Введение к работе
Актуальность
Термин «аполтоз» был введен в начале 1970-х гг. для обозначения особого типа клеточной гибели, отличного от некроза [Green, 2002; Newmeyer, 2003]. Эта разновидность гибели клеток много раз «открывалась» и предавалась забвению разными цитологами и учеными, изучавшими биологию развития. Изначально она была забыта как малозначимый феномен, однако оживление интереса к апоптозу произошло после того, как было осознано, что этот процесс является генетически регулируемым (программируемым) механизмом, а не просто случайным событием. После этого понятия «апоптоз» и «программируемая клеточная гибель» стали использоваться как синонимы Эта управляемая форма клеточной гибели так же важна и физиологична, как и пролиферация и дифференцировка клеток, и так же четко регулируется. Базисная информация о генетической регуляции апоптоза получена из блестящих работ на примитивном организме Caenorrhabditis elegans [Newmeyer, 2003]. Оказалось, что гены, которые регулируют апоптоз у этого круглого червя, имеют гомологов у млекопитающих, включая человека. Это доказало, что апоптоз является важным процессом, сформированным и сохраняемым эволюционно.
В течение последних 15-20 лет число исследований, посвященных апоптозу, росло экспоненциально. Было обнаружено, что апоптоз вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Баланс между пролиферацией и гибелью клеток должен быть точно установлен и хорошо контролироваться, поскольку дисбаланс в этой системе может приводить к болезни. Примеры заболеваний, при которых имеются нарушения апоптоза, многочисленны и значительны. Усиление апоптоза нейронов является одним из факторов патогенеза нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Haunstetter, 2000; Nicholson, 2000]. Связывание ВИЧ или его белка gpl20 с CD4+ Т-клетками при одновременной стимуляции комплекса МНС-П запускает апоптоз в этих клетках-хелперах, что в итоге приводит к СПИДу [Rathmell, 2002; Opferman, 2003]. Развитие многих онкологических заболеваний связывают с задержкой апоптоза [Green, 2002].
Физиологическое значение апоптоза иллюстрируется его важнейшим вкладом в регуляцию иммунной системы [Rathmell, 2002; Opferman, 2003]. Апоптоз участвует в контроле за созреванием Т- и В-клеток и элиминацией аутореактивных лимфоцитов. Пролиферация и экспансия лимфоцитов после встречи с антигеном, выживание клеток памяти и гибель активированных Т-клеток при инволюции иммунного ответа - все эти реакции приобретенного иммунитета связаны с усилением или
j ——
J і ' - . ' 'ЬЧАЯ ' ,
угнетением апоптоза. Кроме того, иммунная толерантность в иммунологически привилегированных областях (например, передняя камера глаза и яички) обеспечивается механизмами, связанными с апоптозом [Rathmell, 2002; Opferman, 2003].
Настоящая работа посвящена изучению апоптоза нейтрофилов, которые являются одним из главных компонентов врожденного иммунитета. Нейтрофилы составляют самый большой пул лейкоцитов периферической крови (от 40 до 70% в нормальных условиях). Они защищают организм от бактериальных и грибковых инфекций. Для этого нейтрофилы оснащены необходимыми инструментами, которые позволяют им выявлять очаг инфекции, двигаться в его направлении и поглощать и уничтожать микроорганизмы [Маянский А.Н., 1989; Klebanoff, 1978]. Очевидно, что для надлежащего функционирования этого рубежа защиты достаточное число нейтрофилов должно производиться костным мозгом и высвобождаться из него, будучи способными исполнять большое число различных функций. Однако, в связи с тем, что сами нейтрофилы и продукты их метаболизма потенциально опасны для тканей хозяина, существует целый ряд барьеров для предотвращения таких нежелательных побочных эффектов. Одним из таких механизмов служит апоптоз. Благодаря апоптозу удается предотвратить выход цитотоксического содержимого нейтрофилов в окружающие ткани и своевременно элиминировать погибающие клетки через тканевые макрофаги [Dransfield, 2000; Savill, 2000].
Несмотря на значительный объем литературы, посвященной исследованию апоптоза нейтрофилов, ряд важных вопросов остается неизученным. Так, по-прежнему не расшифрованы молекулярные механизмы апоптоза, хотя известно, что его регуляция осуществляется при участии белков семейства Вс1-2 и каспаз. Предполагается, что эти две группы молекул тесно взаимодействуют на уровне митохондрий: гомологи Вс1-2 могут управлять активностью каспаз через влияние на проницаемость наружной митохондриальной мембраны [Adams, 1998, 2002; Newmeyer, 2003]. Повышение проницаемости облегчает высвобождение митохондриальных проапоптозных факторов и сборку апоптосомы [Adams, 2002] - мультимолекулярного комплекса, активирующего инициаторную каспазу-9. Вслед за этим происходит активация эффекторных каспаз, которые расщепляют множество мишеней, что ведет к дезорганизации и гибели клетки. Как физиология митохондрий, так и функционирование этого внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза в нейтрофилах до сих пор подробно не исследовалось, хотя он видится особенно значимым, т.к. нейтрофилы настроены на быструю, спонтанную гибель в отсутствие дополнительных внешних воздействий. Кроме того, неполно освещены и пути модуляции апоптоза нейтрофилов под влиянием биологически активных медиаторов, в частности, цитокинов. Эндогенные цитокины играют важную роль в регуляции воспаления. Широко применяются цитокины и в виде
фармакологических препаратов, как, например, Г-КСФ, используемый при нейтропениях. Его воздействие на нейтрофилы in vivo направлено в том числе и на регуляцию апоптоза [Spiekerman, 1997; Kuijpers, 2002]. В этом свете интересным видится изучение функциональных способностей нейтрофилов при апоптозе и его задержке антиапоптозными агентами, в частности, Г-КСФ.
В последнее время появились сообщения о каспазонезависимой (программированной) клеточной гибели, которая может играть важную роль в ряде физиологических процессов [Lockshin, 2002]. Возможность такого альтернативного механизма гибели нейтрофилов остается неизученной.
Преждевременный (ускоренный) апоптоз нейтрофилов и их костномозговых предшественников лежит в основе развития нейтропений различного спектра, включая тяжелую врожденную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению [Aprikyan, 2000, 2001, 2002, 2003; Kuijpers, 2002; Papadaki, 2003]. В то же время, при ряде заболеваний, при которых нейтропения является сопутствующим, но нередко жизнеугрожающим синдромом, ее механизмы остаются невыясненными [Kuijpers, 2002]. К примерам таких заболеваний относятся гликогеноз типа lb (GSDlb) [Visser, 2000; Calderwood, 2001] и синдром Барта (СБ) [Barth, 1983, 1999]. В связи с этим представляется важным оценить возможный вклад апоптоза в патогенез нейтропений при указанных заболеваниях.
Таким образом, более подробное изучение событий, лежащих в основе клеточной гибели нейтрофилов, внесет вклад в понимание физиологии нейтрофилов и будет способствовать поиску новых подходов к управлению воспалением и лечению состояний, связанных с расстройствами апоптоза нейтрофилов.
Цель исследования - изучение механизмов и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, а также потенциальной роли апоптоза в патогенезе нейтропений.
Задачи:
-
Проанализировать влияние апоптоза на функциональные способности нейтрофилов.
-
Исследовать особенности митохондрий и внутреннего (митохондриального) механизма апоптоза нейтрофилов.
-
Уточнить механизмы антиапоптозного действия Г-КСФ
-
Провести поиск альтернативных путей клеточной гибели нейтрофилов и выяснить их механизмы.
-
Изучить значение апоптоза в патогенезе нейтропений при гликогенозе типа 1 b и синдроме Барта.
Научная новизна
Описаны новые маркеры апоптоза нейгрофилов, которые могут быть использованы для количественной оценки клеточной гибели. Впервые подробно исследованы особенности митохондрий нейгрофилов и установлено их участие в регуляции апоптозной программы этих клеток. Показано, что при апоптозе нейгрофилов митохондрии выделяют в цитозоль проапоптозные белки, которые способствуют активации каспаз. Установлено, что в нейтрофилах может происходить цитохром с-независимая активация каспазы-9. Выявлена иерархия активации каспаз при ТНФ-а-индуцированном апоптозе нейгрофилов, согласно которой активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8. Получены дополнительные данные о работе внутреннего (митохондриального) пути апоптоза нейтрофилов и механизмах антиапоптозных эффектов Г-КСФ в рамках этого пути. Впервые описан каспазонезависимый механизм клеточной гибели нейтрофилов и определены его вероятные механизмы и эффекторы. Впервые в циркуляции у больных GSDlb обнаружены апоптозные нейтрофилы и получены данные о возможной роли апоптоза в патогенезе неитропении при этом заболевании. Впервые детально исследованы функции нейтрофилов при СБ. Показано, что повышенное связывание аннексина-V нейтрофилами больных СБ не свидетельствует об апоптозном фенотипе этих клеток.
Теоретическая и практическая значимость
В ходе настоящего исследования получена новая информация о механизмах и регуляции клеточной гибели нейтрофилов, которая углубляет понимание физиологии нейтрофилов и механизмов реакций, опосредуемых этими клетками. Полученные данные расширяют представления о физиологии митохондрий: в нейтрофилах эти органеллы регулируют клеточную гибель, но утрачивают роль в энергетическом метаболизме клеток. Выявление цитохром с-независимой активации каспазы-9 оспаривает постулат о том, что цитохром с является универсальным и ведущим эффектором апоптоза, и станет стимулом для поиска альтернативных медиаторов клеточной гибели. Это позволит углубить знания о механизмах регуляции апоптоза. Изучение внутреннего механизма апоптоза нейтрофилов и антиапоптозных эффектов Г-КСФ обозначило ряд интересных потенциальных мишеней (конформаштонная активация Вах, расщепление Bid, активация каспаз) для направленного поиска средств для фармакологического управления апоптозом нейтрофилов. Исследование нейтрофилов больных GSDlb вскрывает роль усиления апоптоза в развитии неитропении при этом заболевании, что может способствовать поиску адекватных лечебных мер. Вместе с тем, отсутствие апоптозного фенотипа и сохранные клеточные функции у нейтрофилов больных СБ несмотря на повышенное связывание аннексина-V указывает на то, что оценка клеточной гибели по единственному
критерию не всегда дает истинную картину. Это следует учитывать при изучении апоптоза, в связи с чем предложенные в настоящей работе новые маркеры клеточной гибели будут полезными.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Митохондрии нейтрофилов утрачивают метаболические функции, но продолжают участвовать в регуляции клеточной гибели.
-
В нейтрофилах возможна цитохром онезависимая активация каспазы-9; активация каспазы-9 и каспазы-3 предшествует активации каспазы-8.
-
Апоптоз нейтрофилов сопровождается конформационной активацией Вах, расщеплением Bid, гранслокацией Bax/Bid к митохондриям, выходом проапоптозных белков митохондрий в цитозоль и активацией каспаз. Антиапоптозные эффекты Г-КСФ связаны с угнетением перечисленных реакций.
-
ТНФ-сс способен вызывать клеточную гибель нейтрофилов по двум механизмам: каспазозависимому (апоптоз) и каспазонезависимому. Последний отличается от апоптоза по ряду признаков, опосредуется митохондриальными АФК и требует внутримитохондриальной протеазной активности Omi/HtrA2.
-
В циркуляции у больных GSDlb присутствуют апоптозные нейтрофилы.
-
Связывание аннексина-V нейтрофилами при СБ не является индикатором их апоптозного фенотипа.
Апробация работы
Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены и обсуждены на 34-ом (г. Орхус, Дания, 17-20 мая 2000 г.), 36-ом (г. Брюссель, Бельгия, 10-13 апреля 2002 г.), 37-ом (г. Верона, Италия, 2-5 апреля 2003 г.) и 38-ом (г. Утрехт, Нидерланды, 14-17 апреля 2004 г.) ежегодных съездах Европейского общества по клиническим исследованиям (ESCI), на ежегодных съездах общества иммунологов Нидерландов (г. Лиссе, Нидерланды, 20-21 декабря 2001 г. и 18-19 декабря 2003 г.), на заседаниях Нидерландского общества по воспалению (г. Амстердам, Нидерланды, 9 октября 2001 и г. Лейден, Нидерланды, 9 октября 2003 г), на ежегодных съездах гематологов и трансфузиологов Нидерландов (NVB Sanquin day; г. Эде, Нидерланды, 25 мая 2000 г. и 5 июня 2003 г.), на симпозиуме Keystone «Апоптоз в биохимии и структурной биологии» (г. Кистоун, Колорадо, США, 3-8 февраля 2004 г.), на 11-ом Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (г. Новосибирск, 4-6 октября 2000 г.), на заседаниях общества иммунологов г. Н. Новгорода.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 19 статей в центральных отечественных и международных научных
журналах и 5 публикаций в материалах российских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, описания материалов и методов, 7 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. Объем диссертации 194 страницы машинописного текста Работа иллюстрирована 50 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 304 источника, в том числе 5 отечественных и 299 иностранных.
Похожие диссертации на Механизмы и регуляция клеточной гибели нейтрофилов
