Введение к работе
Актуальность
Известно, что микробные популяции в биопленках существенно отличаются по
физиолого-биохимическим свойствам от суспензионных культур [James et al., 1995].
Реализация специфического биопленочного фенотипа определяет повышенную
устойчивость биопленок к стрессовым факторам, антибиотикам и другим биоцидам.
Изучению механизмов устойчивости биопленок посвящено большое количество
работ. Среди возможных причин повышенной устойчивости к антимикробным
препаратам исследователи называют индукцию систем, обуславливающих экскрецию
антибиотиков из клеток [Nikaido, 2009], низкую скорость диффузии антибиотиков
через внеклеточный полимерный матрикс [Lewis, 2001], возникновение клеток-
персистеров [Levin and Rozen 2006], сниженную скорость метаболизма бактерий в
биопленках [Costerton et al., 1999]. Описан интересный механизм
прото кооперативных взаимоотношений в условиях бинарной биопленки: галотолерантный нефтеокислитель не только выживает, но и размножается при концентрации NaCl, которая является летальной для чистой планктонной культуры этого галотолеранта, за счет накопления в биопленке галофильным спутником осмопротекторного вещества (эктоина) [Плакунов с соавт., 2008]. В случае устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды (таким, как рН и температура) некоторые авторы предполагают важную роль матрикса биопленок [Scher et al., 2005]. Однако экспериментальные доказательства механизма этого явления отсутствуют.
Поэтому механизмы устойчивости биопленок к антимикробным веществам и стрессовым факторам среды, а также роль в этих процессах внеклеточного полимерного матрикса заслуживают более детального изучения. Следует отметить, что из-за различий в применяемых методиках и в экспериментальных подходах в процессе получения биопленок, появилось множество разнообразных и, иногда, альтернативных взглядов на механизмы этой устойчивости. Кроме того, большинство подобных исследований ограничено клиническими штаммами микроорганизмов. Связано это с тем, что многие патогенные микроорганизмы образуют биопленки в инфицированном ими макроорганизме или на поверхности медицинского оборудования (катетеры, глазные линзы и др.), что приводит к возникновению трудно излечиваемых рецидивов заболеваний. Между тем, изучение механизмов устойчивости биопленок сапротрофных микроорганизмов - не менее важная задача. В частности, необходимо знать, есть ли прямая связь повышенной устойчивости биопленок с патогенностью входящих в них микроорганизмов (например, с образованием факторов патогенности). Понимание механизмов устойчивости сапротрофных микроорганизмов - это важный шаг на пути разработки методов борьбы с нежелательным биопленкообразованием (в процессах биокоррозии и биообрастания технологического оборудования). С другой стороны, знания механизмов устойчивости могут быть ценным инструментом для стимуляции биопленкообразования в случае использования активности биопленок в процессах очистки природных сред от загрязнений (например, в системах водоподготовки). Эти знания также могут быть полезны для понимания процессов формирования и функционирования микробных сообществ в природных экотопах.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение динамики формирования биопленок сапротрофными микроорганизмами, изолированными из пластовых вод нефтяных месторождений, а также их модельными аналогами и выявление вклада внеклеточного полимерного матрикса в устойчивости этих биопленок к антимикробным веществам и экстремальным условиям среды.
Для достижения данной цели были поставлены задачи:
-
Определить сравнительную чувствительность планктонных культур и биопленок нефтеокисляющих микроорганизмов, изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений, а также модельных микроорганизмов к антибиотикам с различным механизмом действия (в качестве биохимических инструментов).
-
Разработать метод, позволяющий изучать динамику формирования биопленок (возникновение «биопленочного» фенотипа).
3. Разработать способы визуализации матрикса биопленок различными
микроскопическими методами.
4. Изучить сравнительную чувствительность планктонных культур изученных
микроорганизмов и их биопленок к экстремальным факторам среды (тепловому,
осмотическому и кислотному шоку).
Научная новизна работы
Разработан метод изучения динамики формирования биопленок. Для культур Kocuria sp., Dietzia sp., P.chlororaphis 66 установлено время перехода от планктонного способа существования к биопленочному, которое составляет 2-6 часов.
Установлено, что биопленки сапротрофных штаммов {Dietzia sp., Kocuria sp., Pseudomonas sp., Chromobacterium sp.) значительно более устойчивы к действию антимикробных препаратов, чем их планктонные культуры. Показано, что биопленки сапротрофных бактерий по этому свойству не отличаются от изученных другими исследователями биопленок патогенных штаммов бактерий.
Впервые для сапротрофных микроорганизмов обнаружено явление стимуляции биопленкообразования под действием суббактериостатических концентраций антибиотиков (азитромицина, рифампицина), которое было описано ранее лишь для патогенных микроорганизмов.
Впервые обнаружена повышенная устойчивость биопленок некоторых нефтеокисляющих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений, а также коллекционных культур) к неблагоприятным физико-химическим условиям среды: температуре, рН среды и к повышенной концентрации NaCl.
Практическая значимость работы
Показано, что внеклеточный полимерный матрикс играет важнейшую роль в обеспечении устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды. Это во многом объясняет закономерности существования и выживания сообществ микроорганизмов в природных экотопах (в почве, водоемах и нефтяных месторождениях), где экстремальные факторы среды периодически возникают или существуют постоянно.
Воздействие на внеклеточный полимерный матрикс в качестве мишени, поиск путей его эффективного разрушения может быть одним из успешных методов борьбы с биопленками.
В тех случаях, когда необходимо использовать полезные свойства биопленок (интенсификация процессов биодеградации субстратов, повышение нефтеизвлечения) стимуляцию биопленкообразования можно проводить путем создания благоприятных условий для формирования матрикса.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на III Всероссийском конгрессе с международным участием «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний-Новгород, 2010), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), а также на Молодежной школе конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010, 2011, 2012, 2013 году.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 5 экспериментальных статьях, 1 обзоре литературы и 10 тезисах конференций.
Место проведения работы и благодарности
Работа выполнена в лаборатории нефтяной микробиологии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН). Микроскопические исследования были выполнены на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Плакунову В.К., а также своим соавторам д.б.н. проф. Беляеву С.С, к.б.н. Журиной М.В. за практическую помощь, ценные советы на всех этапах выполнения работы.
Объём и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста и включают 30 рисунков и 3 таблицы. Список литературы» содержит 160 источников, в том числе 26 отечественных и 134 зарубежных.
