Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1. ФУНКЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ
2.1.1. Классификация и структура интерферонов (IFN) 10
2.1.2. Действие IFN на клетки 11
2.1.2.1. Антивирусная активность IFN 11
2.1.2.2. Антибактериальная активность IFN 12
2.1.2.3. Противоопухолевая активность IFN 12
2.1.2.4. Иммуномодулирующая активность IFN 13
2.1.3. Молекулярный механизм передачи сигнала IFN 14
2.1.4. IFN-индуцируемые белки 1 б 2.2.7.1. 2,-5 -олигоаденилат-синтетаза (2-5AS)
2.2.7.3. Индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) 18
2.2. ТРИПТОФАНИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗA (WRS) 19
2.2.1. Структура WRS млекопитающих 19
2.2.2. Каноническая активность WRS - синтез триптофанил-тРНК 22
2.2.3. Неканонические активности WRS 23
2.2.4. Ген WRS человека и регуляция его экспрессии под действием интерферона 25
2.2.5. Способность WRS к синтезу Ар3А и роль АрзА в клеточном ответе на IFN 29
2.3. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА З О
2.3.1. Циклин-зависимые киназы (CDK) - основные регуляторы клеточного цикла 30
2.3.2. Фосфорилирование CDK 34
2.3.3. Субстраты CDK 3 5
2.3.4. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКІ) 37
2.3.5. Контроль клеточного цикла и онкогенез 42
2.3.6. Молекулярные механизмы влияния IFN на клеточный цикл 43
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 49
3.1. Реагенты 49
3.2. Проверка чистоты используемых материалов 4 9
3.3. Определение концентрации белка 49
3.4. Аналитическая гель-фильтрация и ионообменная хроматография 50
3.5. Электрофорез 50
3.6. Определение активности WRS в реакции аминоацилирования тРНК Стр.
3.7. Выделение рекомбинантного WRS человека 51
3.8. Антитела и антисыворотки, очистка поликлональных антител (пАТ) 52
3.9. Иммуноблотгинг 53 ЗЛО. Иммунопреципитация белков 53
3.11. Ингибирование киназной активности CDK 54
3.12. Клеточные культуры 55
3.13. Получение клеточных экстрактов 55
3.14. Конструкция антисмысловой WRS и трансфекция клеток человека 55
3.15. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью изотопного мечения 56
3.16. Анализ РНК методом Нозерн-гибридизации 56
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58
4.1. ВЛИЯНИЕ МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНКИНАЗ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА WRS ЧЕЛОВЕКА 58
4.1.1. Влияние IFN и активатора протеинкиназы С (РКС) на содержание WRS в клетках человека 58
4.1.2. Влияние ингибиторов РКС на экспрессию WRS 63
4.1.3. Возможные механизмы активации экспрессии гена WRS человека протеинкиназой С 68
4.1.4. Индукция WRS протеинкиназой С объясняет повышение уровня АРЗА в ответ на РМА 70
4.1.5. Взаимосвязь некоторых РКС- и IFN-регулируемых белков 71
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ WRS с CDK в ХОДЕ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА IFNy 7 5
4.2.1. Изучение влияния WRS человека на активность протеинкиназ 75
4.2.2. Исследование механизма ингибирования киназ семейства CDK 79
4.2.3. Влияние WRS на связывание CDK с циклинами 83
4.3. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ WRS в АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ IFNy 87
4.3.1. Возможная роль WRS в регуляции клеточного цикла интерфероном 87
4.3.2. Влияние WRS на антипролиферативное действие IFNy 89
4.3.3. Роль различных ингибиторов CDK в антипролиферативной активности IFNy 95
5. ВЫВОДЫ 101
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1
Введение к работе
Интерфероны (IFN), главные цитокины врожденного иммунного ответа, играют ключевую роль в регуляции антивирусной и противоопухолевой защиты организма. Врожденный иммунный ответ особенно важен па ранней стадии защиты организма от биологической агрессии, до того как развивается антиген-специфический адаптивный иммунный ответ. Это приводит к формированию защитного состояния в инфицированном организме, позволяя снизить интенсивность инфекционного процесса и давая достаточное время для формирования адаптивного иммунного ответа. IFN организуют этот «первый рубеж» защиты от чужеродных агентов, повышая (или снижая) экспрессию целого ряда генов. Несмотря на то, что роль некоторых из IFN-индицируемых белков в защитных реакциях хорошо известна (таких, например, как компоненты главного комплекса гистосовместимости, протеинкиназа R, 2 -5 -олигоаденилат-синтетаза (2-5AS) или РНКаза L), другие IFN-индуцируемые белки требуют более глубокого исследования для понимания широкого спектра эффектов, вызываемых IFN.
Одним из таких белков является триптофанил-тРНК-синтетаза (WRS, К.Ф. 6.1.1.2) человека. Известно, что WRS вовлечен в различные защитные реакции организма. Помимо индукции различными 1FN, экспрессия WRS повышается в ходе кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа [Yang et al., 2001] и на последних стадиях созревания мононуклеарных фагоцитов [Krause et al., 1996]. Недавно было обнаружено, что WRS человека обладает выраженной антиангиогенной активностью, являясь, таким образом, цитокином [Wakasugi et al., 2002; Otani et al., 2002], в связи с чем было предложено использовать WRS человека для лечения гипоксических и других пролиферативных ретинопатии. Помимо так называемой «канонической» активности WRS (активация триптофана для последующего его использования в биосинтезе белка путем связывания его со специфической тРНК), которая была подробно охарактеризована, WRS обладает рядом «неканонических» активностей, являясь, таким образом, полифункциональным белком. В частности, ранее нами было показано, что N-домен WRS быка (но не человека) обладает протеинкиназной активностью [Елизаров и соавт., 1997]. Однако, с момента неожиданного открытия IFN-индуцируемости WRS человека, более десятилетия роль WRS в ответе клетки на IFN остается не до конца понятной и вызывает большой интерес исследователей.
Исследование механизмов действия интерферонов является актуальной для современной иммунологии и биохимии проблемой. Возрастающий интерес исследователей и практических врачей к этой проблеме обусловлен не только высокой эффективностью применения препаратов интерферона при таких патологических состояниях, как вирусные и онкологические заболевания, болезни крови, но и неуклонным ростом числа больных, страдающих вышеперечисленными заболеваниями, что придает исследованию особенную актуальность.
Цель работы: изучение путей регуляции и механизмов действия IFNy-индуцируемой WRS человека как части IFNy-зависимой защитной системы организма.
Задачи исследования:
- изучение влияния модуляторов активности протеинкиназы С на экспрессию IFNy-индуцируемого гена WRS в культуре клеток человека HeLa и НЕК293;
- изучение влияния IFNy-индуцируемого WRS человека на активность киназ семейства CDK человека;
- исследование механизмов взаимодействия WRS с CDK в ходе клеточного ответа на IFNy;
- исследование роли IFN-индуцируемого WRS человека в развитии антипролиферативного действия IFNy.
Научная новизна и практическая ценность работы
Обнаружено, что ген WRS индуцируется IFNy в эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293. Показано, что протеинкиназа С положительно регулирует экспрессию гена WRS человека, На основе полученных данных была предложена гипотетическая схема участия протеинкиназы С в согласованной регуляции ряда IFN-индуцируемых ферментов, связанных с метаболизмом триптофана и 5 5 "-диаденозинтрифосфата (Ар3Л), и обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью.
Обнаружена ранее неизвестная CDK-ингибирующая активность WRS человека и показана ее роль в антипролиферативном действии IFNy. Продемонстрировано, что рекомбинантный WRS человека ингибирует киназную активность CDK in vitro, и lFNy-индуцированный WRS человека ингибирует активность CDK в культуре клеток человека. Обнаружено, что индукция WRS в ответ на IFNy вызывает образование комплекса WRS с cdc2 и CDK2 в клетках HeLa, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2. Доказано, что WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия IFNy в культуре клеток человека. Эти данные демонстрируют ранее неизвестные механизмы воздействия IFNy на клетки человека. Знание механизмов регуляции клеточного цикла в ответ на аптипролиферативиый сигнал представляет большой интерес для современной науки и медицины.
Полученные новые данные о механизмах действия IFNy на клетки человека важны для понимания патогенеза вирусных и онкологических заболеваний и могут послужить для прогнозирования течения этих заболеваний и разработки новых подходов их лечения. Кроме того, эти данные могут помочь более эффективно использовать IFNy для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (224 наименования). Диссертация содержит 19 рисунков и 3 таблицы. Положения, выносимые на защиту
1. Протеинкиназа С активирует экспрессию гена WRS в клетках человека HeLa и НЕК293.
2. WRS человека специфически ингибирует активность cdc2 и CDK2 человека in vitro.
3. В ходе ответа клетки на IFNy WRS человека образует комплекс с cdc2 и CDK2 в клетках человека, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2.
4. WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия IFNy в клетках НЕК293 и HeLa.
