Содержание к диссертации
Введение
I. Морфологическая дифференцировка прокариот 6
1.1. Репродуктивные покоящиеся формы бактерий 7
1.2. Стационарные покоящиеся формы бактерий 17
II. Уровни клеточной организации прокариот 22
II. 1. Морфология колоний на твердых средах 22
11.2. Биопленки 29
11.3. Механизм кворум-зависимости у микроорганизмов 33
II.3.. Агрегация бактерий в жидких средах 40
III. Применение подходов химической кинетики к описанию роста клеточных популяций 45
IV. Характеристика объектов исследования 59
IV. 1, Escherichia coli 59
IV.2. Bacillus subtilis 64
IV.3. Rhodococcus rhodochrous 66
IV.4. Mycobacterium tuberculosis 70
Методы исследования 78
Результаты исследования и их обсуждение 97
I. Бактериальные культуры в суспензии содержат полицеллюлярные формы 97
II. Переходы «одиночные клетки - полицеллюлярные формы» являются обратимыми 102
III. Изучение элементных профилей при межпопуляционных клеточных переходах 120
IV. Способы регуляции межпопуляционных клеточных переходов 132
V. Механизмы образования полицеллюлярных форм 142
VI. Адаптивное значение образования полицеллюлярных форм 150
V. Заключение 162
Выводы 164
Библиографический список 165
- Репродуктивные покоящиеся формы бактерий
- Морфология колоний на твердых средах
- Rhodococcus rhodochrous
- Бактериальные культуры в суспензии содержат полицеллюлярные формы
Введение к работе
Решение проблем адаптации, то есть раскрытие структурно-функциональных основ жизни организма и его взаимодействия со средой, неразрывно связано со специализацией клеток, и, как следствие, с образованием полицеллюлярных форм. Адаптация прокариот обычно связывается с их генетической лабильностью и высокой скоростью приспособительных процессов (таких как возникновение резистентности) и рассматривается с точки зрения филогении. Между тем, учитывая высокую степень полиморфности многих бактериальных культур, у прокариот следует ожидать реализации всего многообразия механизмов адаптации, начиная от изменений отдельных клеток и заканчивая формированием единого ответа целостной клеточной популяцией.
Такое явление, как изменение формы и размеров эукариотических клеток под действием химических и физических факторов, хорошо известно. Так, при неблагоприятных условиях в культуре Saccharomyces cerevisiae образуются гигантские клетки, что способствует снижению соотношения поверхность/объем [194]. Формообразование эукариотичских клеток является функцией химического состава среды [7, 55]. Для бактериальных клеток, вследствие особенностей строения, подобные переходы затруднены, и при реализации аналогичных механизмов формообразования у прокариот следовало бы ожидать не изменений морфологии отдельной клетки, а объединения клеток в ассоциаты, образования клеточных агрегатов и полицеллюлярных форм, либо образования специализированных форм, устойчивых к внешним воздействиям.
В целом процессы ассоциации в сообществах микроорганизмов обеспечивают их высокую устойчивость к воздействию внешних факторов и
4 приводят к формированию бактериальных пленок, исследованию которых ныне
уделяется большое внимание [154]. Поскольку прокариотические клетки в
биопленках тесно связаны друг с другом и объединены в целостную структуру [190],
это явление позволяет говорить о «ложной многоклеточности», возникающей
конвергентно колониальным и многоклеточным эукариотическим организмам.
Образованию и роли бактериальных ассоциатов уделяется пристальное внимание [172, 187]. Процессы ассоциации бактериопланктона прослеживаются в водных гетеротрофных бактериоценозах, от чего зависит скорость процессов естественной переработки загрязняющих веществ в водоемах [35]. Тем не менее, оценка такого важного параметра, как численность бактерий в среде, остается нерешенной проблемой, поскольку, вследствие ассоциации, не все клетки способны образовывать колонии на твердых средах.
Кроме того, с формообразованием болезнетворных бактерий непосредственно связаны проблемы патогенеза хронических инфекций и персистенции микроорганизмов. Обязательным условием существования паразитарных систем в биологически агрессивной среде является гетерогенность популяций патогена и их динамическая изменчивость [9]. Так, Mycobacterium tuberculosis способны образовывать ультрамелкие формы, способные к длительному персистированию при неблагоприятных условиях, L-формы, невидимые для иммунной системы [32], а также ассоциаты разного размера, затрудняющие макрофагальный ответ [54]. Агрегация Escherichia coli, патогенных стафилококков, менингококков под действием лизоцима способствует колонизации бактерий в организме и обеспечивает их лекарственную устойчивость [39]. Таким образом, успешная диагностика и полнота излечения многих заболеваний может быть тесно связана с
5 возможностью контроля субпопуляционных перестроек патогенных
микроорганизмов. В настоящей работе мы разработали новый количественный
метод исследования субпопуляционного состава бактериальных культур и
применили его для кинетического описания межпопуляционных переходов.
Репродуктивные покоящиеся формы бактерий
Часто покоящиеся формы бактерий, различные по морфологии, способам образования и параметрам покоя, объединяют общим термином «споры». Согласно принятому в спорологаи определению, к специализированным покоящимся формам микроорганизмов относят жизнеспособные клетки, предназначенные для репродукции и распространения, формирование которых является составляющей развития микробных культур [22]. Специализированные покоящиеся формы характеризуются экспериментально не выявляемым или резко сниженным уровнем метаболизма, обладают повышенной устойчивостью к экстремальным воздействиям и отличаются от вегетативных клеток особенностями ультраструктурной организации [37, 84].
Эндоспоры. Эндоспоры обладают наиболее высокой устойчивостью к действию неблагоприятных факторов [150]. Эндоспорообразование характерно для представителей родов Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina,
Thermoactinomyces и некоторых других (всего около 15 родов эубактерий) [22]. Традиционно считалось, что к эндоспоры формируются только у грамположительных бактерий, но в последнее время эндоспорообразование обнаружено и у бактерий с клеточной стенкой грамотрицательного типа: Osenia sivashensis sp. nov, [31], Propionspora vibriodes nov. gen. sp. [72].
Эндоспоры формируются внутри цитоплазмы материнской клетки (спорангия) и обладают многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней споровыми мембранами и кортексом между ними, состоящего из модифицированного пептидогликана, зачаточной клеточной стенкой и сердцевиной - споровым протопластом [22,183].
Процесс спорообразования лучше всего изучен у представителей родов Bacillus и Clostridium и может быть описан как асимметричная септация бактериальной клетки с последующим поглощением одной части септированной клетки (материнской) другой (дочерней) и внутриклеточным превращением поглощенной клетки в спору [57, 92, 104]. По всей видимости, такая последовательность событий является однотипной для всех спорообразующих форм.
Как правило, в бактериальной клетке формируется единственная эндоспора, хотя описана анаэробная бактерия Metabacterium polyspora, образующая в клетке до 3—5 эндоспор [65]. Эндоспорообразование включает в себя несколько стадий. В начале нуклеоид располагается вдоль длинной оси спорулирующей клетки. Затем около 1/3 его отделяется, и в материнской клетке асимметрично образуется септа, отделяющая меньшую часть - проспору. После этого происходит очень характерный процесс: поглощение проспоры материнской клеткой с помощью двусторонней эвагинации клеточной мембраны. В результате образуется проспора, отделенная от материнской клетки двумя элементарными мембранами: наружной и внутренней, причем стороны мембран оказываются противоположно ориентированы друг к другу [104].
Интересно, что все этапы спорообразования вплоть до образования проспоры являются обратимыми [170]. Так, при добавлении к спорулирующей культуре хлорамфеникола, ингибирующего синтез клеточных мембран, спорообразование модифицируется в процесс клеточного деления.
На следующих этапах между мембранами проспоры синтезируется кортекс, поверх наружной мембраны откладываются многослойные споровые покровы, различающиеся у разных видов бактерий [158]. Поверх покровов у многих бактерий формируется экзоспориум, строение которого также видоспецифично. Одновременно идет обезвоживание спорового протопласта и блокирование его метаболической активности. Так, в суспензиях эндоспор бацилл, клостридий и некоторых термоактиномицетов ЗНДОГЄЕШОЄ дыхание не определяется обычными респирометрическими методами [92].
Морфология колоний на твердых средах
Результаты исследований классических колоний микроорганизмов, образуемых на твердых средах, свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности клеток колонии. Колония рассматривается как сложная структура, состоящая из дифференцированных клеточных кластеров [171]. Так, в качестве обособленных кластеров у шигелл рассматривались активно делящиеся, покоящиеся и спонтанно автол изирующиеся клетки [45]. В популяции бактерии Micrococcus luteus, выращенной на обедненных средах, с помощью клеточного сортера и в бифазной системе водных растворов полимеров также можно выделить живые, покоящиеся и нежизнеспособные клетки [15, 124, 125].
Внутри бактериальной колонии прослеживается вертикальная стратификация. Слои из морфологически и биохимически различающихся клеток наблюдали в колониях возбудителя холеры Vibrio cholerae ещё в 1920 г. [137]. Вертикальные слои колоний Escherichia coli и Shigella flexneri по-разному окрашиваются витальными красителями (толуидиновая синяя, метиленовая синяя), При рассмотрении срезов колоний этих микроорганизмов выделяются три слоя [171]: 1) хорошо окрашенный нижний (толщиной 6 мкм в колонии Е. coli; 2) средний, светлый с включениями ярко окрашенных клеток (толщиной 16 мкм у Е. coli [171]; 3) хорошо окрашенный верхний (40 мкм у Е. coli). Верхний слой, в свою очередь, подразделяется на два: нижележащий тонкий (толщиной 1-3 клеточных слоя) и четко ограниченный, особенно ярко окрашенный и толстый слой (40 мкм у Е. coli), содержащий отдельные не окрашенные клетки [171]. По предположениям авторов, хорошо окрашиваются жизнеспособные клетки, тогда как нежизнеспособные прокрашиваются хуже. При окрашивании на р-галактозидазу трансформированных штаммов Е. coli с геном lac Z также выявляется вертикальная зональность: присубстратный тонкий слой р-галактозидазосодержащих клеток покрыт слоем клеток без р-галактозидазы, который, в свою очередь, вновь сменяется слоем р-галактозидазосодержащих клеток. Верхний слой колонии имеет смешанную структуру и включает как группы р-галактозидазосодержащих клеток, так и клетки, не содержащие этот фермент [171].
Микроструктура бактериальных колоний также имеет сложную организацию: фактически колония состоит из микроколоний, сформированных слизистым матриксом и отделенных друг от друга системой воздухоносных полостей. Микроколонии объединены в единую систему клеточными мостиками, пересекающими полости [47]. Интересно, что для внутренней структуры биопленок также характерно наличие микроколоний, разделенных открытыми каналами, часто заполненными водой. Подобные образования облегчают снабжение клеток питательными веществами и удаление продуктов метаболизма [83] и могут рассматриваться как аналог циркуляторной системы многоклеточных. Поры и каналы обнаружены в бактериальных колониях Alcaligenes sp., штамм 0. Кроме того, в колониях этого вида присутствуют и более специализированные мембранные структуры, содержащие внеклеточные гемопротеины и, вероятно, облегчающие транспорт кислорода к клеткам колонии. Соответственно, подобные образования можно рассматривать как аналог дыхательной системы многоклеточных [23,24]. Помимо вертикальной зональности, бактериальным колониям на плотных средах присуща и горизонтальная дифференцировка: отличные друг от друга концентрические зоны и сектора. Сектора хорошо заметны, например, у Е. coll на минимальЕЮЙ синтетической питательной среде М9 [8]. Предполагается, что сектора колонии генетически неоднородны, поскольку отличаются по окраске, консистенции, форме, скорости роста, активности ферментов и т.п. Как пример такой дифференцироаки можно рассмотреть фазовую диссоциацию бактерий на R-, S- и М-формы. Они различаются, например, толщиной клеточной стенки (у представителей бруцелл толщина клеточной стенки R-варианта больше, чем S варианта)
Rhodococcus rhodochrous
Rhodococcus rhodochrous - представитель группы актиномицетов. В настоящее время особое внимание биотехнологов, генетиков и экологов привлекают обычные, распространенные в природе спороактиномицеты (бактерии с ветвящимися гифами и специализированными споронесущими структурами), а также нокардиоморфные актиномицеты. Многие актиномицеты растут на обычных бактериологических средах: мясо-пептонном агаре, триптиказо-соевом агаре, кровяном агаре и т.п. На агаризованных средах виды рода Rhodococcus образуют субстратный мицелий (гифы, проникающие в агар), для которого характерна быстрая фрагментация -распадение гиф на палочки и кокки, поэтому их колонии по консистенции мягкие или крошащиеся [34]. Для роста актиномицетов в жидкой среде необходимы специальные условия: чтобы получить рост в виде гомогенной суспензии (что необходимо для хемотаксономических исследований), требуется интенсивная аэрация и перемешивание. Кроме того, в жидкие среды необходимо внести большое количество зачатков роста — спор или фрагментов гиф [14, 34].
Родококки обладают типичной для актиномицетов ультраструктурной организацией. Однако культивирование Rh. rhodochrous на среде с пропаном индуцирует изменение тонкой клеточной структуры, связанное с потреблением газообразных углеводородов: развивается плеоморфизм клеток, увеличивается число гранул волютина, формируются электронно-плотные включения и округлые структуры типа вакуолей средней электронной плотности. Идет фрагментация цитоплазмы на отдельные участки и формирование хорошо развитой внутриклеточной мембранной системы вблизи клеточной стенки [34,101].
При идентификации отдельных актиномицетов до рода наиболее важны две химические характеристики: какая двухосновная аминокислота присутствует в составе клеточной стенки, и какие диагностические сахара содержатся в гидролизате целых клеток. Эти данные можно получить с помощью бумажной хроматографии гидролизатов целых клеток [107, 151]. Таким образом определяется, содержит ли актиномицет диаминопимелиновую кислоту (ДАПк) и в какой форме (мезо- или L-). Группа Nocardioid.es, к которой относится род Rhodococcus, характеризуется присутствием L-формы ДАПк в качестве основного компонента клеточной стенки. Это гетерогенная группа, где Rhodococcus входит в подгруппу бактерий, содержащих миколовые кислоты. Данный надродовой таксон Mycolata включает среди других роды Corynebacterium, Mycobacterium и Nocardia [176, 177]. Представители этого таксона отличаются необычайной сложностью состава и организации клеточной стенки по сравнению с остальными грамположительными бактериями. В составе клеточной стенки родококков преобладают арабиногалактановые полисахариды, ковалентно связанные с длинными 2-алкил - 3 гидрокси-разветвленными цепями жирных кислот, миколовыми кислотами [134].
Ковалентно присоединяясь к пептидогликану, эти соединения образуют характерный пептидогликан-арабиногалактан-миколовокислотный матрикс.
Миколовые кислоты, связанные с арабиногалактаном клеточной стенки, образуют отчетливый внешний липидный слой [176], где сами миколовые кислоты составляют основу внешнего липидного барьера проницаемости [177]. Миколовые кислоты содержат 34-52 атомов углерода и до 3 двойных связей. В состав гликанового компонента клеточной стенки входят N-гликолильные остатки, а также большое количество неразветвленных насыщенных, ненасыщенных и 10-метил разветвленной (туберкулостеариновой) жирных кислот. Эфиры жирных кислот, освобождаемые при пиролизной газовой хроматографии эфиров миколовых кислот, содержат от 12 до 18 атомов углерода. Основные фосфолипиды клеток дифосфатидилглицерол, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитолдиманнозиды. Основной изопренолог - дигидрированный менахинон с 8 изопреновыми единицами (МК-8(Н2)) [81, 103].
Бактериальные культуры в суспензии содержат полицеллюлярные формы
Mycobacterium tuberculosis (сем. Nocardiaceae) — тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1-4 мкм, шириной 0,2 - 0,6 мкм, гомогенные или зернистые, с незначительно закругленными концами [58, 59]. Они неподвижны, кислотоустойчивы, не образуют эндоспор, конидий и капсул. Морфология и размеры бактериальных клеток подвержены значительным колебаниям и зависят от многих факторов. Кроме выраженного многообразия форм существования, микобактерии характеризуются, как известно, большим полиморфизмом и плеоморфизмом, то есть широким диапазоном изменчивости биологических свойств.
Так как основным фактором противоинфекционной защиты при патогенезе туберкулеза является макрофагальный ответ, отсутствие биологического излечения от туберкулеза легких (то есть неполнота протекания процессов фагоцитоза) объясняется именно этим фактором, а именно - множественностью форм микобактерий туберкулеза, отличных от классической палочковидной (L-формы, ультрамелкие, нитевидные, мицелио подобные и т.п.) [20, 21], а также способностью данных патогенов к длительному внутриклеточному персистированию в дормантном состоянии [54]. Охарактеризовав культуру М tuberculosis (штамм Academia) с помощью указанного метода (рис. 4А), мы обнаружили как одиночные палочковидные клетки (rmax численного распределения 2-3 мкм), так и полицеллюлярные формы (Гщах объемного распределения — 40 мкм). Микроскопически клеточные агрегаты выявляются как крайне редкие в виде характерных кос при увеличении х40. Оказалось, что численное соотношение (полицеллюлярные формы М. тегси/ош)/(одиночные клетки) стремится к нулю, тогда как объемная доля агрегированных форм составляет почти 90% от общего объема всех клеточных форм.
Такое распределение характерно для культуры в логарифмической фазе роста. Однако для М. tuberculosis широко известно явление персистирования, и культура in vitro может длительное время сохраняться в постстационарной фазе. При этом клетки теряют способность расти на твердых средах. Исследование такой культуры с помощью метода лазерной дифракции демонстрирует изменение ее субпопуляционного состава: 95% количественно принадлежит одиночным клеткам размером менее 1 мкм (рис. 4Б). По данным световой и электронной микроскопии, такие клетки представлены овоидными и коккоидными формами небольшого размера (0,6-0,8 мкм). Так как такие клетки полностью теряют способность формирования колоний на твердых средах, очевидно, что это - дормантные, «некультивируемые» формы [173].
Escherichia coli (сем. Enterobacteriaceae) представляют собой грамотрицательные подвижные и неподвижные палочки, что связано с наличием или отсутствием у них перитрихиально расположенных жгутиков. Это один из представителей нормальной кишечной флоры человека и животных, сапрофит толстого кишечника. Е. coli является основным видом энтеробактерий, принимаемой для нормирования эффективности санитарного контроля, и обладает одной из самых высоких резистентностей в общем ряду энтеробактерий [46]. Бактериальная культура Escherichia coli традиционно считается состоящей из одиночных клеток. Однако при исследовании было выяснено, что при максимуме численного распределения клеток 1 мкм, соответствующего одиночным клеткам, объемное распределение имеет максимум около 2 мкм, то есть в культуре имеются клеточные ассоциаты (рис. 5Б), соответствующие, по данным световой микроскопии, гексамерным упаковкам.
Bacillus subtilis (сем. ВасШасеае) - грамположительная аэробная подвижная палочковидная бактерия, образующая споры. Споры центральные, не превышающие диаметра клетки. Широко распространена в почве, на растительных остатках [46]. На графике усредненные размеры одиночных клеток В. subtilis не превышают I мкм. Характеристики клеток такого размера остаются за пределами разрешения прибора, но регистрируется их объемная и численная доля. Из данных рис. 5А можно определить объемную и численную долю одиночных клеток: график численного распределения отсекает ее по оси ординат. Так, численная доля одиночных клеток составляет около 90 % .
