Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Функциональная морфология поджелудочной железы при старении 16
1.2. Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки клеток поджелудочной железы 18
1.2.1. Факторы дифференцировки клеток поджелудочной железы 18
1.3. Роль факторов пролиферации и апоптоза в функционировании клеток поджелудочной железы 26
1.4. Применение пептидных лекарственных препаратов в лечении сахарного диабета 28
1.5. Влияние аминокислот на клетки поджелудочной железы 29
1.6. Геропротекторное действие коротких пептидов 30
1.6.1. Влияние коротких пептидов на функции поджелудочной железы при старении 31
1.7. Предполагаемый механизм действия коротких пептидов 32
1.8 Виды взаимодействий лекарственных препаратов и белков с молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты 34
1.8.1. Взаимодействие лекарственных препаратов с дезоксирибонуклеиновой кислотой 34
1.8.2. Взаимодействие белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Экспериментальные методы исследования 41
2.1.1. Пептидные биорегуляторы 41
2.1.2. Приготовление раствора пептидов для введения в культуры клеток поджелудочной железы 42
2.1.3. Методика органотипического культивирования клеток 42
2.1.4. Методика диссоциированного культивирования клеток 44
2.1.4. Иммуноцитохимическое исследование 45
2.1.5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений 46
2.1.6. Метод количественного ПЦР-анализа 46
2.2. Физические методы исследования взаимодействия пептида KEDW с молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты 47
2.2.1. Приготовление растворов дезоксирибонуклеиновой кислоты и пептида 47
2.2.2. Спектральные методы исследования 48
2.2.3. Вискозиметрия 48
2.3. Теоретические методы исследования комплексов дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом 49
2.3.1. Моделирование оптимальной конформации пептидов 49
2.3.2. Расчет индекса гидрофобности пептидов 52
2.3.3. Анализ последовательностей генов и гистонов 52
2.3.4. Моделирование молекул дезоксирибонуклеиновых кислот и гистонов 54
2.3.5. Докинг 55
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 56
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований действия пептида Kedw на экспрессию сигнальных молекул поджелудочной железы 57
3.1. Влияние пептида KEDW на ткань поджелудочной железы у молодых и старых крыс 57
3.2. Исследование действия пептида KEDW на экспрессию факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении 60
3.2.1 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Pdx1 60
3.2.2 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Ptf1a 61
3.2.3 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Pax6 62
3.2.4 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Foxa2 64
3.2.5 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Nkx2.2 65
3.2.6 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Pax4 66
3.2.7 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Hoxa3 67
3.2.8 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию Cxcl12 68
3.2.9 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию генов факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы 69
3.3. Экспрессия факторов пролиферации и апоптоза в клетках поджелудочной железы 71
3.3.1 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию проапоптозного белка p53 71
3.3.2 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию антиапоптозного белка Mcl-1 72
3.3.3 Исследование действия пептида KEDW на экспрессию белков пролиферации Ki67 и PCNA 73
3.3.4. Анализ микроскопических изображений 75
3.4. Исследование спектральных характеристик образования комплексов дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидами 75
3.4.1. Спектральные характеристики образования комплекса дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом KEDW 75
3.4.2. Спектральные характеристики образования комплекса дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом сравнения AEDL 83
3.5 Обсуждение результатов экспериментальных исследований 89
Глава 4. Результаты теоретических исследований взаимодействия пептида KEDW с молекулами ДНК и гистонов 92
4.1 Конформационный анализ пептидов KEDW и AEDL 92
4.1.1 Конформационный анализ KEDW 92
4.1.2 Конформационный анализ AEDL 93
4.1.3 Сравнительный анализ конформаций KEDW и AEDL 94
4.2 Моделирование взаимодействия пептидов с участками дезоксирибонуклеиновой кислоты 96
4.3 Поиск сайтов связывания в промоторных областях генов для пептида KEDW 104
4.4 Моделирование взаимодействия пептидов с гистонами 107
4.4.1. Локализация гистонов в нуклеосоме 107
4.4.2. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами H2А 109
4.4.3. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами H2B 113
4.4.4. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами H3.2 116
4.4.5. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами H4 120
4.5 Обсуждение результатов теоретических исследований 126
Заключение 130
Литература 134
- Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки клеток поджелудочной железы
- Влияние коротких пептидов на функции поджелудочной железы при старении
- Приготовление раствора пептидов для введения в культуры клеток поджелудочной железы
- Исследование действия пептида KEDW на экспрессию факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении
Введение к работе
Актуальность проблемы
Встречаемость сахарного диабета 2-ого типа и хронического панкреатита неуклонно возрастает [Wild S. et al., 2004]. По данным экспертной комиссии ВОЗ, к настоящему времени сахарным диабетом страдают более 600 млн человек в мире. Этот показатель ежегодно возрастает на 5-10%. Увеличение распространенности сахарного диабета в первую очередь наблюдается среди лиц старше 60 лет [Дедов И.И., 1998; Дедов И.И., Шестакова М.В. 2009]. По степени важности это заболевание стоит непосредственно после сердечных и онкологических заболеваний. Хронический панкреатит также является распространенным заболеванием поджелудочной железы. В разных странах панкреатит составляет 5–7 новых случаев на 100 000 человек. При этом за последние 50 лет произошел примерно двукратный прирост заболеваемости. Это связано не только с улучшением диагностики заболевания, но и с усилением воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, которые ослабляют защитные механизмы, а также с постарением населения развитых стран [Минушкин О.Н., 2001; Дедов И.И и соавт., 2011].
Одной из причин ассоциированного с возрастом развития сахарного диабета 2-ого типа и хронического панкреатита является уменьшение численности ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы [Шестакова М.В., Викулова О.К. 2007]. На субклеточном уровне это связано с нарушением экспрессии сигнальных молекул – маркеров функциональной активности клеток поджелудочной железы.
В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии был синтезирован пептид KEDW (Lys-Glu-Asp-Trp-NH2) [Khavinson V.Kh. et al., 2009]. В экспериментальных исследованиях на животных и при клинических испытаниях у пациентов (60-75 лет) с сахарным диабетом 2-го типа выявлено, что пептид снижает уровень глюкозы в крови. Уcтaновлено, что при aллокcановом cахарном диабете у крыc пептид cпособcтвовал достоверному снижению уровня глюкозы в крови на 35%, что корреллировало с уменьшением летальных исходов [Khavinson V.Kh. et al., 2010]. У пациентов, страдающих сахарным диабетом 2-го типа, пептид снижал уровень глюкозы в крови натощак и при стандартном глюкозотолерантном тесте, уменьшал концентрацию инсулина в плазме крови и индекс инсулинорезистентности [Korkushko O.V. et al., 2011]. Кроме того, установлено, что пептид способен проникать в ядро и ядрышко клеток и модулировать действие эндонуклеаз [Федореева Л.И. и соавт., 2011; Fedoreyeva L.I. et al., 2011]. Однако молекулярный механизм его действия изучен недостаточно.
Целью исследования явилось изучение молекулярных механизмов действия пептида KEDW на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы при старении.
Задачи исследования
-
Исследовать влияние пептида KEDW на развитие процессов пролиферации в эксплантатах от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани поджелудочной железы.
-
Оценить возрастную динамику экспрессии факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы (Ptf1a, Hoxa3, Cxcl12, Pdx1, Pax6, Pax4, Foxa2, Nkx 2.2) в диссоциированной культуре под действием исследуемого пептида KEDW и контрольного пептида AEDL.
-
Изучить возрастные особенности экспрессии проапоптотического (р53) и антиапоптозного (Mcl-1) белков и факторов пролиферации (Ki67, PCNA) в диссоциированной культуре клеток поджелудочной железы под действием исследуемого пептида KEDW и контрольного пептида AEDL.
-
Провести исследование влияния пептида KEDW на экспрессию генов PDX1, NGN3, MNX1, PAX6, FOXA2, NKX2-2, NKX6.1, HOXA3, PAX4 в культуре клеток поджелудочной железы.
-
Оценить физическими методами исследования взаимодействие пептида KEDW с дезоксирибонуклеиновой кислотой.
-
Найти предполагаемые сайты связывания для пептида KEDW в промоторных участках генов PDX1, NGN3, MNX1, PAX6, FOXA2, NKX2-2, NKX6.1, HOXA3, PAX4.
-
Выявить различия структурно-конформационного и физико-химического поведения пептида KEDW и контрольного пептида AEDL.
-
Построить компьютерные модели межмолекулярного, атом-атомного взаимодействия исследуемого пептида KEDW и контрольного пептида AEDL с молекулами дезоксирибонуклеиновой кислоты и коровыми гистонами.
Научная новизна работы
Впервые выявлены молекулярные изменения клеток поджелудочной железы при старении, выражающиеся в снижении синтеза и экспрессии функционально важных сигнальных молекул - факторов пролиферации и дифференцировки эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы. На клеточном уровне установлено, что пептид KEDW способен усиливать процессы репарации и восстановления сниженных или утраченных функций клеток поджелудочной железы путем активации экспрессии ряда сигнальных молекул. Экспериментально выявлено, что наиболее выраженный эффект пептид проявляет в «старых» культурах клеток. Установлено, что пептид KEDW обладает тканеспецифичностью - во всех исследуемых группах был выявлен эффект пептида KEDW на культуры клеток поджелудочной железы, тогда как контрольный пептид AEDL не обладает таким действием. Пептид KEDW способен усиливать экспрессию генов факторов дифференцировки эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы в «старых» культурах клеток. Пептид обладает антиапоптозным действием на клетки поджелудочной железы, которое особенно выражено в «старых» культурах клеток.
Впервые было изучено взаимодействие пептида с ДНК методами кругового дихроизма, вискозиметрии и УФ-спектроскопии. Установлено, что пептид связывается с ДНК, но этот процесс протекает достаточно медленно (в течение нескольких часов) и практически без участия электростатических сил. В результате комплексообразования, которое реализуется в большой бороздке ДНК с участием азотистых оснований и пептида, наблюдается снижение изгибной жесткости ДНК и дестабилизация вторичной структуры макромолекулы.
Впервые получена атомистическая модель молекулярного взаимодействия пептида KEDW с дуплексом ДНК. Выявлено, что пептид взаимодействует с азотистыми основаниями ДНК, образуя с ними водородные, ионные, -катионные, стекинговые и гидрофобные связи. Впервые получена атомистическая модель взаимодействия пептида с гистонами. Наиболее энергетически выгодные комплексы пептид образует с коровым гистоном H3.2, выполняющего важную роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Выдвинуто предположение, что связывание пептида KEDW с ДНК и гистонами может служить одним из механизмом его панкреопротекторного действия.
Практическая ценность работы
С точки зрения клеточной биологии детальное выяснение молекулярных изменений в клетках поджелудочной железы при старении значительно расширяет представление о механизмах развития патологии поджелудочной железы, ассоциированной с возрастом. Проведенные цитологические и гистологические исследования позволили выявить новую клеточную фармакотропную мишень для действия пептида KEDW - малодифференциированные клетки поджелудочной железы. Это позволяет расширить сферу его возможного терапевтического применения в лечении нарушений метаболического обмена, связанных с ухудшением функций -клеток, посредством их замещения, а также повышения их функциональной активности при возрастной инволюции. Важно отметить, что пептид KEDW может явиться препаратом, обеспечивающим сохранность функционирования поджелудочной железы за счет дифференцировки клеток, находящихся на стадии покоя в различных субпопуляциях клеток поджелудочной железы.
Предложенные компьютерные модели комплексов пептида KEDW с ДНК и коровыми гистонами необходимы для понимания молекулярных механизмов действия коротких пептидов и их роли в эпигенетической регуляции различных процессов в клетке при старении. Достигнутый уровень рассмотрения атом-атомных взаимодействий является принципиальной точкой развития дальнейших работ, связанных с направленным поиском и конструированием лекарственных средств, предназначенных для предупреждения или лечения возрастных патологий поджелудочной железы.
Положения, выносимые на защиту
-
Пептид KEDW обладает способностью стимулировать пролиферативные процессы в ткани поджелудочной железы старых крыс.
-
Основным изменением поджелудочной железы является снижение синтеза факторов дифференцировки (Ptf1a, Pdx1, Pax6, Foxa2, Nkx 2.2, Hoxa3) и пролиферации (PCNA, Ki67) при старении в эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы.
-
Геропротекторное свойство пептида KEDW выражается в нормализации экспрессии факторов дифференцировки и пролиферации панкреатических клеток, что приводит к восстановлению функциональной активности поджелудочной железы при старении и доказывает возможность пептидной регуляции функций поджелудочной железы.
-
Увеличение экспрессии генов факторов дифференцировки в культурах клеток поджелудочной железы при добавлении пептида KEDW указывает на его эпигенетический механизм действия. Наиболее выраженный эффект проявляется в «старых» культурах клеток.
-
Пептид KEDW образовывает устойчивые комплексы с ДНК. Низкая скорость образования комплекса с ДНК объясняет более позднее проявление его максимального эффекта.
-
Предложенные компьютерные модели взаимодействия пептидов с ДНК и коровыми гистоновыми белками по уровню детализации достигают атомистической точности, что открывает дополнительные возможности для обоснования характера молекулярных механизмов пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении.
Связь с планом НИР
Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 24 научных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на VII научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); на V юбилейной Международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2012» (Белгород, Россия, 2012);. на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2012); на IV Ежегодной научной конференции «ФЦСКЭ имени В.А. Алмазова» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на II Международной конференции «Генетика старения и долголетия» (Москва, Россия, 2012); на Международном форуме «Старшее поколение 2012» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное»; на VIII Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на научно-практической конференции с международным участием «Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика»; на III Съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, Россия, 2012); на Международном совещании «Количественный имиджинг и спектроскопия в нейронауках» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на VIII научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2012); на 20 Мировом конгрессе IAGG международной ассоциации геронтологов и гериатров по геронтологии и гериатрии (Сеул, Южная Корея, 2013); на конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы геронтологии и гериатрии» (Киев, Украина, 2013); на Европейской конференции, посвященной использованию программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012 (Амстердам, Нидерланды, 2013); на VIII Европейском конгрессе по биогеронтологии (Беэр-Шева, Израиль, 2013); на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, Россия, 2013); на молодежной научной конференции «Студенты и молодые ученые - инновационной России» (Санкт-Петербург, Россия, 2013);
на Всероссийской молодежной конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты старения. Хрупкость: модели, маркеры, фенотипы. Результаты проекта “Хрусталь”» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).
Личный вклад автора
Основные результаты получены лично автором, как и их анализ с применением современных методов статистической обработки.
Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в планировании, проведении экспериментов, статистической обработке и анализе данных молекулярного механизма взаимодействия пептидов с молекулами ДНК и гистонами. Автор принимала участие во всех экспериментах, включавших в себя органотипическое и диссоциированное культивирование клеток, иммуноцитохимическое окрашивание, микроскопию, морфометрию, физические методы исследования и молекулярное моделирование взаимодействия пептидов с ДНК и коровыми гистонами, а также статистический анализ данных.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложению собственных результатов исследования и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список литературы содержит 197 источников, в том числе 35 отечественных и 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 62 рисунками.
Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки клеток поджелудочной железы
В современной клеточной биологии, медицине и геронтологии особое значение имеют исследования, связанные с выяснением роли транскрипционных факторов и факторов дифференцировки в механизмах поддержания необходимого количества высокоспециализированных клеток, способных выполнять свою функцию. Выяснение механизмов дифференцировки клеток, лежащих в основе регуляции процессов жизнедеятельности, позволяет более успешно решать вопросы диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний. Транскрипционными факторами являются белки, контролирующие перенос информации с молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в структуру матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) путем связывания со специфическими участками ДНК [Latchman D.S., 1997; Karin M., 1990]. Транскрипционные факторы выполняют свою функцию либо в комплексе с другими белками, либо самостоятельно [Roeder R.G., 1996; Nikonov D.B., Burley S.K., 1997]. Они обеспечивают снижение или повышение константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена [Lee J.C. et al., 2001; Gray S. et al., 2011].
Нормальное функционирование -клеток является главным условием для поддержания гомеостаза глюкозы в организме. Это может выполняться оптимальной экспрессией ключевых транскрипционных факторов дифференцировки, которые включены в процесс развития клеток поджелудочной железы. Определение механизма регуляции транскрипционных факторов и их участие в регуляции важных для -клеток генов, таких, как гена препроинсулина, может помочь разобраться с механизмом, приводящим к развитию дисфункции -клеток. В процессе созревания поджелудочной железы транскрипционные факторы дифференцировки последовательно запускают экспрессию различных генов для того, чтобы обеспечить нормальный органогенез [Manzanares M. et al., 2001; Jing S. et al., 2012]. Специфические транскрипционные факторы активируются в процессе раннего развития поджелудочной железы и дифференцировки -клеток. Они могут быть выключены после созревания -клетки, предоставляя место для других транскрипционных факторов, участвующих в регуляции зрелых -клеток. Некоторые транскрипционные факторы, Pdx1, Pax4, NeuroD1, Nkx6.1, и NKX2-2, включены как в процессы регуляции развития клеток-предшественников, так и в созревании эндокринных клеток поджелудочной железы. Для обеспечения нормального органогенеза различных типов эндокринных клеток поджелудочной железы необходима активация нескольких транскрипционных факторов. Считается, что Pdx1, Pax6, NeuroD1 и NKX2-2 являются основным транскрипционным комплексом, обогащающим клетками островки Лангерганса, и которые способствуют регулировки экспрессии генов селективных к -клеткам [Cissell M.A. et al., 2003]. Таким образом, в настоящее время определены основные гены, контролирующие развитие клеток поджелудочной железы: PDX1, PAX6, ISL1, NEUROD, NGN3, MNX1, MaFA [Sander M. et al., 1997; Polak M. et al., 2000; Madsen O.D. et al., 2007]. В ряде работ установлено, что введение одного ключевого панкреатического транскрипционного фактора Pdx1 в эмбриональные стволовые клетки и мультипотентные стромальные клетки человека приводит к их дифференцировке в инсулин-продуцирующие -клетки [Федюнина И. А., 2011; Soria B., 2000]. Знание генетических механизмов развития клеток поджелудочной железы может помочь решить проблему недостатка -клеток путем активации панкреатической дифференцировки стволовых клеток.
Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1) является ключевым транскрипционным фактором, участвующим в раннем развитии поджелудочной железы, дифференцировке -клеток и поддержании необходимого количества зрелых -клеток как у экспериментальных животных, так и у людей [Cerf M.E. et al., 2005; Campbell S.C. et al., 2002]. Во взрослых -клетках Pdx1 регулирует транскрипцию генов инсулина [Ohlsson H. et al., 1993], GLUT-2 [Waeber G. et al., 1996], глюкокиназы и Nkx 6.1 [Pedersen J.K. et al., 2005]. Белок VP16 усиливает функционирование Pdx1. Pdx1/VP16 экспрессия вместе с NeuroD1 или Ngn3 индуцирует транскрипцию гена инсулина и различных факторов, необходимых для функционирования -клеток. Ген инсулина имеет сайт связывания для Pdx1 в проксимальном промоторе [Iype T. et al., 2005; Rong A. et al., 2010]. Коактиватор p300 взаимодействует с Pdx1 и усиливает транскрипционную активность через многочисленные механизмы, включая увеличение и активацию компонентов базального транскрипционного механизма и гистон/белок активацию. Pdx1, MafA и NeuroD1/E47 действуют соответственно через сайты A1, C1 и E1, локализованные в проксимальном промоторе гена инсулина [Gerrish K. et al., 2000]. Наиболее выраженное действие на промотор гена инсулина оказывает Pdx1. Две высоко консервативных последовательности в 5 -фланкирующем регионе гена Pdx1 (PH1/area1 и PH2/area2) предоставляет -клеточную специфическую транскрипционную активность на гетерологичных промоторах [Gerrish K. et al., 2000]. Pdx1 может связываться с регионом PH1/area1 и запускать собственную транскрипцию [Longo A. et al., 2006]. Транскрипцию Pdx1 могут активировать NeuroD1, Foxa2, Hnf-1 и Hnf-3 [Gerrish K. et al., 2004; Nan G. et al., 2008]. Мутации в гене PDX1 приводят к нарушению развития и функционирования -клеток и развитию сахарного диабета как у экспериментальных животных, так и человека.
В период эмбрионального развития ген PDX1 экспрессируется в эндодермальных клетках. Под действием Pdx1 эпителиоциты дифференциируют в клетки дивертикулы поджелудочной железы и, в последствии, в эндокринные и экзокринные клетки поджелудочной железы. В развивающихся -клетках одновременно экспрессируются гены белков Pdx1, Nkx6.1. Этот процесс приводит к активации экспрессии гена MafA, необходимого для созревании -клеток. Pdx1 запускает экспрессию генов инсулина и соматостатина, одновременно репрессируя ген глюкагона [Knepel W. et al., 1990]. При старении наблюдается снижение мРНК инсулина и GLUT2 [de Barros Reis et al., 2008]. В опытах на старых крысах было показано снижение уровня мРНК инсулина и Pdx1 на 50% по сравнению с молодыми крысами [Perfetti R., et al. 2000]. Известно, что введение гюкагонподобного пептида-1 (ГПП-1) приводит к увеличению уровней мРНК инсулина и Pdx1. Такой эффект был связан с активацией экспрессии гена PDX1 пептидом ГПП-1.
В поджелудочной железе Nkx2.2 экспрессируется в инсулин-продуцирующих -клетках, глюкагон-продуцирующих -клетках и панкреатический полипептид -секретирующих РР-клетках островков Лангерганса. Экспрессия гена NKX2-2 не обнаружена в соматостатин-содержащих -клетках. В поджелудочной железе Nkx2.2 регулирует экспрессию гена NEUROD1 в гормон-продуцирующих эндокринных клетках поджелудочной железы. Белок NeuroD1 необходим для регуляции транскрипции гена инсулина [Furuta H. et al., 1998; Sussel L. et al., 1998]. Мутация гена NEUROD1 может привести к развитию сахарного диабета различных типов MODY у молодых людей, вызванного нарушением синтеза инсулина [Yamagata K. 2003]. Ген NKX2-2 является мишенью для белка Pdx1 и начинает экспрессироваться в клетках-предшественниках эндокринных клеток поджелудочной железы сразу после активации гена PDX1. В процессе дифференцировки панкреатических клеток экспрессия гена NKX2-2 сохраняется только в эндокринных -, -, и РР-клетках [Doyle M.J., Sussel L. 2007; Papizan J.B. et al., 2011]. В отсутствие гена NKX2-2 в -клетках не происходит активации гена препроинсулина и отсутствует экспрессия гена NKX6.1 (Nk6 transcription factor homolog A), что приводит к прекращению дифференцировки -клеток [Sussel L. et al., 1998]. Промотор гена NKX2-2 содержит сайты связывания для Foxa2 и Pdx1 [Pauls S. et al., 2007]. Фактор дифференцировки Nkx2.2 в свою очередь связывается с промотором гена инсулина и PAX4 [Furuta H. et al. 1998]. Ngn3 (neurogenin 3).
Влияние коротких пептидов на функции поджелудочной железы при старении
Короткий пептид KEDW был создан как миметик инсулинотропных пептидов [Хавинсон В.Х. 2005; Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2008; Балин В.Н. и соавт., 2000]. Его биологическая активность впервые была проверена на модели аллоксанового диабета у крыс. Крысам вводился аллоксан в дозе 35 мг/кг массы тела. Аллоксан по своей структуре похож на пиримидиновые основания урацил и тимин, поэтому может интеркалировать в ДНК и нарушать синтез белков, в частности инсулина. Пептид KEDW вводили в дозе 3 мкг на 3 мл NaCl в течение 44 дней, что способствовало нормализации синтеза инсулина [Khavinson V.Kh et al., 2007; Khavinson V.Kh et al., 2010]. Впервые было предположено, что вероятным механизмом стимуляции биосинтеза инсулина пептидом является его взаимодействие с большой бороздкой двойной спирали ДНК в промоторном участке гена, что может привести к конкурентному вытеснению аллоксана гидрофобной боковой группой остатка триптофана [Хавинсон В.Х., Малинин В.В. 2008]. На крысах в модели локальной патологии (стрептозотоцинового диабета), связанной с частичным некрозом -клеток поджелудочной железы и формированием инсулиновой недостаточности в качестве ускоренного экспериментального старения, исследовалось действие пептида KEDW [Хавинсон В.Х. и соавт., 2010]. В течение 10 дней крысам per os вводили раствор пептида в дозе 400 мкг/кг массы тела и исследовали уровень глюкозы в крови, цис-гидроксипролина и инсулиноподобного фактора роста. Накопление метаболита цис-гидроксипролина в плазме крови свидетельствовало о преждевременном старении организма. Введение пептида приводило к нормализации уровня глюкозы и инсулиноподобного фактора роста в крови, а также снижало количество цис-гидроксипролина. В другом эксперименте пептид нормализовал адгезивность эндотелия микрососудов брыжейки и снижал уровень глюкозы в крови у крыс при пероральном и внутримышечном введениях [Хавинсон В.Х. и соавт. 2007].
Клинические исследования показали эффективность применения пептида KEDW у лиц старших возрастных групп, страдающих сахарным диабетом 2-го типа [Коркушко О.В. и соавт., 2009; 2011]. Исследовались две группы пациентов: 30 здоровых и 33 больных сахарным диабетом 2-го типа. Под влиянием пептида KEDW у больных сахарным диабетом 2-го типа снижался уровень глюкозы в крови и индекс инсулинорезистентности. Снижение мелатонинобразующих функций эпифиза, которое происходит при старении, может способствовать развитию инсулинорезистентности у людей пожилого возраста. Помимо корригирующего влияния на нарушенные показатели углеводного обмена применение пептида KEDW увеличивало продукцию ночного мелатонина в крови, оказывал дополнительный сахароснижающий эффект у больных с высокой исходной резистентностью к инсулину и гиперинсулинемией, улучшал липидный состав сыворотки крови, функционального состояния эндотелия, и реологические свойства крови [Коркушко О.В. и соавт. 2013]. Другой пептид с последовательностью Ala-Glu-Asp-Gly-OH исследовался на лабораторных приматах. Изучалось его действие на островковый аппарат поджелудочной железы и обмен глюкозы [Хавинсон В.Х., Шутак Т.С., 2000; Гончарова Н.Д. и соавт. 2004]. Установлено, что пептид Ala-Glu-Asp-Gly-OH восстанавливал понижающуюся с возрастом толерантность к глюкозе и динамику уровня инсулина в ответ на нагрузку глюкозой приматов.
Предполагаемым механизмом действия пептида KEDW является взаимодействие с промоторным участком генов белков, экспрессию которых он увеличивает [Khavinson V. et al., 2005; Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2008; Хавинсон В.Х. и соавт., 2012]. Были проведены работы по изучению взаимодействия коротких пептидов, в том числе пептида KEDW, с одно- и двуцепочечными дезоксирибоолигонуклеотидами и комплексами ДНК -фага [Fedoreyeva L.I. et al., 2011a]. О взаимодействии пептидов с олигонуклеотидами и ДНК судили по влиянию пептидов на спектры флуоресценции меченных 5,6-карбоксифлуоресцеином дезоксирибоолигонуклеотидами, а также на спектры флуоресценции FITC-меченного пептида KEDW при добавлении ДНК -фага. Пептид KEDW практически в одинаковой степени тушил флуоресценцию одноцепочечной олиго(dA) и олиго(dT) и не влиял на флуоресценцию олиго(dC) и олиго(dGC). В опыте с флуоресцентно-меченными ДРОН выявлено небольшое связывание пептида KEDW с одно- и двуцепочечным участком FAM-GCGGCGGATCCGGCGGCGGCG. В опыте с ДНК -фага показано, что при введении ДНК -фага в раствор с FITC-меченным пептидом KEDW наблюдалось сильное тушение флуоресценции, что свидетельствует о связывание пептида с ДНК. Таким образом, пептид взаимодействовал как с короткими одно- и двутяжевыми дезоксирибоолигонуклеотидами, так и с ДНК [Fedoreeva L.I. et al., 2011a]. Установлено, что пептиды могут влиять на синтез белков и экспрессию генов [Dmitrieva V.G. et al., 2008]. Так, пептиды семакс и Pro-Glu-Pro воздействуют на экспрессию генов нейротрофинов у животных. У крыс под действием cемакса уровень мРНК генов рецепторов нейротрофинов снижался, а под действием Pro-Glu-Pro – увеличивался. Применение пептидов компенсировало изменения экспрессии генов при патологии у животных [Dmitrieva V.G. et al., 2008]. Пептиды вилон (Lys-Glu), тимоген (Glurp), эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) и кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro) изменяли экспрессию от 194 до 266 генов у животных [A Anisimov S.V. et al., 2002; 2004].
При поиске аналогичных структур в базе данных Protein Data Bank был найден комплекс ДНК-пептид под идентификатором 2KV6 [Huang H. et al., 2010]. Пептид со структурой Lysrp-Lys-Lys ковалентно связывался боковой группой лизина с атомом азота N2 гуанина в малой бороздке дуплекса ДНК 5 -d(GCTAGCAGTCC)-3 .5 -d(GGACTCGCTAGC)-3 . Структура была получена методом ядерно-магнитного резонанса. Авторы статьи утверждали, что связывание короткого пептида H-Lysrp-Lys-Lys-OH с ДНК стабилизирует молекулу ДНК, что является защитным механизмом от мутаций в геноме. Эта работа подтверждает предположение, что короткие пептиды могут связываться с ДНК, а образование ковалентной связи между пептидом и аденином ДНК указывает на возможность пептидов эпигенетически регулировать активность генов. При исследовании связывания FITC-меченных гистонов пшеницы с короткими пептидами in vitro было обнаружено, что пептид KEDW связывается с гистонами H1.1, H1.3, и H3 [Федореева Л.И. и соавт. 2013]. Наиболее сильное тушение флуоресценции наблюдалось при взаимодействии пептида KEDW с H3 гистоном. Таким образом, представленные выше литературные данные указывают на две потенциальные мишени эпигенетического действия пептида KEDW в клетке: регуляторный участок ДНК и гистоны.
Приготовление раствора пептидов для введения в культуры клеток поджелудочной железы
Для исследования использовали пептид KEDW и контрольный пептид AEDL в форме лиофилизированного порошка. Для введения в культуры клеток пептиды разводили до следующих концентраций: 0.01, 0.05, 1, 2, 10, 20, 50, 50, 100 нг в 1 мл. Разведение пептидов проводили по следующей схеме: 1. Точную навеску 5 мг пептида растворяли в стерильной колбе с добавлением 100 мл физиологического раствора 0,9% и перемешивали в течение 10 минут. Пептид AEDL растворялся хуже, по-видимому, из-за высокой гидрофобности. 2. 1 мкл полученного раствора переносили в стерильную посуду и разбавляли 82 мл физиологического раствора. Таким образом, концентрация пептида в полученном растворе составляла 600 нг/мл. 3. Для достижения концентрации 20 нг/мл на 3 мл ростовой среды добавляли 100 мкл итогового раствора, содержащего пептид, для концентраций 0.01; 0.05; 1; 2; 10; 20; 50; 100 нг/мл соответственно 0.05; 0.25; 5; 10; 50; 100; 250; 500 мкл исходного раствора, содержащего пептид. 2.1.3. Методика органотипического культивирования клеток
Метод органотипического культивирования позволил исследовать воздействие биологически активных веществ, при котором исключаются эффекты нервной и эндокринной систем, существующие в целостном организме. Кроме того, в органотипической культуре сохранялась иерархическая соподчиненность клеток и свойственные ткани взаимодействия между отдельными клетками (в отличие от диссоциированной культуры клеток, в которой невозможно исследовать все многообразие клеток тканей поджелудочной железы). В экспериментах использовали 900 эксплантатов поджелудочной железы молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) самцов крыс линии Wistar. Ткани, выделенные у животных с помощью инструментов для глазной хирургии, помещали в стерильную чашку Петри с коллагеновым покрытием (размер 3,5х2,5 мм, «Jet Biofil») и разделяли на эксплантаты (фрагменты около 1 мм3) по 10 штук на чашку. Эксплантаты культивировали в 3 мл питательной среды, состоящей из 45% раствора Хенкса, 45% среды Игла, 10% фетальной бычьей сыворотки, глюкозы (10 мг/мл) и гентамицина (0,5 мг/мл). В чашки с контрольными эксплантатами добавляли только 3 мл питательной среды, а в чашки с экспериментальными эксплантатами добавляли 3 мл питательной среды и пептид KEDW в различных концентрациях. В качестве тканей сравнения для оценки тканеспецифического действия пептида использовали культуры ткани кожи и семенников молодых и старых животных. Все эксплантаты культивировали в СО2-инкубаторе при температуре 36,7оС в среде с 5% содержанием СО2. Продолжительность культивирования составила 3 сут, так как известно, что именно такой временной интервал является необходимым для формирования зоны роста, состоящей из пролиферирующих и мигрирующих клеток поджелудочной железы, с примесью фибробластов, и макрофагов. Пролиферацию в культуре поджелудочной железы исследовали методом прижизненной световой микроскопии. Расчет индекса площади
В эксплантатах после 3 суток культивирования можно выделить две отчетливыет зоны: центральная (более плотная) и периферическая (в виде характерного ареола вокруг эксплантата). Центральная зона представлена клетками, исходно размещёнными на коллагеновой подложке. Периферическая зона (зона роста) состоит из выселившихся по окружности вновь образованных клеток. Для количественной оценки роста эксплантатов определи индекс площади (ИП). Его рассчитывали как соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток (A2) к площади центральной зоны эксплантата (A1) по формуле D% = ((A2 - A1)/A1) x 100%. ИП измерялся в условных единицах.
Фотографирование эксплантатов осуществляли с помощью специальной видеокамеры для микроскопа (МТН-13"Альфа-Телеком", серия 10, Россия). Для расчета ИП эксплантатов использовали программу "PhotoM1.2", позволяющую определить общую площадь эксплантата и площадь его центральной зоны. Статистическая обработка данных проводилась с использованием критерия Стъюдента.
Для исследования действия пептидов была выбрана культура эпителиоподобных клеток поджелудочной железы человека пожилого возраста MIA PaCa-2, полученная из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).
Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см2 (“JetBiofil”) в 5 мл ростовой среды при температуре 370C в среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина («Билот»), 15% сыворотки плодов коровы SC-BIOL («Билот») и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Исходная концентрация клеток составила 106 клеток/мл. Процедура пересева клеток
Ростовую среду удаляли из флакона с помощью стерильной пипетки. Далее клетки промывали в 2 сменах раствора DPBS по 5 мл без кальция и магния. Для снятия клеток с подложки флакона использовали раствор трипсина-версена (1:3) по 500 мкл на флакон, и выдерживали его 2 минуты при температуре 37С. Во флакон добавляли 5 мл ростовой среды для блокирования действия трипсина-версена и центрифугировали в течение 5 минут при ускорении 1G. Осадок разводили в ростовой среде и рассеивали на флаконы в нужной концентрации.
При каждом пересеве производили добавлении 5 мл раствора с пептидами в ростовую среду в концентрации 20 нг/мл. Пассирование производили через 2 дня на третий, когда культура достигала состояние монослоя.
Исследование действия пептида KEDW на экспрессию факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении
Проведен анализ экспрессии фактора дифференцировки Pdx1 в культурах клеток поджелудочной железы. Фактор дифференцировки Pdx1 является ключевым фактором дифференцировки всех типов клеток поджелудочной железы, и основным фактором регуляции созревания -клеток, вырабатывающих инсулин. Снижение синтеза Pdx1 приводит к дисфункции -клеток и развитию сахарного диабета. Выявлено, что при старении культуры наблюдалось снижение экспрессии белка Pdx1 в 2,7 раза по сравнению с «молодыми» культурами (рис. 4). Добавление пептида KEDW приводило к статистически достоверному увеличению площади экспрессии белка Pdx1 в «молодых» культурах клеток соответственно в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой (p 0,05).
Однако наиболее выраженный эффект проявлялся в «старых» культурах клеток, где при добавлении пептида площадь экспрессии Pdx1 увеличивалась в 2,6 раза по сравнению с соответствующим контролем. Пептид повышал уровень экспрессии белка Pdx1 в «старых» культурах клеток и доводил его до уровня в «молодых» культурах. При введении контрольного пептида AEDL достоверных изменений в экспрессии белка Pdx1 не наблюдалось (p 0,05).
Таким образом, пептид KEDW обладал стимулирующим действием на экспрессию главного фактора дифференцировки эндокринных и экзокринных клеток поджелудочной железы как в «молодых», так и в «старых» культурах клеток.
Наиболее выраженное снижение экспрессии было отмечено для маркера Ptf1a, который является фактором дифференцировки ацинарных клеток поджелудочной железы. Его снижение в клетке приводит к дисфункции ацинарных клеток, что является одной из причин развития панкреатита. При исследовании экспрессии Ptf1a в культурах клеток поджелудочной железы отмечалось ее снижение при старении культуры. Так, в «молодых» культурах этот показатель составлял 1,48±0,08 %, а в «старых» культурах - 0,32±0,03% (рис. 5). Следовательно, при старении культуры площадь экспрессии Ptf1a уменьшалась в 4,6 раза. Под действием пептида KEDW в «молодых» культурах клеток площадь экспрессии Ptf1a увеличивалась в 1,5. Однако наиболее выраженный эффект наблюдался в «старых» культурах, где под действием пептида площадь экспрессии Ptf1a увеличивалась в 6 раз по сравнению с соответствующим контролем (p 0,05).
Таким образом, добавление пептида KEDW способствовало восстановлению уровня белка Ptf1a в клетоках поджелудочной железы. При введении контрольного пептида AEDL в «молодых» культурах клеток поджелудочной железы экспрессия маркера Ptf1a достоверно не изменялась (рис. 5). Однако в «старых» культурах клеток она увеличивалась в 1,4 раза по сравнению с соответствующим контролем (p 0,05).
Pax6 необходим для дифференцировки -, - и PP-клеток поджелудочной железы и важен для нормальной экспрессии конечных маркеров дифференцировки клеток, таких как инсулин и GLUT-2. В период эмбрионального развития при мутации в гене PAX6 количество всех четырех типов эндокринных клеток поджелудочной железы (-, -, -, PP-клеток) значительно уменьшается, что приводит к развитию аномальной морфологии островков Лангерганса и снижению синтеза гормонов. При анализе площади экспрессии белка Pax6 в исследуемых группах было установлено, что при старении культуры наблюдалось снижение экспрессии маркера Pax6 в 2 раза. При добавлении пептида KEDW в «молодых» и «старых» культурах клеток происходило повышение площади экспрессии маркера соответственно в 1,3 и 2,3 раза. Наиболее значимое увеличение наблюдалось в «старых» культурах клеток, где значение площади экспрессии маркера Pax6 составляло 2,64±0,04% по сравнению с контрольной группой (1,16±0,03%) (рис. 6). Под действием пептида AEDL выявлено увеличение площади экспрессии Pax6 в «старых» культурах клеток: пептид увеличивал экспрессию маркера Pax6 в 1,2 раза по сравнению с контрольной группой. Однако в «молодых» культурах клеток достоверных изменений в экспессии маркера Pax6 при добавлении AEDL не наблюдалось. - p 0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной культуре клеток.
Таким образом, пептид KEDW увеличивал экспрессию фактора дифференцировки -, - и PP-клеток поджелудочной железы Pax6 как в «молодых», так и в «старых» культурах клеток, и наиболее выраженный эффект наблюдался в «старых» культурах, где пептид восстанавливал уровень белка Pax6 до «молодых» культур.
