Действие фузариотоксина Т-2 на сельскохозяйственную птицу и биоавтографический метод его определения в кормах Труфанова Валентина Александровна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 9

1.1. Фузариотоксикозы сельскохозяйственной птицы 9

1.2. Токсикозы вызванные трихотеценовыми микотоксинами II

1.3. Характеристика трихотеценовых фузариотоксинов и их продуцентов 14

1.4. Токсикобиологичеекая активность трихотеценовых фузариотоксинов 20

1.5. Экспериментальный Т-2 токсикоз сельскохозяйственной птицы 24

1.6. Методы определения трихотеценовых микотоксинов.. 31

1.6.1. Биологические методы 31

1.6.2. Физико-химические методы 34

1.7. Заключение по обзору литературы 36

2. Экспериментальная часть 40

2.1. Материалы и методы исследований 40

2.2. Определение микотоксинов вырабатываемых грибами Fusarium sporotrichlella Bilai 46

2.3. Токсическое действие Т-2 токсина на различные лабораторные объекты 50

2.4. Разработка биоавтографического метода определения Т-2 токсина в зерне и комбикорме 53

2.5. Действие Т-2 токсина на молодняк сельскохозяйственной птицы 65

2.5.1. Действие Т-2 токсина на организм цыплят .. 65

2.5.2. Действие Т-2 токсина на организм индюшат 72

2.5.3. Действие Т-2 токсина на организм утят 86

2.5.4. Действие Т-2 токсина на организм гусят... 96

2.6. Влияние Т-2 токсина на продуктивные и воспроизво дительные качества кур-несушек 102

3. Заключение 112

4. Выводы 120

5. Приложения для практики 122

Список литературы 123

Приложение

• Фузариотоксикозы сельскохозяйственной птицы
• Экспериментальный Т-2 токсикоз сельскохозяйственной птицы
• Материалы и методы исследований
• Действие Т-2 токсина на организм цыплят

Введение к работе

В "Основных направлениях экономического и социального развития СССР на I98I-I985 годы и на период до 1990 года", принятых ХХУІ съездом КПСС, указывается на необходимость дальнейшего производства продукции животноводства, повышения продуктивности скота и птицы. В этой связи прежде всего следует обеспечить поголовье физиологически полноценными кормами, свободными от каких-либо токсических веществ - ядохимикатов, фитотоксинов, никотоксинов, токсинов дрожжей и бактерий.

В условиях промышленного птицеводства и концентрации комбикормового производства особую роль как фактор загрязнения кормов играют микотоксины. При скармливании кормов, содержащих микотоксины, у животных развиваются патологические реакции -микотоксикозы, основное значение которых определяется снижением продуктивности, ухудшением естественной резистентности и иммунного состояния поголовья, увеличением отхода. К числу наиболее важных для практики групп микотоксинов относятся фузариотокси-нн, вырабатываемые грибами рода Fusarium секции Sporotri-сhiella, болезнетворное действие которых на животный организм впервые было установлено А.Х.Саркисовни и сотрудниками в 1942 году (1948, 1954).

Из числа спонтанных случаев иикотоксикозов птиц в нашей стране зарегистрированы только фузариотоксикозы; при этом, как правило, корма были поражены грибами Fusarium sporotrichiella Вії. (Яровой П.Ф.,1961; Бирбин C.G.,1967; Дорошко И.Н.,Котик А.Н., 1975)1 В этой связи фузариотоксикоз следует рассматривать как один из важнейших микотоксикозов птиц (Бирбин С .С, 1966а , 19666; Курманов И.А., I960, 1971; Спесивцева Н.А., 1964; Котик А.Н., 1976, 1980). Следует отметить, однако, что степень загрязнения кормов фузариотоксинами не определена из-за отсутствия достаточно чувствительных и достоверных методов.

К фузариотоксинам относят токсические стеролы (Олифсон Л.Е., 1957), зеараленон (Urry W. et al.,1966 ), бутенолид (Yates S.G« et al., 1968a, 1970) и трихотеценовые микотоксины (Bamburg J.R, et al.,I968). При фузариотоксикозах птиц этиологическая роль доказана только относительно одного из трихоте-ценовых микотоксинов - Т-2 токсина ( Wyatt R.D., Hamilton Р.В., 1975; Hamilton P.B., 1975; Котик A.H., 1976).

До настоящего времени в нашей стране не проводились исследования по изучению влияния Т-2 токсина на сельскохозяйственную птицу.

Настоящая работа является составной частью исследований выполненных в Украинском научно-исследовательском институте птицеводства по изучению роли кормовых токсинов в этиопатоге-незе заболеваний сельскохозяйственной птицы.

Научная новизна. Впервые разработан микробиологический (биоавтографический) метод обнаружения в кормах трихотеценового микотоксина Т-2 (Авторское свидетельство № 660653, 1979) с помощью дрожжеподобных микроорганизмов Candida pseudotropicalis.

Впервые в Советском Союзе получены экспериментальные данные о клиническом и патологоанатомическом проявлении фузариотоксикоза у четырех видов сельскохозяйственной птицы (кур, индеек, уток и гусей), вызванного включением в корм важнейшего из трихотеценовых фузариотоксинов - Т-2 токсина. Установлена зависимость развития признаков токсикоза у названных видов птицы от концентрации Т-2 токсина в корме. Определены минимальные концентрации Т-2 токсина в корме,не вызывающие у птицы развитие токсикоза: для кур - 0,2 мкг/г, для индеек, уток и гусей - 0,1 мкг/г.

Теоретическое и практическое значение работы. Установлено, что токсичность грибов Fusarium sporotrichiella , выделенных из образцов кормов различных районов нашей страны, обуславливается их способностью вырабатывать трихотеценовые микотоксины (Т-2, НТ-2 и неосоляниол).

Установлено также, что дрожжеподобные микроорганизмы из родов Saccharomyces и Candida характеризуются высокой чувствительностью и трихотеценовым микотоксинам.

Разработан простой и высокочувствительный биоавтографический метод обнаружения в кормах микотоксина Т-2 из группы 12-13-эпокси- трихотеценов, предназначенный для микотокси-кологического контроля кормов в условиях ветеринарных лабораторий.

Получены данные о клиническом и патолого-анатомическом проявлении Т-2 токсикоза, а также о степени развития признаков токсикоза в зависимости от концентрации Т-2 токсина в корме у основных видов сельскохозяйственной птицы.

Материалы исследований включены в "Методические рекомендации по диагностике и мерам профилактики микотоксикозов сельскохозяйственных птиц, вызываемых трихотеценовым микоток-сином Т-2", которые рекомендованы на ученом совете УНИИП 30 сентября 1981г. для внедрения в производство,рассмотрены и одобрены Центральной ветеринарной лабораторией Главного управления ветеринарии МСХ СССР. Результаты исследований используются как учебно-методические материалы на тему: "Биоавтографический метод определения в зерне и продуктах его переработки трихотеценовых микоток-синов" для международных курсов МО/ЮНЕП/СССР "Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами; контроль и мониторинг" по подготовке специалистов из развивающихся стран Азии, Африки и Латинской Америки.

В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие положения:

1. Грибы Fusarium sporotrichiella характеризуются способностью вырабатывать трихотеценовые микотоксины.

2. Т-2 токсин вызывает дермонекротическую реакцию при нанесении на кожу кролика, оказывает токсическое действие на аквариумных рыб гуппи и обладает антибиотической активностью в отношении дрожжеподобных микроорганизмов, относящихся к родам Candida и Saccharomyces,

3. Для биоавтографического определения трихотеценовых мико-токсинов в качестве тест-организма можно использовать штамм Candida pseudotropicalis 44ПК.

4. Биоавтографический метод позволяет обнаружить Т-2 токсин в зерне и комбикорме при минимальном содержании его

200 мкг/кг.

5. К Т-2 токсину чувствителен молодняк сельскохозяйственной птицы (куры, индейки, утки и гуси).

6. Клиническое проявление Т-2 токсикоза зависит от концентрации Т-2 токсина в корме, сходно у всех изученных видов птицы и характеризуется развитием некротических поражений слизистых оболочек ротовой полости и языка, угнетением, нарушением развития оперения, задержкой роста и увеличением смертности. 7. Токсическое действие Т-2 токсина на кур-несушек в начальный период яйцекладки проявляется в снижении продуктивности.

8. Для Т-2 токсикоза птиц характерно нарушение структурной организации тканей пищеварительного тракта, тимуса и печени.  

Фузариотоксикозы сельскохозяйственной птицы

Щузариотоксикозы птиц наблюдаются не часто, однако в отдельные годы они могут получить значительное распространение и вызвать ухудшение продуктивности и большой отход. Токсикоз цыплят от употребления пшеницы, пораженной Fusarium spororicniella, с гибелью до 80% поголовья наблюдал П.Ф.Яровой (1961). Известен случай токсикоза кур, проявившийся вялостью, взъерошенностью оперения, цианозом гребешков и бородок, снижением аппетита, поносом, угнетением, уменьшением в 2,5 раза яйценоскости, падежом 11% поголовья и развитием некрозов в пищеводе. При этом корм (пророщенное зерно) оказался токсичным по кожной пробе на кролике и заспоренным токсинообразую-щими грибами из рода Pusarium (Бирбин СС, 19666). Имеется сообщение о нескольких случаях фузариотоксикозов у бройлеров, характеризовавшихся, главным образом, развитием некротических поражений ротовой полости, снижением поедаемости корма, замедлением роста, увеличением отхода (до 10%). Заболеваемость охватывала 10-20% поголовья ( Wyatt R.D.et al.,1972)« Щузарио-токсикоз был зарегистрирован также у уток (Бирбин СС, 1966а). У голубей, которых кормили плесневелым кормом, отмечали развитие характерных для фузариотоксикоза некрозов ротовой полости; всего была поражена третья часть стада и около 5% поголовья пало ( Wyatt R.D., Weeks В.А. et al., 1972Ъ). Описан случай токсикоза гусят, характеризовавшийся отказом от корма, исхуданием, развитием некрозов в ротовой полости; 90% поголовья в течение первых трех недель жизни пало. Корм, из которого выделили токсигенные штаммы грибов рода Pusarium , оказался токсичным по результатам кожной пробы на кролике (Дорошко И.Н., Котик А.Н., 1975).

Следует отметить, что описанные вспышки фузариотоксикоза птиц отличались тяжелой формой. У пораженных птиц были обнаружены некрозы в ротовой полости, что характерно для токсикоза птиц вызываемого фузариотоксином Т-2. Однако, ввиду несовершенства соответствующих методов ни в кормах, ни в органах и тканях больных птиц не было идентифицировано токсическое начало и установлено его количество.

В последние годы разработка методов определения индивидуальных микотоксинов в кормах позволила ввести в диагностику микотоксикозов качественно новый элемент: идентификацию в корме токсического вещества, вызвавшего заболевание. В результате было установлено, что этиология ряда случаев кормовых токсикозов птиц в США., Канаде, Великобритании и Франции связана с загрязнением корма трихотеценовыми микотоксинами, вырабатываемыми преимущественно грибами Fusarium ( Wyatt R.D., Hamilton Р.В., 1975; Greenway J.A., Ruls M., 1976; Renault L.M., 1979; Robb J. et al., 1982). R.D.Wyatt et a-1. (1975) описали два случая токсикозов у кур--несушек характеризовавшихся развитием некрозов в ротовой полости, уменьшением яйценоскости и увеличением хрупкости скорлупы. При этом в корме и печени кур был обнаружен трихо-теценовый микотоксин Т-2. О токсикозе в 18 хозяйствах с общим поголовьем 300 тыс. цыплят сообщили L.M. Renault et al., (1979). Заболеваемость в отдельных стадах достигала 100%, симптомы: рахит, поражение центральной нервной системы, искривление плюсны, диаррея, ломкость перьев, кровоизлияния в мозг и под кожу в области груди и бедер, отсутствие пигментации и отставание в росте. В корме обнаружили Т-2 токсин, неосоляни-ол, веррукарол, фузаренон, трихотецин, кротокол и зеараленон. Описано заболевание бройлеров в Шотландии зимой 1980-81 годов: у цыплят 5-дневного возраста наблюдали повышенную возбудимость, скученность, увеличение отхода, отставание в росте, нарушение развития оперения у 10% поголовья. Из корма были изолированы грибы Fusarium (преимущественно F.moniliforme , а также р.сиїтоггши F.nivalє ) , а .в его компонентах (кукурузе и пшенице) обнаружены трихотеценовые микотоксины: диацетоксисцир-пенол и деоксиниваленол ( Robb J. et al., 1982).

В нашей стране описана вспышка токсикоза индюшат возрастом от 3-4 дней до 4 месяцев, проявившаяся увеличением отхода, угнетением, развитием некротических поражений слизистых оболочек ротовой полости и языка, а также кожи головы у 60-8($по-головья. В кукурузе, составлявшей основу рациона индюшат, был обнаружен Т-2 токсин; и из неё были выделены также штаммы F. sporotrichiella , вырабатывающие Т-2 токсин (Котик А.Н., 1976).

Приведенные выше сведения о случаях токсикозов птиц, диаг-носцированных как фузариотоксикоз, позволяют предположить, что они были вызваны, главным образом, трихотеценовыми мико-токсинами. Это предположение подтверждает и тот факт, что случаи фузариотоксикозов птиц, причиной которых были бы токсические стеролы и бутенолид, до настоящего времени не зарегистрированы (известен один случай гиперэстрогенизма у индеек связанный с загрязнением комбикорма зеараленоном в концентрации 1500 мкг/кг)( Mirocha C.J., Pathre S.V., 1977).

Экспериментальный Т-2 токсикоз сельскохозяйственной птицы

Экспериментальный Т-2 токсикоз изучен наиболее детально у цыплят-бройлеров и кур. У цыплят включение в рацион кристаллического токсина вызывало состояние токсикоза, которое характеризовалось развитием некротических поражений слизистых оболочек ротовой полости и языка, снижением потребления корма, отставанием в росте, нервными расстройствами, неправильным развитием оперения, изменением относительной массы внутренних органов, изменением состава компонентов и биохимических показателей крови.

Некротические поражения ротовой полости в виде желто-белых наложений развивались у цыплят при содержании в рационе 0,4--16,0 мкг/г Т-2 токсина. При концентрации 0,4 мкг/г некрозы развивались на пятой неделе скармливания токсичного корма (chi M.S. et al., 1977в), а при концентрациях I-16 мкг/г Т-2 в конце первой или в начале второй недели (Hamilton Р.В., 1971» Wyatt R.D. et al., 1972; Chi M.S. et al., 1977c; Mirocha J.J., 1978a). Первые некрозы обнаруживали на слизистой твердого неба и вдоль края языка, а затем на языковых сосочках, нижней поверхности языка, внутренней стороне нижнего клюва и в уголках рта. При высоких концентрациях токсина (8-16 мкг/г) размер поражений увеличивался до такой степени, что затруднял проглатывание корма. Концентрации 0,4-1,0мкг/г вызывали изолированные поражения на твердом небе и вдоль края языка. На ранней стадии формирования некротические очаги отделялись от ткани с кровотечением ( Hamilton Р.В. et al., 1971; Wyatt R.D. et al., 1972a,1972b; Richard J.L. et al.,1978).

Некротические поражения прогрессировали с увеличением периода скармливания токсина; их острота и размеры зависели от количества токсина в рационе. Данные, полученные при проведении опытов с кристаллическим Т-2 токсином совпадают с результатами опытов, в которых использовали культуру на зерне грибов рода Pusarium. Скармливание гусятам корма,инокулированного штаммами Fusarium , вызывало развитие легко отделяющихся желто-белых фибринозных наложений в ротовой полости (Дорошко И.Н., Котик А.Н., 1975; Palyusik М. et al., 1968). У индюшат включение в рацион 1% зерна, пораженного F. tricinctum, вызывало умеренное развитие некротических поражений по уголкам рта. У большинства индюшат, получавших 2$ такого зерна, развивались резко выраженные некрозы уголков рта ( Christensen СМ. et al., 1972). Из очагов поражения ротовой полости цыплят при эксперимен тальном Т-2 токсикозе выделено большое количество бактерий, включающих Staphylococcus epidermidis ; Е.соц } которые оказались авирулентными для цыплят. У контрольных птиц также выделены эти бактерии, но в гораздо меньших количествах ( Greenwey J.A. et al., 1976; Wyatt R.D. et al., 1976b). Такие же микроорганизмы изолированы из очагов поражения го 26 лубей при вспышке заболевания от заплесневелого корма (Wyatt R.D. etal., 1972а). Микроскопическое изучение некротических участков показало, что поверхностный слой состоит из фибрина; промежуточные слои, содержат инвагинации заполненные бактериальными клетками; наблюдали тяжелые инфильтрации нижележащих тканей лейкоцитами. Локализация бактерий вблизи поверхности говорит о вторичной роли бактерий при Т-2 токсикозе. Об этом свидетельствует также и неудачная попытка выделить микроорганизмы из крови и внутренних органов больных птиц; а также неудачная попытка изолировать из ротовой полости Candida albicans - микроорганизм способный вызывать оральные поражения у цыплят ( Wyatt R.D. et al., І972в). He были изолированы возбудители кандидамикоза, а также дерматофиты из некротических очагов ротовой полости при спонтанной вспышке фузариотоксикоза гусят и индюшат ( Yates S.G. et al.,1968а; Дорошко И.Н., Котик А.Н., 1975; Котик А.Н., 1976). Приведенные данные свидетельствуют о том, что некротические поражения ротовой полости птиц развиваются в результате прямого действия Т-2 токсина на слизистые оболочки и являются важным диагностическим признаком Т-2 токсикоза.

Поражение ротовой полости, по-видимому, приводит к недостаточному потреблению корма, что, в свою очередь, оказывает отрицательное влияние на рост и развитие молодняка. Об этом свидетельствует тот факт, что у цыплят и наиболее сильное развитие некрозов, и снижение потребления корма, и уменьшение живой массы наблюдается при содержании в рационе Т-2 токсина ,Burmeister H.R. et al.,1971; концентрациях превышающих 4 мкг/г ( Hamilton P.В. et al., 1971; Wyatt R.D. et al., 1972B; Chi M.S. et al., 1977c). В течение первых трех недель жизни потребление рационов, содержащих 4-16 мкг/г Т-2 токсина, вызывало резкое отставание цыплят в росте, но не влияло на сохранность цыплят (wyatt R.D. et al., 1975).

Аналогичное уменьшение живой массы индюшат вызывало потребление рационов с различным количеством зерна пораженного F. tricinctum , однако при этом отмечено значительное снижение сохранности ( Christensen СМ. et al., 1972). При Т-2 токсикозе птиц, отмечены признаки поражения нервной системы: неправильное положение крыльев, пугливость, преходящее нарушение рефлекса выпрямления (Wyatt R.D. et al.,1973а; Hoerr P.J. et al., 1982). Неправильное развитие оперения наблюдалось у цыплят при концентрации Т-2 токсина в корме 4-16 мкг/г. Птенцы, получавшие токсин в течение трех недель, были скудно покрыты короткими перьями, торчавшими в разные стороны, кончики большинства перьев были сломаны и отогнуты книзу. При этом отмечены некрозы эпидермиса перьев ( Wyatt R.D. et al., 1975; Hoerr F.J. et al., 1982a), некрозы зародышевой части перьевых бородок. Этот признак, наряду с другими, имеет диагностическое значение при Т-2 токсикозе ( Hoerr F.J. et al., 1982Ъ).

При Т-2 токсикозе цыплят отмечено увеличение относительной массы зоба и поджелудочной железы (при I-I6 мкг/г Т-2 токсина в корме) и уменьшение относительной массы селезенки, фабри-циевой бурсы (при 8-16 мкг/г) ( Hamilton Р.Б. et al., 1971; Christensen СМ. et al., 1972; Wyatt R.D. et al., 1973b; Boonchuvit B. et al., 1975; Chi M.S. et al., 1977c) И печени ( Hoerr F.J. et al., 1982a). Большинство исследователей отмечает при Т-2 токсикозе цыплят лишь незначительное изменение гемоглобина, общих протеинов, общего холестерола и общих липидов сыворотки, глюкозы и мочевой кислоты плазмы крови. Не отмечается изменений компонентов крови - лейкоцитов и эритроцитов ( Chi M.S. et al., І977в, 1977c; Wyatt R.D. et al., І973в). Т-2 токсин не действует на общую свертываемость крови ( Doerr J.A. et al., 1974). Изучение ферментов печени и сердца использовали как критерий определения повреждения тканей сердца и печени, так как повреждение этих органов вызывает увеличение активности ферментов в сыворотке крови. У цыплят, получавших токсин в концентрации 0,2-4,0 мкг/г,не отмечено изменений в активности ферментов, что согласуется с отсутствием патологических изменений в этих тканях при таких же концентрациях Т-2 токсина ( Clii M.S. et аі.,І977в). Однако при гистологическом изучении внутренних органов цыплят, получавших более 4 мкг/г Т-2 токсина, были обнаружены некрозы и атрофия лимфоидной и крово-творной тканей, некрозы гепатоцитов, эпителия желчных ходов, слизистой оболочки зоба, желудка и кишечника. Отмечена также гиперплазия желчных ходов, изменения в фолликулах щитовидной железы ( Chi M.S. et al., І977в, 1977c; Ноегг P.J. et al., 1981, 1982a, 1982в). Доказано, что при Т-2 токсикозе происходит нарушение абсорбции липидов, уменьшение панкреатической липазы и РНК- зы ( Osbom D.J. et al., 1982).

Материалы и методы исследований

В работе использовали семь токсинообразующих штаммов грибов Fusarium из коллекции токсигенных грибов лаборатории профилактики болезней сельскохозяйственной птицы Украинского научно-исследовательского института птицеводства (выделена А.Н.Котиком) Пять штаммов были выделены из проб пшеница урожая 1972 года, отобранных на Харьковском комбикормовом заводе: 1-І, 1-3 и 1-8 - из Красноярского края, 19-8 - из Омской области, 13-3 - из Алтайского края. Два штамма: 53-1 и 53-4 из пробы кукурузы, отобранной в одном из птицеводческих хозяйств Харьковской области в момент вспышки фузариотоксикоза гусят (Дорошко И.Н., Котик А.Н., 1975). Штамм P. sporotrichioidee sherb.(=F. sporotrichieiia вії.) 5328а получили из коллекции лаборатории антибиотиков и микологии Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии (выделен Е.С.Квашиной в 1954 году из нескошенного овса, вызвавшего кормовой токсикоз крупного рогатого скота в хозяйстве Московской области).

Штаммы хранили в пробирках на агаризованной среде Чапека при температуре 5-8. Пересевы проводили І раз в 3 месяца. Для накопления токсических веществ в качестве питательной среды использовали просо. В колбы емкостью І я помещали по 200 г зерна, увлажняли водой (30$) и стерилизовали в автоклаве при І атм в течение I часа. Для посева брали кусочки агара Чапека (1-1,5 см) с чистой двухнедельной культурой, выращенной в чашках Петри. Культивировали грибы в течение 5-7 суток при 28 и затем четыре недели при Полученные на зерне культуры инактивировали в автоклаве при X атм в течение часа, высушивали и измельчали на лабораторной мельнице. Экстрагирование микотоксинов производили диэтиловым эфиром или ацетоном (3 раза по 15 минут); экстракты фильтровали через бумажный фильтр и объединяли. Растворитель отгоняли на водяной бане при 60 Сухой остаток растворяли в ацетоне и использовали для определения токсичности. Токсичность изучаемых штаммов F. sporotricbiella Вії. определяли кожной пробой на кролике по А.Х.Саркисову (1954) и на аквариумных рыбах гуппи по методике И.А.Іфрманова и Т.А.Таланова (1975).

Для постановки кожной пробы использовали взрослых кроликов массой 1,5-2 кг с непигментированной кожей. Шерсть на боках тщательно выстригали и через несколько часов на оголенный участок кожи (3 х 4 см) наносили 1/2 часть экстракта из 10 г культуры. Через сутки наносили остальной экстракт. На каждом кролике ставили четыре пробы. Реакцию учитывали через 24 и 72 часа после повторной обработки; наблюдение проводили 1-1,5 месяца.

Для оценки степени токсичности штаммов грибов на рыбах гуппи ацетоновый экстракт из 10 г культуры растворяли в 5 мл ацетона и переносили в стеклянный сосуд с 500 мл воды (17-20), взятой из аквариума. В раствор помещали рыб гуппи и вели наблюдение, каждый час отмечая их гибель. Контролем служил 1%

Идентификацию микотоксинов в экстрактах культур проводили с помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием стеклянных пластинок с закрепленным слоем окиси алюминия для хроматографии или силикагеля ЛС%54 с 13% гипса приготовленных по общепринятой методике (Ахрем АД,, Кузнецова А.И., 1965). На пластинку наносили различные количества экстракта (5, 10 и 20 мкл), полученного из 10 г культуры на просе и растворенного в I мл ацетона.

Для разделения веществ применяли следующие системы растворителей: этилацетат-толуол (3:1), хлороформ - метанол (95:5), хлороформ - этанол - этилацетат (90:5:5), этилацетат - гексан (3:1), бензол - ацетон (3:2). После разделения веществ методом восходящей хроматографии пластинки высушивали в вытяжном шкафу. Для обнаружения токсических веществ на хроматограмме пластинки опрыскивали с помощью стеклянного пульверизатора 20$ раствором серной кислоты, нагревали до 120в течение 10 минут и просматривали в УФ свете. Для этой цели применяли облучатель ультрафиолетовый со светофильтром УФС-3 - 5. Микотоксины из группы трихотеценов обнаруживали по их способности флуоресцировать в УФ - свете голубым цветом ( Bamburg J»R»t 1972).

В качестве контроля использовали НТ-2 токсин и неосоляниол (получены от H.R, Burmeister, США) и зеараленон (получен от Н.А.Костюниной, ВНИИВС). Т-2 токсин в кристаллическом состоянии получали разработанным нами методом (Котик А.Н. и др., 1979). Для этого использовали культуру штамма F.sporotrichioides 5328а. Экстракт полученный из культуры на просе наносили на колонку силикагеля ЛСЛ 5/40 мкм, содержащего 13 % гипса. Соотношение сорбента к разделяемому экстракту составляло 10:1. Колонку последовательно промывали петролейним эфиром; смесями петролейного эфира с бензолом в соотношениях 4:1, 1:1 и 1:4; бензолом; смесями бензола с хлороформом в соотношениях 4:1, 1:1 и 1:4; хлороформом; смесью хлороформа с ацетоном 1:1; ацетоном. Контроль за разделением веществ осуществляли путем тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие Т-2 токсин, объединяли, упаривали и кристаллизовали из диэтилового эфира добавлением 10-12% гексана.

Действие Т-2 токсина на организм цыплят

Результаты наблюдений за клиническим состоянием опытной птицы показали, что у большинства цыплят, получавших от I до 16 мкг/г Т-2 токсина, на вторые-третьи сутки развивались изолированные некротические очаги коричневого цвета (размерами 1-2 мм) овальной формы симметрично расположенные на слизистой оболочке твердого неба. У цыплят, получавших 1и 2 мкг/г Т-2 токсина, к концу первой недели характер некрозов не изменился; у цыплят, получавших 4 и 8 мкг/г токсина, размеры очагов некроза на твердом небе увеличились, появились также некрозы на языке и нижней челюсти. У отдельных цыплят при 8 мкг/г некрозы обнаруживали в уголках рта. При 16 мкг/г потемневшие участки слизистой твердого неба увеличились в размерах; под темной корочкой появилась некротическая масса белого цвета творожистой консистенции. Некрозы появились также на языке и по краям нижней челюсти. При содержании в корме I мкг/г Т-2 токсина некрозы у цыплят к концу второй недели опытов уменьшились, при 2 и 4 мкг/г - не изменились, а при 8 и 16 мкг/г - увеличились; у многих цыплят был деформирован язык.

В конце опыта только у 2 из 10 цыплят, получавших I мкг/г токсина, нашли слабо выраженные желто-коричневые некрозы на складках твердого неба. У цыплят, получавших 2 и 4 мкг/г Т-2, некрозы твердого неба, нижней челюсти, верхушки языка были хорошо заметны (фото 2.5.1.I.). При дозе 8 мкг/г очаги некрозов приобрели творожистую консистенцию, распространились на все твердое небо, верхушку и сосочки языка, края нижней челюсти, уголки рта (фото 2.5,1.2,), На некротическую массу налипли комочки корма. Наиболее сильные некротические поражения были отмечены в ротовой полости цыплят, получавших 16 мкг/г Т-2 токсина. Верхняя челюсть представляла собой сплошную некротическую массу серого цвета творожистой консистенции, с которой смешались комочки налипшего комбикорма. Вся масса отторгалась легко и без кровотечения. Верхушка языка почернела, деформировалась, а у некоторых цыплят часть языка атрофировалась. Имелись также некрозы на нижней челюсти, языковых сосочках и в уголках рта.

Таким образом, некрозы развивались при концентрациях I мкг/г и более Т-2 токсина в корме; они затрудняли поедание корма, что могло быть одной из причин отставания цыплят в росте. Следует, отметить, что в описаниях полевых случаев фузарио-токсикозов кур и цыплят (Яровой П.., 1961а; Wyatt R.D. et al., 1972а; Дорошко И.Н., Котик А.й., 1975) также отметили некрозы в ротовой полости. В некоторых сообщениях подчеркивается, что массовое развитие характерных некротических поражений в ротовой Фото 2.5,1,1. Некротические поражения твердого неба, нижней челюсти и верхушки языка цыплят 21-дневного возраста при содержании в корме 4 мкг/г Т-2 токсина

Было замечено также, что у подопытных цыплят, получавших Т-2 токсин, нарушалось развитие оперения: оно было тусклым, взъерошенным; отдельные перья не прилегали друг к другу, а располагались относительно тела под разными углами. У многих -перьев концы были обломаны. Опахало пера становилось неплотным и теряло упругость. Особенно выраженным неправильное развитие оперения было в группах цыплят получавших более 4 мкг/г Т-2 токсина. Анализируя факт ненормального развития оперения у цыплят, вызванного Т-2 токсином, следует иметь в виду и другие причины подобных патологических явлений, в частности, несбалансированное кормление. Так, при недостатке лейцина и глицина наблюдали скручивание, изгиб и сморщивание перьев ( Heysted D.M. et al.t 1941; Klein G.J. et al.,I960). При недостатке витамина E и селена оперение цыплят было сморщенным и теряло пигментацию ( Supple W.C., 1966). Такие же изменения маховых перьев отмечали при недостатке пиридоксина ( Daghim N.J., Balloun S.W», 1963; Gehle M.N., Balloun S.W., 1965). Недостаток цинка вызывал патологические изменения в строении оперения крыльев, однако перо на теле цыплят имело при этом нормальный вид ( Supple W.C. et al., 1961). Можно заключить, что наблюдаемый нами аномальный вид оперения у цыплят, вызванный Т-2 токсином, для которого характерно расположение перьев относительно тела под разными углами и неплотное прилегание перьев друг к другу, носит характер специфического патологического процесса и.по-видимому, может иметь диагностическое значение. Данные по сохранности цыплят представлены в таблице Опыты показали, что в контрольных группах сохранность цыплят составляла 100%; такая же сохранность была и в группах, корм которых содержал I или 2 мкг/г Т-2 токсина. При больших концентрациях отмечали случаи гибели цыплят: при 4 и 8 мкг/г пало по I цыпленку из 20; при 16 мкг/г - 5 из 20.