанты резистентности к цефалоспоринам.

Отсутствие tra оперона, ответственного за конъюгационный перенос, при наличии полного набора генов мобилизации в консервативном каркасе описанных плазмид поддерживает наши данные о переносе СТХ-М-5-кодирующих плазмид от двух изолятов при конъюгации с низкой частотой и свидетельствует о том, что данные плазмиды являются неавтоконъюгативны-ми, но способными к ко-мобилизации другими плазмидами. Небольшой размер плазмид связан с отсутствием репликона, что ведет к отсутствию контроля за репликацией со стороны плазмиды; такие плазмиды обычно присутствуют в клетке в большом количестве копий, а также могут быть легко утеряны при отсутствии селективного давления антибиотика, что и наблюдается у исследованных штаммов. Наиболее распространенная плазмида рСТХМ5-637 может считаться предшественником других типов плазмид и эволюционировала путем приобретения мобильных элементов IS 1 (в случае рСТХМ5-1358 и рСТХМ5-1845) или ТпЗ (рСТХМ5-891).

Локализация генов ЫаСтх-м-5 на схожих, не поддающихся самостоятельному переносу плазмидах поддерживает данные о клональном распространении цефотаксиморезистентных нозокомиальных штаммов S. Typhimurium. Более того, описанные плазмиды являются специфичными для данной клональ-ной группы S. Typhimurium и, пока, не были найдены у штаммов S. Typhimurium других генетических линий. У восьми изолятов наличие гена СТХ-М-5 р-лактамазы при отсутствии соответствующих плазмид можно объ 75 яснить транслокацией гена Ыастх-м, опосредованной ISEcpl, которая была описана в ряде публикаций [93, 109, 141, 176].

Дополнительная устойчивость к ингибиторозащищенными пеницилли-нам, выявленная у большинства исследованных нами изолятов S. Typhimurium была связана с ко-продукцией ОХА-пенициллиназ, для которых характерна нечувствительность к ингибированию клавуланатом, тазобактамом и сульбак-тамом. Гены ОХА-1-подобных Р-лактамаз были выявлены в составе дополнительных конъюгативных плазмид, которые несли также детерминанты устойчивости к не-Р-лактамным антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину и ко-тримоксазолу в различных сочетаниях. В связи с легкостью переноса этих конъюгативных плазмид между штаммами профиль устойчивости к не-Р-лактамным антибиотикам (Tet, Chi, Gm, Sxt), как и наличие ОХА пенициллиназ не коррелировали с генетической родственностью штаммов (Рис. 5).

Учитывая полирезистентность СТХ-М-5-продуцирующих клонов S. Typhimurium особое значение имеет факт выявления у них устойчивости к хинолонам. Известно, что наличие у штаммов Salmonella единичных мутации в QRDR GyrA является причиной устойчивости низкого уровня к ципрофлок-сацину и, кроме того, увеличивает риск селекции дополнительных (кооперативных) мутаций и формирования резистентности высокого уровня [193]. Согласно современным рекомендациям CLSI определение чувствительности сальмонелл к налидиксовой кислоте является обязательным для выявления резистентности низкого уровня к фторхинолонам и предсказания их возможной клинической неэффективности при терапии инвазивного сальмонеллеза [76]. Вместе с тем, как в последней редакции CLSI-2012, так и в требованиях Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST-2012) рекомендовано также непосредственно определять чувствительность сальмонелл к ципрофлоксацину, поскольку налидиксовая кислота, по последним данным, иногда не позволяет выявить отдельные плаз-мидно-опосредованные механизмы резистентности к хинолонам, например, продукцию Qnr-белков [76, 92, 124]. При этом в качестве пограничной концентрации, позволяющей отнести штамм к категории «чувствительный», для сальмонелл используется более низкая по сравнению с другими энтеробакте-риями пограничная концентрация ципрофлоксацина ( 0,06 мг/л). Критерии EUCAST для налидиксовой кислоты в настоящее время отсутствуют.

У исследованных нами изолятов S. Typhimurium резистентность к хинолонам во всех случаях была вызвана мутациями gyrA, при этом, у чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов соответствующие мутации не были обнаружены. Таким образом, фенотип чувствительности к налидиксовой кислоте строго коррелировал с генотипом gyrA. Большинство штаммов с характерными мутациями в QRDR GyrA также проявляли устойчивость низкого уровня к ципрофлоксацину, однако один изолят (SE079/Ka-5120) с заменой Gly-87, формально сохранял чувствительность к ципрофлоксацину (МІЖ 0,06 мг/л). Данное наблюдение свидетельствует, на наш взгляд, о том, что налидиксовая кислота является более чувствительным маркером для выявления хромосомно-опосредованной резистентности к хинолонам. Выявленные в ходе данного исследования мутации в 83 и 87 позиции GyrA являются типичными для хинолонорезистентных клинических штаммов и встречаются у различных видов семейства Enterobacteriaceae [195]. Эффект данных мутаций, в частности, наиболее часто встречавшихся у исследованных нами изолятов замен Asn-87 (28,4%) и Phe-83 (9,1%), хорошо изучен для штаммов сальмонелл [190]. Мутация Phe-83 была предсказуемо связана с более высокими значениями МПК как налидиксовой кислоты ( 512мг/л), так и ципрофлоксацина ( 0,25мг/л).

Ввиду показанной нами клональной родственности исследованных изолятов, было бы логично предположить, что мутации в хромосомном гене gyrA должны быть одинаковыми у всех штаммов, резистентных к хинолонам. Однако, данные кластерного анализа штаммов, выполненного по результатам MLVA-типирования (Рис. 10), свидетельствуют о том, что распространение резистентности к хинолонам в изучаемой генетической линии S. Typhimurium лишь отчасти носит клональный характер и в значительной мере связано с независимым приобретением мутаций в gyrA исходно чувствительным штаммом.

Обсуждение

Известно, что одним из важнейших факторов, способствующих быстрому формированию хромосомно-опосредованной резистентности к хинолонам, является повышенная частота мутирования [60]. Гипермутабельность широко распространена среди нозокомиальных штаммов многих видов бактерий, включая Salmonella enterica [73]. Ранее было показано, что у штаммов S. Ту-phimurium с нарушенной системой репарации повреждений ДНК (mutST) частота мутаций резистентности к налидиксовой кислоте возрастает на 3 порядка: сЗ,Зх10-9доЗ,4х10"6[125].

У исследованных нами изолятов частота спонтанных мутаций устойчивости к налидиксовой кислоте составила приблизительно 1 х 10"5 (соответствует увеличению частоты мутаций на 4 порядка по сравнению с обычными штаммами [125]), что позволило считать их гипермутабельными. Фенотип ги-пермутабельности наблюдался у всех исходно чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов, относящихся к разным MLVA-субтипам внутри одной кло-нальной группы. Таким образом, разнородность мутаций резистентности к фторхинолонам не противоречит результатам субвидового типирования, а свидетельствует о распространении единого гипермутабельного клона.

На данный момент известно, во-первых, что селекция резистентности к фторхинолонам может происходить вследствие их активного применения как у животных [31, 162, 197], так и у людей [79]. Во-вторых, в исследовании in vitro доказано, что уровень резистентности к ципрофлоксацину, который может приобрести популяция бактерий в ходе селекции, напрямую зависит от частоты мутабельности [157]. Ввиду вышесказанного, можно ожидать, что ги 80 пермутабельность изолятов, принадлежащих описанной клональной группе, приведет к появления дополнительных к уже существующим мутаций в QRDR гена gyrA, аккумуляция которых вызовет дальнейший рост уровня резистентности к фторхинолонам, что увеличит приспособленность микроорганизма к циркуляции в больничной среде и создаст селективное преимущество для последующего распространения описанного полирезистентного клона S. Typhimurium. Полученные нами данные о высокой частоте устойчивости к хинолонам и наличию гипермутабельности у изученных штаммов S. Typhimurium ставят под сомнение возможность эффективного использования ципрофлоксацина для терапии инфекций, вызванных данными штаммами, даже в случае выявления in vitro чувствительности у отдельных изолятов.

Несмотря на установленный с помощью молекулярно-генетических методов факт клональности цефотаксиморезистентных штаммов S. Typhimurium, недостаточность имеющихся эпидемиологических данных не позволяет однозначно установить пути их распространения между стационарами в разных городах на территории России, Беларуси и Казахстана. Опираясь на документированные наблюдения, можно предположить, что основным путем распространения инфекции внутри стационара является передача цефотаксиморезистентных штаммов контактным путем от человека к человеку, в частности, между пациентами или посредством бессимптомного носительства у медицинского персонала и далее между стационарами в результате перевода пациентов [5]. Так, например, в ходе данного исследования нами был выявлен случай распространения СТХ-М-5-продуцирующего штамма S. Typhimurium из районной больницы в Смоленской области, где на протяжении 2 лет отмечалась его циркуляция среди пациентов, в один из стационаров города Смоленска, куда были переведены инфицированные мать и ее ребенок с тяжелой формой гастроэнтерита.

Ранее другими авторами уже были описаны случаи распространения но-зокомиального клона S. enterica между стационарами разных городов [114] и разных стран [156], связанные с переводом пациентов из одного стационара в другой. Tassios и соавт. на основании результатов PFGE-типирования, анализа плазмид и детерминант резистентности сделали вывод о родственности штаммов S. Typhimurium, выделенных в Венгрии, Греции и России (Санкт-Петербурге) [182]. При этом штамм из Санкт-Петербурга (SE005/Sp-893), описанный в работе Tassios и соавт. как родственный греческим и венгерским штаммам, по данным выполненного нами молекулярного типирования принадлежит к той же клональной группе, что и остальные изоляты из России. Кроме того, известны факты «экспортирования» пациентами СТХ-М-продуцирующих штаммов S. Typhimurium из южной части России в другие страны: в частности российским иммигрантом в Грецию в 1998 г. [191] и ребенком, усыновленным в США в 2000 г. [207]. Несмотря на отсутствие данных типирования этих штаммов, примечательным является тот факт, что выделенный в США изолят характеризовался наличием плазмиды размером до 9 тпн, несущей ген Ыастх-м-5- и, следовательно, сходной с плазмидами, обнаруженными у нозокомиального штамма из Латвии [70] и штаммов, циркулирующих на территории России, Казахстана и Беларуси.

Таким образом, в течение долгого времени в стационарах на обширной территории Российской Федерации и сопредельных государств циркулирует успешный полирезистентный клон S. Typhimurium, устойчивый к (3-лактамам, в том числе к цефалоспоринам расширенного спектра действия, благодаря продукции плазмидно-кодируемой БЛРС СТХ-М-5. Причем, неавтоконъюга-тивные СТХ-М-5-кодирующие плазмиды являются важной характеристикой описанного клона и не были обнаружены у изолятов 5. Typhimurium неродственных генетических линий. Значительная доля изолятов принадлежащих данному клону резистентна к фторхинолонам, и существует высокая вероятность дальнейшего роста фторхинолонорезистентности среди изолятов внутри клональной группы вследствие их гипермутабельности, которая облегчает приобретение мутаций устойчивости. Большинство изолятов данной группы проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам разных классов за счет комбинации дополнительных плазмидных и хромосомных детерминант резистентности. Имеющиеся эпидемиологические данные указывают на возможность быстрого распространения клона в госпитальной среде путем передачи возбудителя между пациентами и, возможно, медицинским персоналом.

Похожие диссертации на Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium