Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пептидергическая регуляция функций пинеальной железы и тимуса при старении 21
Глава 2. Материал и методы исследования 87
Глава 3. Механизмы клеточного обновления при старении пинеальной железы и тимуса 110
Глава 4. Роль нейропептида CGRP и металлопротеиназ в поддержании гомеостаза пинеальной железы и тимуса при старении 134
Глава 5. Общность лимфоидного компонента пинеальной железы и тимуса при старении 156
Глава 6. Пептидергическая регуляция активации, пролиферации и апоптоза клеток пинеальной железы и тимуса при старении 181
Глава 7. Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул пинеальной железы при старении 210
Глава 8. Модель взаимодействия пептидов с промоторными участками генов сигнальных молекул, пинеальной железы и тимуса . 226
Заключение к главе 8 . 236
Общее заключение 238
Выводы 246
Практические рекомендации 248
Указатель литературы . 249
- Пептидергическая регуляция функций пинеальной железы и тимуса при старении
- Механизмы клеточного обновления при старении пинеальной железы и тимуса
- Роль нейропептида CGRP и металлопротеиназ в поддержании гомеостаза пинеальной железы и тимуса при старении
- Общность лимфоидного компонента пинеальной железы и тимуса при старении
Введение к работе
Актуальность темы
Для сохранения здоровья и продления активного долголетия постоянно увеличивающейся доли лиц старших возрастных групп важным является изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе старения организма.
Участие сигнальных молекул в функционировании регуляторных систем организма привело к созданию новых областей науки – молекулярной медицины и нейроиммуноэндокринологии, которые изучают взаимосвязи между указанными системами в норме и при патологии [Ноздрачев А.Д. и соавт., 2001; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008; Liberman P.M., 1997].
С точки зрения геронтологии важнейшими органами диффузной нейроиммуноэндокринной системы являются пинеальная железа (ПЖ) и тимус [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009]. Возрастное снижение функциональной активности ПЖ, сопровождающееся снижением секреции мелатонина (МТ), лежит в основе таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, сахарный диабет, гипертензия, возрастные иммунодефициты, ишемическая болезнь сердца [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Тимус подвергается инволюции, начиная с 30 лет, а к 60 годам его функциональная активность снижается, что приводит к увеличению заболеваемости раком, вирусными, бактериальными инфекциями и аутоиммунным заболеваниям [Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996; ., ., 2012].
Ключевым звеном молекулярно-клеточной регуляции гомеостаза в ПЖ и тимусе является секреция ряда общих медиаторов, осуществляющих передачу информации между различными клетками. К ним относятся вещества природного происхождения (МТ, серотонин, транскрипционный фактор pCREB) и синтетические короткие пептиды.
Нейромедиаторы ПЖ МТ и серотонин были верифицированы в ткани тимуса, а регуляторный белок тимуса pCREB был обнаружен в пинеалоцитах. Установлено, что 10% площади ПЖ занимает лимфоидная ткань, секретирующая цитокины, идентичные тем, которые экспрессируются в тимусе [ ., ., 2006]. Кроме того, снижение синтеза пинеального МТ при старении приводит к нарушению пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов тимуса, что свидетельствует о тесном молекулярном взаимодействии между указанными органами [Reiter R.J. et al., 2010].
Результаты многолетних исследований показывают, что снижение функциональной активности центральных органов нейроиммуноэндокринной системы связано с нарушением молекулярно-клеточных механизмов пептидной регуляции [Ашмарин И.П., Королева С.В., 2003; Арутюнян А.В. и соавт., 2009], что открывает возможности поиска новых фармакологических средств, например пептидной природы. В России изучение биологической активности коротких пептидов активно развивается с 70-х годов XX века [Тутельян В.А. и соавт., 2003; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010; Seredinin S.B. et al., 1997; Ivanov V.T. et al., 2005; Deigin V.I. et al., 2007; Myasoedov N.F. et al., 2011].
Установлено, что применение коротких пептидов, которые обладают высокой биологической активностью, ткане- и геноспецифичностью и не имеют видоспецифичности и иммуногенности, способствует коррекции возрастного снижения функций пинеальной и вилочковой желез [Khavinson V.Kh., Malinin V.V., 2005; Khavinson V.Kh. et al., 2011].
Ключевую роль в сохранении функций ПЖ и тимуса при старении может играть синтетический пептид AEDG, стимулирующий иммунную и эндокринную функцию тимуса [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Пептид AEDG активирует выработку МТ пинеальной железой, который связывается с мелатониновыми рецепторами клеток тимуса. Например, таким путем может регулироваться циркадианное повышение выработки тимического сывороточного фактора, способствующего поздней активации тимоцитов [Райхлин Н.Т. и др., 2004]. Пептид KE стимулирует иммуногенез в тимусе, активируя пролиферацию тимоцитов, и обладает антиканцерогенным действием [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Пептид EDR является индуктором пролиферации иммунных клеток в органотипических культурах тканей [Chalisova N.I. et al., 2008].
Таким образом, исследование пептидергической регуляции молекулярно-клеточных аспектов старения ПЖ и тимуса является актуальной задачей фундаментальной геронтологии и молекулярной медицины. Кроме того, для практической геронтологии представляется важной разработка новых подходов к восстановлению экспрессии сигнальных молекул в ПЖ и тимусе при старении с применением синтетических пептидов.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования явилось изучение влияния коротких пептидов на экспрессию сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при их старении.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
-
Выявить экспрессию общих сигнальных молекул, участвующих в процессах иммуногенеза, пролиферации, дифференцировки, межклеточных взаимодействий в пинеальной железе и тимусе человека при старении.
-
Оценить влияние пептидов KE, AEDG, KED и EDR на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.
-
Изучить действие пептидов KE, AEDG, KED и EDR на апоптоз в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.
-
Выявить роль пептидов KE, AEDG, KED и EDR в регуляции процессов клеточного обновления и межклеточных взаимодействий в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.
-
Оценить влияние пептидов KE и AEDG на экспрессию фермента AANAT и транскрипционного фактора pCREB, участвующих в синтезе мелатонина, в диссоциированной культуре пинеалоцитов.
-
Создать трехмерную модель взаимодействия пептидов KE и AEDG с промоторными участками генов изученных сигнальных молекул.
-
Оценить роль коротких пептидов в регуляции экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении.
Научная новизна
Впервые выявлены общие сигнальных молекулы (Ki67, Р53, AIF, CGRP, MMP2, MMP9, СD4, CD5, CD8, CD20), участвующие в процессах клеточного обновления, межклеточных взаимодействиях, иммунологических реакциях в пинеальной железе и тимусе людей старше 60 лет, что позволяет расширить представления об экспрессии сигнальных молекул в указанных органах и их вкладе в механизмы старения.
На клеточном уровне установлено, что лимфоидный компонент пинеальной железы человека представлен 3 субпопуляциями иммунных клеток: Т-хелперами, цитотоксическими Т-лимфоцитами и В-клетками. Впервые проведен сравнительный анализ возрастной динамики количества различных субпопуляций лимфоцитов в пинеальной железе и тимусе при старении. Установлено, что при старении в пинеальной железе количество Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, В-лимфоцитов и CD5+ клеток снижается незначительно, тогда как в тимусе у лиц старше 60 лет численность Т-клеток и CD5+ лимфоцитов резко снижается. Кроме того, впервые установлено, что в пинеальной железе маркер CD5+ преимущественно представлен на В-клетках, что указывает на их активацию и реализацию иммуносупрессорных свойств. При этом для тимуса характерно наличие CD5+ Т-клеток. Полученные данные позволили выдвинуть и обосновать гипотезу о том, что пинеальная железа, являясь органом нейроиммуноэндокринной системы, при старении организма может играть важную роль в поддержании пула иммунных клеток.
В настоящей работе впервые исследована возрастная динамика молекулярных механизмов клеточного обновления в ткани пинеальной железы и тимуса человека. Установлено, что в пинеальной железе пролиферативная активность клеток, оцениваемая по экспрессии маркера Ki67, сохраняется на стабильном уровне у пожилых людей и лиц старческого возраста и несколько снижается у долгожителей. В тимусе экспрессия Ki67 у лиц старческого возраста снижается в 8 раз по сравнению с пожилыми людьми. Апоптоз в пинеальной железе и тимусе реализуется по
двум механизмам: каспаза-зависимому, с участием белка P53, и митохондриально-опосредованному, ассоциированному с протеином AIF. С возрастом митохондриально-опосредованный апоптоз в тимусе возрастает, тогда как в пинеальной железе этот процесс при старении не изменяется.
Впервые установлено, что в пинеальной и вилочковой железах ремоделирование межклеточного матрикса, необходимое для реализации межклеточных взаимодействий, осуществляется с участием металлопротеиназ ММР2 и ММР9. С возрастом экспрессия обоих изученных металлопротеиназ в пинеальной железе и в тимусе уменьшается. Кроме того, экспрессия нейропептида CGRP в пинеальной железе не зависит от возраста и существенно снижается при старении тимуса. Таким образом, впервые выявлены 10 ключевых сигнальных молекул (CD4, CD5, CD8, CD20, AIF, P53, Ki67, CGRP, MMP2, MMP9), отражающих общность молекулярных механизмов возрастной инволюции пинеальной железы и тимуса. Установлено, что в пинеальной железе возрастное снижение данных молекулярных маркеров выражено менее сильно по сравнению с тимусом.
Впервые в органотипической культуре клеток пинеальной железы крыс разного возраста выявлена способность синтетических пептидов AEDG, KE, EDR восстанавливать экспрессию сигнальных молекул AIF, Р53, Ki67, CGRP, MMP9. Установлено, что наибольшим стимулирующих эффектом из всех изученных пептидов обладает AEDG. Впервые показано, что пептид AEDG снижает уровень каспаза-зависимого апоптоза в культурах клеток пинеальной железе и тимуса, полученных от старых животных, что может указывать на общие регуляторные механизмы клеточной гибели в исследуемых органах при старении. Установлено, что наибольшим стимулирующим эффектом на лимфоидную ткань пинеальной железы и тимуса обладает пептид KE, однако в зависимости от органа и возраста животных имеются некоторые особенности его эффектов. Так, в культурах клеток пинеальной железы, полученных от молодых крыс, пептид KE усиливает процессы дифференцировки иммунных клеток, тогда как в культурах клеток, полученных от старых животных, этот пептид стимулирует активацию и пролиферацию различных субпопуляций иммунных клеток. Впервые установлено, что пептиды AEDG и KE обладают выраженной активностью в отношении экспрессии молекул AANAT и pCREB, участвующих в синтезе мелатонина пинеалоцитами.
Впервые выявлено, что пептиды KE, EDR и AEDG обладают активностью в отношении пролиферации и дифференцировки лимфоцитов тимуса старых животных. Установлено, что пептид KE стимулирует пролиферацию активированных Т-лимфоцитов. Пептиды EDR и AEDG, обладая тем же эффектом, что и KE, стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов. Методом молекулярного моделирования доказано, что в основе пептидергической регуляции нейроиммуноэндокрнных функций пинеальной железы и тимуса может лежать сайт-специфическое взаимодействие пептидов AEDG и KE с промоторными зонами генов, кодирующих изученные белки.
Практическая значимость
Полученные результаты позволили выявить 3 субпопуляции иммунных клеток в ПЖ, что подтверждает о тесную взаимосвязь эпифиза с тимусом в рамках единой нейроиммуноэндокринной системы.
В работе установлены общие возрастные аспекты снижения экспрессии ряда сигнальных молекул – маркеров клеточного обновления, ремоделирования межклеточного матрикса и нейроиммуноэндокринных взаимодействий в ПЖ и тимусе. Это является важным вкладом в понимание фундаментальных аспектов старения нейроиммуноэндокринной системы и свидетельствует о физиологической взаимосвязи между вилочковой и пинеальной железой, нарушение которой может быть одной из причин ускоренного старения.
Применение в работе сочетания методов органотипического и диссоциированного культивирования клеток и иммуноцитохимии оказалось эффективным для оценки биологической активности коротких пептидов
(AEDG, KE, EDR, KED) и поиска молекулярных мишеней их действия в ПЖ и тимусе.
На основании анализа влияния коротких пептидов на синтез белков – маркеров функциональной активности клеток ПЖ и тимуса были найдены соответствующие им промоторные зоны генов. Методом молекулярного моделирования были установлены вероятные специфические сайты связывания для пептидов AEDG и KE в промоторных зонах генов изученных белков ПЖ и тимуса. Полученные данные позволяют выявить предполагаемые генные мишени действия пептидов AEDG и KE, что является новым перспективным подходом к созданию геропротекторных и других биологически активных веществ, направленных на регуляцию экспрессии генов.
Положения, выносимые на защиту
-
В основе нейроиммуноэндокринного механизма старения пинеальной железы и тимуса лежит снижение экспрессии сигнальных молекул, участвующих в клеточном обновлении (Ki67, Р53, AIF), иммунном ответе (СD4, CD5, CD8, CD20), пептидной нейрорегуляции (CGRP) и изменение количества матриксных металлопротеиназ (ММР2, ММР9).
-
В пинеальной железе человека верифицированы иммунные клетки (Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты, В-клетки), характерные для ткани тимуса, а в тимусе - нейропептид CGRP, экспрессируемый пинеалоцитами, что является доказательством общности этих органов в рамках диффузной нейроиммуноэндокринной системы.
-
Пептид KE стимулирует пролиферацию и активацию лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы, полученных от молодых и старых животных. В тимусе пептиды KE, EDR, AEDG также оказывают стимулирующий эффект на лимфоидный компонент, однако он менее выражен по сравнению с пинеальной железой.
-
Пептид AEDG снижет уровень апоптоза в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от старых животных.
-
Пептид AEDG активирует процессы клеточного обновления, межклеточные взаимодействия и снижает экспрессию проапоптотического белка Р53 в пинеальной железе при старении. Сходным эффектом на пролиферацию и ремоделирование межклеточного матрикса в ткани пинеальной железы обладает пептид EDR.
-
Пептидергическая регуляция синтеза мелатонина в пинеалоцитах осуществляется через стимуляцию экспрессии лимитирующих факторов данного процесса – фермента AANAT и транскрипционного фактора pCREB под действием пептидов AEDG и KE.
-
Методом молекулярного моделирования установлено, что пептиды AEDG и KE способны связываться с ДНК. Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе может осуществляться за счет связывания пептидов AEDG и KE с азотистыми основаниями регуляторных участков генов, кодирующих изученные сигнальные молекулы.
-
В поддержании функциональной активности пинеальной железы и тимуса участвует совокупность сигнальных мессенджеров, экспрессия которых с возрастом снижается. Пептиды AEDG и KE геноспецифически восстанавливают синтез указанных сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе. При этом пептид AEDG оказывает наибольший эффект на процессы клеточного обновления и межклеточные взаимодействия, а пептид KE стимулирует пролиферацию и дифференцировку лимфоидного компонента обоих органов.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.
Структура и объем диссертации
Пептидергическая регуляция функций пинеальной железы и тимуса при старении
Пинеальная железа (эпифиз, шишковидная железа) является одним из высших центров эндокринной системы организма наряду с гипофизом и гипоталамусом [Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2007; Montie E.W. et al., 2009]. В соответствии с классификацией эндокринных желез, в зависимости от их происхождения из различных зародышевых листков, ПЖ относится к неврогенной группе – эктодермальным железам, происходящим из промежуточного мозга. Гистологические строение ПЖ отражает его функциональное назначение как железы внутренней секреции [Lopez-Munoz F. et al., 2010a; Nolte I. et al., 2010], однако структура ПЖ имеет и ряд специфических особенностей. Основными элементами ПЖ являются: - соединительнотканный каркас, - секреторные клетки ПЖ – пинеалоциты, - опорные глиальные клетки, - нервные клетки, - разветвленная капиллярная сеть. Капсула железы образована соединительной тканью мягкой мозговой оболочки, от которой отходят перегородки, содержащие кровеносные сосуды и сплетения симпатических безмиелиновых волокон. Паренхима ПЖ состоит из плотно прилегающих одна к другой клеток – пинеалоцитов. Пинеалоциты представляют собой клетки с крупными ядрами и ядрышками, связанные друг с другом отростками с помощью десмосом и щелевых контактов. Иногда отростки пинеалоцитов заканчиваются слепо, располагаясь между другими клетками. Гистологически выделяют 3 типа пинеалоцитов: 1 тип – светлые клетки, содержащие серотонин, 2 тип - темные клетки, содержащих мелатонин (МТ), 3 тип – малодифференцированные переходные пинеалоциты. Пинеалоциты 1 типа имеют округлую или неправильную форму, крупное ядро, отличающееся светлой кариоплазмой и неправильной формой за счет многочисленных инвагинаций ядерной мембраны и содержащее диффузный хроматин [Князькин И.В., 2008]. Клетки 2 типа имеют удлиненную форму, цитоплазматические отростки, которые не формируют сплошного поля и проникают между пинеалоцитами 1 типа. Темные клетки чаще всего располагаются между паренхимой и стромой железы, обрамляя капилляры своими отростками. Ядра клеток 2 типа электронноплотные, содержат гетерохроматин, располагающийся у ядерной мембраны. Цитоплазматический матрикс темных пинеалоцитов содержит большое количество секреторных гранул с МТ. В цитоплазме хорошо выражен шероховатый эндоплазматический ретикулум (ЭПР), наблюдается большое количество митохондрий с плотным матриксом и поперечно расположенными кристами [Князькин И.В., 2008].
Пинеалоциты 2 типа по строению сходны с нервными клетками, чему найдено немало подтверждений [Хавинсон В.Х. и др., 2001]. Клетки 2 типа содержат плотные пузырьки диаметром 300–500 ангстрем, образующие скопления в отростках. Было показано, что в нервных терминалях, расположенных в ткани ПЖ, обнаруживаются плотные пузырьки того же диаметра, являющиеся местом депонирования норадреналина (НА). Проведенные цитоавторадиографические исследования с применением электронного микроскопа показали, что эти органеллы могут депонировать индоламины, а в структуре отростков пинеалоцитов и нервных окончаний настолько отсутствуют различия, что обнаруживаемые пузырьки могут с одинаковым успехом принадлежать как тем, так и другим клеткам. В некоторых случаях скопление подобных пузырьков обнаруживалось в местах соприкосновения пинеалоцитов, что позволяет предположить, что данные места являются сомато-соматическими синапсами [Коркушко О.В. и др., 2006]. Таким образом, пинеалоциты обладают как свойствами эндокринной клетки, так и нейрона, то есть являются типичными нейроэндокринными клетками.
Глиальные (опорные) клетки присутствуют в ПЖ в значительно меньшем количестве по сравнению с пинеалоцитами. Опорные клетки имеют высокую электронную плотность цитоплазмы, неправильную форму ядра с краевой конденсацией хроматина. Они составляют 5% от всех клеток паренхимы и расположены между скоплениями пинеалоцитов, лежащих по всей длине дольки, иногда формируя группы по 3-4 клетки. Глиальные клетки содержат цитоплазматические отростки, соприкасающиеся с мембраной близлежащих пинеалоцитов. Опорные клетки имеют развитый пластинчатый комплекс, значительное количество митохондрий с просветленным матриксом в центральной части. Цитоплазма глиальтных клеток содержит лизосомы и липидные капли [Хавинсон В.Х. и др., 2001].
В ПЖ имеются нервные клетки, которые являются составляющей частью безмякотных нервных волокон [Хавинсон В.Х. и др., 2001; Гончарова Н.Д. и др., 2007]. Большая их часть располагается в переваскулярных пространствах, окружающих тонкостенные сосуды, кроме +-того, нервные клетки были обнаружены в паренхиме ПЖ.
Сведения о строении капилляров ПЖ противоречивы. Основываясь на данных о том, что в эндотелии капилляров крыс найдены поры диаметром 250 – 400 ангстрем, некоторые авторы указывают, что капилляры ПЖ соответствуют фенестрированному типу. Капилляры с такой ультраструктурой обнаружены в гипофизе, щитовидной, поджелудочной и паращитовидных железах, то есть в органах внутренней секреции [Хавинсон В.Х. и др., 2001]. Другой источник подчеркивает, что капилляры ПЖ человека не имеют фенестр [Boya J. et al., 1984]. В то же время базальная мембрана их эндотелия расщепляется на 2 листка, наружный и внутренний, с образованием перекапиллярного пространства, куда попадают ПЖрные гормоны, высвобождающиеся из отростков пинеалоцитов 2 типа. Подобное строение имеет гипоталамо-аденогипофизарная система.
Механизмы клеточного обновления при старении пинеальной железы и тимуса
Для изучения гистологического строения парафиновые срезы ПЖ и тимуса окрашивали гематоксилин-эозином. В ПЖ людей пожилого возраста были хорошо видны расположенные разрозненно темные и светлые пинеалоциты (рис. 6). В пространствах между клетками наблюдалось достаточно большое количество фиброидного компонента, который делал невозможным разделение ПЖ на дольки.
Картина гистологического строения ткани ПЖ в старческом возрасте и у долгожителей практически не различалась. В старческом возрасте, по сравнению с пожилыми людьми, количество фиброидного компонента увеличивалось, захватывая болшую часть ПЖ (рис. 7). При этом число пинеалоцитов в поле зрения снижалось, в основном за счет практически полного исчезновения темных клеток. Большая часть ткани ПЖ у лиц старческого возраста и долгожителей представляла собой соединительнотканные прослойки, в структуре которых были отмечены единичные, преимущественно светлые, пинеалоциты. Гистологическое исследование строения ПЖ у людей старше 60 лет подтверждает имеющиеся в литературе данные о том, что с возрастом клеточность в ткани ПЖ снижается, а площадь фиброидного компонента возрастает. Инволютивные изменения ПЖ значительно возрастают при переходе от пожилого возраста к старческому, тогда как у стариков и долгожителей структура ПЖ практически не изменяется.
Тимусы людей пожилого, старческого возраста и долгожителей имели практически одинаковое строение, свидетельствующие о выраженной инволютивной дистрофии данного органа у людей старше 60 лет. В тимусах людей пожилого, старческого возраста и долгожителей большая часть долек замещена жировой и соединительной тканями. Так, в пожилом возрасте тимус состоял из многочисленных жировых и соединительнотканных прослоек, среди которых встречались лишь небольшие фрагменты железистой ткани (рис. 8). В сочетании со склеротическими изменениями сосудов вилочковой железы это приводило к невозможности разделения ткани тимуса на корковый и мозговой слои (рис. 9). Таким образом, гистологическое исследование позволило установить, что признаки возрастной инволюции ПЖ нарастают при переходе от пожилого возраста к старческому, тогда как инволютивные изменения тимуса ярко выражены уже в пожилом возрасте. При этом количество соединительной ткани в ПЖ даже в старческом возрасте и у долгожителей занимает значительно меньшую площадь ткани ПЖ, тогда как большая часть тимуса пожилых людей представлена жировым и фиброидным компонентом. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что структура ПЖ менее подвержена возрастным изменениям по сравнению с тимусом.
Апоптоз (программированная клеточная гибель) является генетически детерминированным механизмом, направленым на удаление клеток с нарушенным клеточным циклом или переставших выполнять специализированную функцию вследствие их повреждения или старения. Апоптоз играет важную роль в процессе развития и старения организма. Программируемая клеточная гибель - существенный фактор иммунитета, поскольку апоптоз зараженной клетки может предотвратить распространение инфекции в организме. Причиной развития ассоциированных с возрастом заболеваний, в том числе иммунодефицитов и нейродегенеративной патлогии, может быть как угнетение механизмов апоптоза, так и их индукция [Vasto S. et al., 2007] Существует 2 механизма запуска апоптоза, частично дублирующих друг друга. Первый опосредован активацией каскада внутриклеточных протеаз (каспаз), второй происходит при активном участии митохондрий, высвобождающих в цитоплазму вещества-эффекторы апоптоза. Ключевыми факторами, вводящим клетку в апоптоз, являются белки Р53 (каспаза-зависимый путь) и AIF (митохондриально-опосредованный путь).
Белок Р53 является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза [Пинтус С.С., 2009] во всех тканях организма. Белок Р53 активируется при повреждениях ДНК, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям, или являются сигналом о старении клетки и нарушении ее функциональной активности. Функция Р53 состоит в удалении из пула реплицирующихся клеток тех клеток, которые являются потенциально онкогенными.
В быстро делящихся клетках было обнаружено увеличение концентрации белка Р53 по сравнению с медленно прлиферирующими клетками. Значение увеличения концентрации Р53 в данном случае свидетельствует о том, что клетки, которые быстро реплицируют ДНК, более подвержены возникновению повреждений генетического аппарата, чем, неделящиеся клетки в фазе G0. Активированный белок Р53 является специфическим транскрипционным фактором. Гены, транскрипцию которых стимулирует белок Р53, кодируют белки-компоненты апоптотической программы (каспазы) и белки, которые регулируют клеточный цикл.
Белок AIF (apoptotic inducing factor) является митохондриальным мембранным флавопротеином, участвующим в индукции апоптоза и поддержании функциональной активности митохондриального комплекса NADH-убихинон-редуктазы, ассоциированного с цепью переноса электронов [Klein J.A. et al., 2002]. Изменение структуры белка AIF приводит к повреждению клетки активными формами кислорода, что может явиться причиной развития раковых и нейродегенеративных заболеваний [Perier C. et al., 2010]. AIF, в отличае от Р53, является тканеспецифическим белком, верифицрованным в нервной и некоторых других тканях.
AIF, высвобождаясь из митохондрии при ее повреждении, перемещается в ядро и, в результате серии биохимических реакций, инициирует фрагментацию ДНК, что приводит к программированной гибели клетки. Снижение экспрессии AIF при старении можеть приводить к прогрессивной дегенерации нервной ткани в различных областях мозга – мозжечке, коре, стриатуме, таламусе и сетчатке [El G.V. et al., 2007]. Установлено, что недостаток белка AIF является причиной развития болезни Паркинсона и Альцгеймера [Yu W. et al., 2010].
Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить, что исследование экспрессии белков Р53 и AIF в ПЖ и тимусе позволит провести сравнительный анализ интенсивности каспаз-зависимого и митохондриально-опосредованного апоптоза в указанных тканях при их старении.
Роль нейропептида CGRP и металлопротеиназ в поддержании гомеостаза пинеальной железы и тимуса при старении
Пептид CGRP (calcitonin gene related peptide) играет роль нейромедиатора, иммуномодулятора и кардиопротектора. Существует несколько возможных сигнальных механизмов, посредством которых CGRP воздействует на другие клетки в различных тканях. Одним из наиболее изученных механизмов является путь с участием цАМФ. Ген, кодирующий CGRP, содержит энхансер с типичным цАМФ чувствительным элементом CRE, что делает его мишенью для pCPEB. Эффекты CGRP заключаются преимущественно в вазодилятации и регуляции воспалительных процессов. Так, CGRP, выделяемый эпикардиальными нервными волокнами, является вазодилататором и выполняет кардиопротекторную функцию [Shankar D.B et al., 2005].
Пептид CGRP может выполнять функцию геропротектора, препятствуя старению клеток-предшественников эндотелиоцитов у больных гипертензией, а ускоренное старение эндотелия у больных гипертензией могло быть ассоциировано с сокращением экспрессии CGRP. Таким образом, CGRP может влиять на развитие сердечно-сосудистой патологии.
CGRP принимает участие в регуляции иммунологических реакций, как в норме, так и при различных патологических процессах. CGRP стимулирует предъявление клетками Лангерганса антигенов для клеточного ответа T-хелперов второго типа (Th2). Таким образом, контакт клеток Лангерганса с молекулой CGRP in situ может способствовать формированию Th2-клеточного иммунитета [Qi L. et al, 2009]. Изменение экспрессии CGRP при старении организма, и, в частности, инволюции ПЖ и тимуса, может являться предпосылкой к нарушению пептидной регуляции гомеостаза и служить причиной возрастной патологии.
Возрастная динамика синтеза пептида CGRP в пинеальной железе Площадь экспрессии пептида CGRP в клетках ПЖ у пожилых людей и в старческом возрасте достоверно не различалась и составила соотвественно 4,49±1,23 и 5,98±0,51%. У долгожителей данный показатель был в 2,5 раза ниже, чем у лиц старческого возраста и составил 3,67±0,35% (рис. 30, 31). Оптическая плотность экспрессии нейропептида CGRP в ПЖ достоверно не различалась в пожилом, старческом возрасте и у долгожителей и составила соответственно 0,45±0,03, 0,51±0,07 и 0,51±0,02 у.е. Рис. 30. Экспрессия нейропептида CGRP (коричневые фрагменты) в пинеальной железе, 84 г, иммуногистохимия, х 200.
Корреляционнывй анализ позволил установить, что зависимость между площадью экспрессии CGRP в ПЖ и возрастом носит линейный характер и выражается уравнением y = 0,02х+3, где х – возраст, лет, у – площадь экспрессии CGRP, % (рис. 32). Коэффициент корреляции Спирмана между указанными величинами составил 0,2, а коэффициент детерминации 0,04, что свидетельствует о точ, что секреторная активность клеток ПЖ в отношении нейропептида CGRP не зависит от возраста. Возрастная динамика синтеза пептида CGRP в тимусе Изучение площади экспрессии пептида CGRP в клетках тимуса позволило установить, что в старческом возрасте этот показатель в 3 раза ниже по сравнению с пожилыми людьми, однако у долгожителей и пожилых людей иммунопозитивное окрашивание на CGRP достоверно не изменяется (рис. 33-35). Оптическая плотность экспрессии нейропептида CGRP в тимусе достоверно неи различалась во всех 3 исследуемых группах и составила соответственно 0,47±0,03, 0,46±0,06 и 0,33±0,11 у.е. Поскольку нами было зарегестрировано достоверное снижение экспрессии пептида CGRP в тимусе у лиц старческого возраста, представляло интерес изучение возрастных корреляций данного показателя. Корреляционнывй анализ позволил установить, что зависимость между площадью экспрессии CGRP в тимусе и возрастом людей носит квадратичный характер и выражается уравнением y = -0,06х+6, где х – возраст, лет, у – площадь экспрессии CGRP, % (рис. 36). Коэффициент корреляции Спирмана между указанными величинами составил -0,75, а коэффициент детерминации 0,61, что свидетельствует о том, что возраст является одним из ведущих факторов, влияющих на снижение секреторной активности клеток тимуса в отношении нейропептида CGRP.
Матриксные металлопротеиназы (MMP) представляют собой семейство внеклеточных, цинк содержащих протеиназ, включающее в себя около 30 белков. Свое название MMP получили благодаря способности селективно гидролизовать основные белки матрикса.
MMP синтезируются в виде неактивных проферментов и активируются после отщепления пропептида. Активность MMP в клетке регулируется на разных уровнях, включая транскрипцию, активацию белка и взаимодействие с эндогенными тканевыми ингибиторами TIMP [Stetler-Stevenson W.G. et al., 1992]. MMP синтезируются в различных тканях и играют центральную роль в обмене белков соединительной ткани, в процессах нормального развития матрикса, ангиогенезе, миграции лейкоцитов, адгезии, дифференцировке, пролиферации и онкогенной трансформации клеток. Нарушение синтеза ММР может стать причиной таких заболеваний как ревматоидный артрит, гломерулонефрит, пародонтит, изъязвление роговицы глаз и некоторых других патологических процессов [Lausch E. et al., 2009; Garavello W. et al., 2010].
Семейство белков ММP обладает некоторыми общими характерными чертами. В то же время на основании данных о структурной организации и субстратной специфичности среди ММP выделены 4 подсемейства: коллагеназы, желатиназы, стромелизины и другие ММР, не вошедшие в 3 указанные группы. Желатиназы интенсивно гидролизуют желатины, получаемые из различных типов коллагенов, чем и объясняется их название. Первоначальное название этих ферментов - коллагеназы IV типа - считается неудачным, так как кроме коллагена IV типа желатиназы могут гидролизовать коллагены других типов, а также ряд белков соединительно-тканного матрикса, в том числе и эластин. Среди желатиназ важную роль в межклеточных процессах играют ММР2 и ММР9. ММР2 человека представляет собой профермент с молекулярной массой 72 кДа, основными функциями активной формы которого являются ремоделирование сосудов и репарация ткани. Наряду с другим белком внеклеточного матрикса, ММР2 стимулирует васкуляризацию [Fernandez-Patron C. et al., 2000]. При патологических процессах ММР2 может индуцировать канцерогенез и появление атеросклеротических бляшек, то есть патологии, характерные для лиц старческого возраста. Одна субъединица ММР2 способна связывать 4 Ca2+ и 2 Zn2+. На С-конце профермента ММР2 находится PEX-домен, гидролиз которого приводит к переходу ММР2 в активную форму. Активированная ММР2 участвует в гидролизе фибронектина и тенасцина-С, а так же коллагена IV типа. Известно, что ММР2 синтезируется фибробластами и лейкоцитами.
Общность лимфоидного компонента пинеальной железы и тимуса при старении
Нейроиммуноэндокринная система объединяет различные ткани и органы в соответствии с функциональным сходством их клеток и сигнальных молекул. Поскольку данные нашего исследования позволили обнаружить структурное сходство и группу общих сигнальных молекул, экспрессирующихся в ткани ПЖ и тимуса, можно предположить, что указанные органы являются взаимосвязанными звеньями иммунной и нейроэндокринной системы. Известно, что инволюции больше всего подвержен тимус, функции которого у людей старше 60 лет делегируются периферическому звену иммунной системы. Кроме того, известно, что 10% ткани ПЖ занимает лимфоидная ткань, что позволяет рассматривать ПЖ в качестве возможного компонента диффузной иммунной системы, значение которого при старении возрастает [Полякова В.О., Кветной И.М., 2009; Mosenson J., McNulty J., 2006].
В связи с этим целью данного этапа исследований явилось установление признаков иммунного единства ПЖ и тимуса при их возрастной инволюции. Для того, чтобы подробно охарактеризовать лимфоидный компонент ПЖ и тимуса и способность иммунных клеток к дифференцировке, нами были выбраны следующие маркеры: CD4 – Т-хелперы, CD5 – активированные лимфоциты, CD8 – цитотоксические Т-лимфоциты, CD20 – В-лимфоциты.
Площадь экспрессии СD20+ В-лимфоцитов ПЖ в старческом возрасте (0,73±0,21%) снижалась в 3 раза относительно пожилых людей (1,52±0,19%), однако в старческом возрасте и у долгожителей (1,01±0,29%) этот показатель не изменялся (рис. 51, 52). Оптическая плотность экспрессии маркера CD20 достоверно не различалась во всех 3 исследуемых возрастных группах и составила соответственно 0,40±0,10, 0,34±0,10 и 0,43±0,09 у.е. Рис. 51. Экспрессия маркера В-лимфоцитов CD20 (коричневые фрагменты) в пинеальной железе, 63 г, иммуногистохимия, х 200.
Коэффициент корреляции Cпирмана между площадью экспрессии маркера В-клеток в ткани ПЖ и возрастом составил -0,59, что свидетельствует об умеренной отрицательной связи между исследуемыми величинами. Возрастное снижение экспрессии маркера СD20 в ПЖ описывается линейным уравнением у = -0,03х+3,6, где х – возраст, лет, у – площадь экспрессии CD20, % (рис. 53). Коэффициент детерминации для полученной зависимости составил 0,39, что указывает на тот факт, что только в 39% случаев возраст является фактором, способствующим снижению количества В-лимфоцитов в ПЖ. Полученные данные свидетельствуют, что при переходе от пожилого к старческому возрасту количество В-лимфоцитов в ПЖ снижается, однако у долгожителей число СD20+ клеток сохраняется на уровне пожилых людей, что указывает на важную роль ПЖ как пула В-лимфоцитов, число которых в органах иммунной системы при старении резко снижается.
Площадь экспрессии маркера СD20 в тимусе достоверно не различалась у людей пожилого, старческого возраста и долгожителей и составила соответственно 0,69±0,15, 0,56±0,14 и 0,65±0,13%. Оптическая плотность экспрессии маркера CD20 так же не изменялась с возрастом и у людей пожилого, старческого возраста и долгожителей составила соответственно 0,40±0,07, 0,33±0,09, 0,36±0,09 у.е.
Полученные данные свидетельствуют, что количенство В-лимфоцитов в тимусе с возрастом не изменяется. Обращает на себя внимание тот факт, что площадь экспрессии маркера CD20 в ткани вилочковой железы во всех исследуемых группах находилась на досаточно низком урове, что свидетельствует о незначительной роли данной субпопуляции иммунных клеток в тимическом иммуногенезе.
Основной функцией Т-лимфоцитов является распознавание пептидных фрагментов чужеродных белков, всторенных в аутологичные молекулы гистосовместимости [Saito S. et al., 1999]. В процессе распознавания Т-лимфоциты активизируются и дифференцируются в эффекторные (цитотоксические Т-клетки, другие названия - Т-киллеры и эффекторы гиперчувствительности замедленного типа) и регуляторные (Т-хелперы Th1, Th2 и Т-супрессоры) клетки. Молекулы CD4 и CD8 усиливают связь рецептора с антигеном при действии последнего. При этом СD4 имеет сродство к молекулам HLA II, а CD8 обладает сродством к HLA I. В зрелых Т-лимфоцитах с рецептором может связываться только одна из этих молекул, присутствуюящая на мембране клетки. По указанному признаку различают Т-хелперы, на поверхности которых находится CD4 и цитотоксические Т-клетки, на мембране которых обнаружен антиген к CD8.
В ПЖ площадь экспрессии CD4+ клеток (Т-хелперов) у пожилых людей и в старческом возрасте достоверно не различалась и составила соотвественно 0,31±0,07 и 0,34±0,08%. У долгожителей указанный параметр возрастал в 2,2 раза и составил 0,71±0,14%. Оптическая плотность экспрессии маркера CD4 так же не изменялась с возрастом и у лиц пожилого, старческого возраста и долгожителей составила соответственно 0,44±0,06, 0,50±0,08, 0,49±0,08 у.е. Коэффициент корреляции Пирсона между площадью экспрессии маркера Т-хелперов в ткани ПЖ и возрастом составил 0,63, что свидетельствует о сильной положительной связи между исследуемыми величинами. Рис. 54. Линейная зависимость между площадью экспрессии CD4 в пинеальной железе и возрастом: точки – экспериментальные данные, сплошная линия – аппроксимирующая прямая. Усиление экспрессии маркера СD4 в ПЖ у долгожителей по сравнению с пожилыми людьми и лицами старческого возраста описывается линейным уравнением у = 0,01х-0,2, где х – возраст, лет, у – площадь экспрессии CD4, % (рис. 54). Площадь экспрессии цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ клеток) в ПЖ в пожилом, старческом возрасте и у долгожителей достоверно не отличалась и составила соотвественно 1,49±0,43, 1,70±0,40 и 2,71±0,62%, однако с возрастом прослеживалась тенденция к увеличению их числа. Оптическая плотность экспрессии маркера CD8 в ПЖ не изменялась с возрастом и в 1, 2 и 3 группе составила соответственно 0,58±0,08, 0,57±0,05, 0,58±0,08 у.е.
Коэффициент корреляции Спирмана между площадью экспрессии маркера цитотоксических Т-лимфоцитов в ткани ПЖ и возрастом составил 0,73, что свидетельствует о сильной положительной связи между исследуемыми величинами.
Повышение экспрессии маркера СD8 в ПЖ у долгожителей по сравнению с пожилыми людьми и лицами старческого возраста описывается квадратичным уравнением у = 0,06х-2,2, где х – возраст, лет, у – площадь экспрессии CD8, % (рис. 55). Изучение экспрессии маркеров зрелых Т-клеток в ПЖ у лиц старше 60 лет показало, что у пожилых людей и в старческом возрасте количество Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов не изменяется, тогда как у долгожителей число обеих субпопуляций Т-клеток (в особенности Т-хелперов) возрастает. Вероятно, увеличение числа Т-лимфоцитов в ПЖ у людей старше 60 лет обусловлено генетическими особенностями, и может являться одним из признаков сохранной функции иммунной системы и компенсаторной роли ПЖ.
