Введение к работе
Актуальность работы. На сегодняшний день единственным способом лечения врожденных и приобретенных клапанных пороков сердца и сосудов дегенеративного генеза является хирургическая замена поврежденных клапанов и сосудов соответствующим протезом или графтом (трансплантатом). Клиническое применение трансплантатов сосудов и клапанов сердца (ТСКС) в значительной степени связано с недостатками механических клапанов и фиксированных биопротезов, такими как тромбоэмболические осложнения, необходимость пожизненного приема антикоагулянтов, а также протезным эндокардитом, неспособностью к росту, поддержанию и обновлению структуры ткани, токсическим действием консервирующих агентов и т.д. (Mirensky et al, 2008; Demer et al, 2002; 2008; Haverich, 2008; Акатов и др., 2006, 2010). Альтернативой имеющимся протезам является применение модифицированных нефиксированных трансплантатов, которые не требуют приема антикоагулянтов, иммунодепресантов и потенциально способны к репопуляции и ремоделированию. Однако применение таких трансплантатов ограничено развивающейся после имплантации тканевой дегенерацией и кальцификацией матрикса (Cebotari et al, 2002; Wilhelmi et al., 2003; Vesely, 2005; Bratos-Perez et al, 2008; de Mel et al, 2008; Haverich, 2008; Muratov et al, 2010; Бокерия и др. 1997; 2004; Акатов и др. 2010), что требует проведения сложных повторных операций.
Клинические проявления кальцификации клапанного аппарата изучены досконально, однако споры о ее этиологии продолжаются с 1904 года (Monckeberg, 1904). Предлагаются различные гипотезы о механизме инициации кальциноза трансплантатов и биопротезов клапанов сердца. В частности, рассматривается предположение о связи инициации кальциноза ТСКС с компонентами погибших клеток (Ferraris et al, 1980; Valente et al, 1985; Розанова, Васин, 1999), с компонентами тканевого матрикса: с коллагеном I типа, фибронектином (Watson et al, 1998; Price et al, 2006), эластином (Bailey et al, 2003; Lee et al, 2006; Price et al, 2006; Hosaka et al, 2009; Ronchetti et al, 2013), кальций-связывающими белками (Gla-протеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин, фетуин А), фосфопротеинами (Shanahan et al, 1998; Proudfoot et al, 1998), щелочной фосфатазой (Hui et al, 1998; Price et al, 2008). Предполагается, что при гибели клеток в результате ферментативного лизиса может нарушаться связь гликозаминогликанов с коллагеном в тканевом матриксе, что также может способствовать образованию сайтов, аффинных к фосфатам кальция (Loose et al, 1993). Однако, несмотря на интенсивные исследования, ясного представления о комплексном механизме инициации кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца в настоящее время нет.
Основываясь на предположении о том, что основной причиной кальцификации и дегенерации ТСКС являются клетки донора, в последние двадцать лет активно разрабатываются способы предварительного обесклеточивания (децеллуларизации) матрикса графтов, либо принудительной контролируемой гибели в них клетки донора до имплантации (девитализация ткани) (O'Brien et al, 1999; Teebken et al., 2000; Schoen, Levy, 2005; Vesely, 2005; Lichtenberg et al, 2006; Tudorache et al, 2007). Предполагается, что в результате лизиса или гибели клеток донора до имплантации будет снижена иммуногенность и элиминированы центры нуклеации кальциноза.
Однако современные методы обесклеточивания матрикса трансплантатов не могут одновременно предотвращать дегенерацию, кальциноз и иммуногенность трансплантатов клапанов сердца и сосудов (Акатов и др., 2010). Таким образом, разработка новых высокоэффективных методов предварительной модификации трансплантатов остается одной из самых актуальных проблем тканевой инженерии.
Ранее в Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН была сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о том, что инициация кальциноза в трансплантатах обусловлена накоплением кальция и фосфатов в митохондриях погибающих клеток (Акатов и др., 2005; Фесенко (Рындина), 2006), на основании которой разработан и внедрен в медицинскую практику способ антикальцинозной девитализации (АКД), позволивший радикально снизить кальцификацию имплантированной ткани. (Акатов с соавт., 2007). С целью дальнейшего повышения биосовместимости ТСКС разработан способ ферментативного разрушения клеток донора в стенках аорты после АКД (Акатов и др., 2010) с максимальным сохранением нативной структуры тканевого матрикса. Однако такое разрушение спровоцировало восстановление способности трансплантатов к кальцификации и усилило клеточный ответ в организме реципиента. Эти результаты трудно объяснить на основе представлений о митохондриальном механизме кальциноза и указывают на множественный характер механизмов кальцификации ТСКС. Таким образом, возникает необходимость дальнейшего выяснения механизмов кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца, в частности необходимо выяснить роль структурных повреждений внеклеточного матрикса трансплантатов и участие клеток реципиента в инициации кальциноза имплантированной ткани.
Целью данной работы являлось выяснение механизмов кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца и разработка на основе полученных результатов способов ее подавления.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
оценка возможности подавления кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца при разрушении в них клеток донора до имплантации;
-
изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;
-
выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;
-
изучение роли повреждений внеклеточного матрикса трансплантатов сосудов и клапанов сердца в их в кальцификации;
-
разработка способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца на основе полученных результатов;
-
разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и клапанов сердца.
Новизна работы. В работе впервые показано, что известные из научной литературы способы децеллуларизациии трансплантатов клапанов сердца и сосудов повреждают структуру тканевого матрикса, сохраняя и(или) усиливая их способность к кальцификации. Впервые установлено, что кальцификация трансплантатов сосудов и клапанов сердца осуществляется в значительной степени при участии клеток реципиента, и липидные компоненты ТСКС играют решающую роль в инициации
кальциноза. Научная новизна заключается в том, что авторами впервые предложено представление о том, что механизм кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца является комплексным и включает механизмы зависимые и не зависимые от клеток реципиента. Авторами впервые предложена гипотеза о механизме зависимой от клеток реципиента кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов, основанная на представлениях об атеросклеротическом поражении сосудов и медиальном кальцинозе. Впервые показано, что независимые от клеток реципиента механизмы кальцификации ТСКС определяются структурными повреждениями коллагеновых и эластиновых волокон матрикса. Показана возможность предотвращения кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца путем их обработки до имплантации натуральным липофильным детергентом дезоксихолатом натрия, препятствующим аккумуляции кальция митохондриями, инактивирующим лизосомальные гидролазы и протеазы клеток донора, удаляющим инициаторные липидные компоненты матрикса и не нарушающим целостности внеклеточного матрикса трансплантатов (минимальные повреждения). Показано, что использование ростовых факторов в качестве хемоаттрактантов клеток реципиента может как провоцировать минерализацию ткани, так и усиливать репопуляцию матрикса графта клетками реципиента без развития кальциноза в зависимости от предимплантационной обработки трансплантатов сосудов и клапанов сердца.
Полученные данные расширяют представление о механизмах патологической кальцификации биологических тканей, что актуально не только для проблемы понимания механизма кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца, но и для проблемы патологической минерализации тканей в организме, в частности при медиальном кальцинозе и атеросклерозе сосудов.
Практическая значимость исследования заключается в том, что на основе проведенных исследований разработан эффективный способ предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Предложенный способ запатентован и внедрен в технологический регламент производства аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, г. Москва. Полученные в работе результаты могут быть использованы в качестве фундаментальной основы для разработки новых способов повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов.
Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены на IV и V Всероссийских съездах трансплантологов (Москва, 2008, 2010), Конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика '09,'10 (Пущино, 2009, 2010), IV и V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2010; Уфа, 2012), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальная и прикладная наука» (Пущино, 2010, 2012), Школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (Санкт-Петербург, 2011), Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013) и Всероссийском симпозиуме и Школе-конференции для молодых ученых по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
