Введение к работе
Актуальность темы
Проблема старения является одним из приоритетных направлений современной биологии и медицины. В настоящее время в мире в общей численности населения прогрессивно увеличивается доля лиц пожилого и старческого возраста [Сафарова Г.Л., 2009]. Увеличение средней продолжительности жизни, а, следовательно, и прогрессирующее старение населения [Коркушко О.В. и др., 2002] приведет в ближайшем будущем к необходимости решения целого ряда медицинских, социальных
и экономических проблем. В связи с этим основная задача гериатрии – профилактика возрастной патологии становится важнейшим медицинским направлением.
Старение является сложным многоуровневым процессом, который проявляется как гипопластическими изменениями клеток и тканей организма, так и снижением их функциональной активности. Процессы старения связаны с многочисленными морфологическими
и функциональными изменениями, обусловленными патологическими или компенсаторными реакциями [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Хавинсон В.Х.
и др., 2008].
Основным проявлением старения является инволюция трех важнейших регуляторных систем – нервной, иммунной и эндокринной [Пальцев М.А. и др., 2006]. Возраст-ассоциированные изменения этих систем связаны с общими законами старения организма, но имеют свои особенности, обусловленные структурно-функциональной спецификой каждого органа. На клеточном и субклеточном уровнях организации данный процесс проявляется в нарушении синтеза и секреции многих сигнальных молекул и, прежде всего, пептидов. Известно, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [Корнева Е.А. и др., 1988; Шатаева Л.К. и др., 2003; Хавинсон В.Х., 2009].
Многолетние исследования показали, что синтетические пептиды способны восстанавливать различные функции органов и тканей при их возрастной инволюции. Однако методология исследования механизмов действия геропротекторных пептидов до сих пор полностью
не определена.
В связи с этим представляется актуальным разработка единой методологии исследования механизмов действия пептидов
на нейроиммуноэндокринные, молекулярные и межклеточные взаимодействия при старении организма.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования явилась разработка методологии исследования механизмов действия пептидных геропротекторов.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
-
Исследовать действие пептидов Т-31, Т-34 и Т-38 на синтез белков цито- и кариоскелета в культуре мышиных фибробластов.
-
Оценить влияние пептидов Т-31 и Т-34 на развитие апоптоза
в культуре мышиных фибробластов и эпителиоцитов желудка человека. -
Изучить действие пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0
на дифференцировку полипотентной ткани ранней гаструлы Xenopus laevis. -
Исследовать влияние пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 на активацию, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток костного мозга и печени эмбриона, малодифференцированных клеток тимуса и периферической крови человека.
-
Изучить влияние пептидов Т-34 и Т-38 на структуру ткани двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки крыс в модели радиационного старения.
-
На основе разработанной методологии исследований оценить геропротекторные механизмы действия пептидов на нейроиммуноэндокринную систему.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые проведены широкие многоплановые исследования, позволившие разработать методологию исследования пептидных биорегуляторов и выяснить нейроиммуноэндокринные основы пептидной регуляции процессов старения.
Применение метода флюоресцентной конфокальной микроскопии позволило показать тканеспецифическое участие пептида Т-31 в индукции синтеза белков цито- и кариоскелета в культуре фибробластов мыши. Пептид Т-31, имеющий сродство к хрящевой ткани, активировал экспрессию актина, виментина, тубулина и ламинов А и С. При этом пептиды Т-34 и Т-38, специфичность которых направлена на ткани бронхов и сосудов, не оказывали такого эффекта.
Показано, что пептиды Т-31 и Т-34 в культурах фибробластов мыши и эпителиоцитов желудка человека проявляли антиапоптотический эффект, реализуемый путем повышения сопротивляемости митохондрий
к бактериальным повреждениям.
Впервые выдвинуто предположение о том, что мишенями действия геропротекторных пептидов являются внутриклеточные сигнальные молекулы, активность которых реализуется через осуществляемую пептидами реструктуризацию белков цитоскелета и внутриядерные белки, регулирующие соотношение гетеро- и эухроматина в ядре. Кроме того, установлено, что пептиды снижают уровень апоптоза, усиление которого является одним их ключевых признаков старения.
Методом клеточных культур впервые получены данные
о тканеспецифическом действии пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0
на дифференцировку полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы лягушки. Установлено, что пептиды АКС-П и АП-0 запускают развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия, тогда как пептиды АК-0 и АЕ-0, синтезированные на основе экстрактов из тканей мозга, не влияют
на развитие сомитов. При этом пептид АЕ-0 индуцирует дифференцировку нервной ткани. Выявлено, что в основе способности пептидов стимулировать развитие полипотентных клеток лежит усиление синтеза белка -актина. Впервые сделан вывод о том, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность стимулировать процессы клеточной дифференцировки.
Методом проточной цитометрии проведено комплексное исследование действия пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и
Т-37 на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток тимуса, костного мозга, печени и периферической крови человека. Установлено, что пептиды AT-0, AB-17, AB-A и T-31 при введении
в культуру клеток костного мозга и печени эмбриона вызывают экспрессию лимфоидных и миелоидных маркеров на 3-15% клеток. Мишенями действия синтетических пептидов в этом случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие молекулу CD34. Показано, что в зависимости от структуры пептида дифференцировка кроветворных клеток-предшественников осуществляется различными путями.
Впервые выявлена стимуляция созревания тимоцитов человека при инкубации с пептидами. При этом отмечена смена мембранного фенотипа предшественников Т-клеток в направлении дифференцировки и усиление их пролиферации. Появление новых молекул на поверхности тимоцитов под влиянием пептидов во всех случаях реализуется в результате синтеза белка de novo и отменяется блокаторами синтеза белков. Впервые получены данные о том, что пептид Т-37 активирует эпителиальные клетки тимуса (ТЭК), индуцируя экспрессию на их поверхности молекулы HLA-DR; при этом степень апоптоза ТЭК снижается, а их пролиферативная способность возрастает.
При действии пептидов AT-0, AB-A и T-37 на лимфоциты крови in vitro изменяется экспрессия маркеров основных популяций лимфоцитов: снижается экспрессия маркера В-клеток, усиливается экспрессия маркеров натуральных киллеров (NK-клеток) и Т-лимфоцитов. Под влиянием указанных пептидов впервые зарегистрирована экспрессия второго корецептора CD4 на зрелых регуляторных Т-клетках с фенотипом CD8+.
Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что спектр биологического действия изученных пептидов на клетки иммунной системы является разнонаправленным. Пептиды AT-0, AB-17, AB-A и T-31 вызывают дифференцировку стволовых клеток, пептиды AT-0, AB-17,
T-31 и T-37 воздействуют на тимоциты, при этом эффекты пептида T-37 связаны с эпителиальными клетками тимуса, AT-0, AB-A и T-37 влияют
на активность зрелых лимфоцитов периферической крови.
Использование методов проточной цитометрии и клеточных культур позволило выявить активирующий эффект пептидов на различные субпопуляции иммунных клеток. Впервые выдвинуто предположение
о том, что пептидные биорегуляторы в первую очередь воздействуют на иммунную систему, инволюция которой при старении выражена наиболее ярко.
В радиационной модели старения изучены геропротекторные эффекты пептидов Т-34 и Т-38 на клетки двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса крыс. Впервые установлено, что пострадиационное восстановление структуры двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса определяется тканеспецифическими свойствами исследованных пептидов.
Показано, что пептид Т-34, имеющий сродство к тканям дыхательной системы, не оказывал положительного воздействия на облученные органы. Однако пептид Т-38, мишенью действия которого является сосудистая ткань, усиливал пролиферацию выживших после радиационного воздействия клеток кишечника, активировал гемопоэз
в селезенке и лимфопоэз в тимусе. Действие пептида Т-38 на облученные ткани выражалось в отсутствии отека и нарушений со стороны сосудистого русла.
Применение совокупности использованных в работе методов исследования позволило сформировать системный подход к анализу механизма действия геропротекторных пептидов, а также установить,
что исследуемые пептиды воздействуют на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток различных тканей путем стимуляции синтеза регуляторных белков, экспрессия которых снижается при старении.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Применение методов клеточных культур, флюоресцентной конфокальной микроскопии и проточной цитометрии позволило показать, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность регулировать морфо-функциональное состояние на уровне органов, тканей, клеток и внутриклеточных сигнальных молекул.
-
Геропротекторный пептид Т-31 индуцирует синтез белков цито-
и кариоскелета в фибробластах мышей, что позволяет предположить его участие в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов путем реструктуризации белков цитоскелета и изменения структуры хроматина через воздействие на синтез ядерных белков. -
В основе геропротекторного действия пептидов AT-0, AB-17, AB-A, T-31, АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 лежит стимуляция дифференцировки стволовых клеток костного мозга, печени эмбрионов человека и полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки. Направление дифференцировки полипотентной ткани и стволовых клеток определяется выбранным пептидом.
-
Основой геропротекторного действия пептидов является их способность активировать иммунную систему, подверженную старению в первую очередь. Пептиды АТ-0, АВ-А, АВ-17, Т-31
и Т-37 оказывают селективное действие на различные популяции иммунных клеток тимуса и периферической крови человека: AT-0, AB-17, AB-A и T-31 усиливают дифференцировку иммунных клеток тимуса; AT-0, AB-17, T-31, T-37 влияют на активацию, апоптоз
и пролиферацию тимоцитов и эпителиальных клеток тимуса; AT-0, AB-A и T-37 индуцируют активацию, пролиферацию
и дифференцировку иммунных клеток периферической крови. -
Молекулярные механизмы действия геропротекторных пептидов проявляются на тканевом и органном уровне. Пептид Т-38 способствует постлучевому восстановлению тканей двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки в модели радиационного ускоренного старения на крысах. Стимулирующий эффект пептида Т-38 выражается в восстановлении сосудистого компонента указанных органов, что отражает его тканеспецифичность.
-
Разработанная методология исследования пептидных геропротекторов позволила установить, что в основе их действия лежит регуляция активности сигнальных молекул в органах нейроиммуноэндокринной системы.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Бельгия, 2004); IX Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2004); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004); IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Украина, 2005); II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005);
XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); VI Интернациональной конференции по нейроиммуномодуляторам (Греция, 2005); VIII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006); Научной конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006);
VI европейском конгрессе «Здоровье и активное долголетие для всех европейцев» (Санкт-Петербург, 2007); IV Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2007); IV Международном конгрессе «Человек, спорт, здоровье» (Санкт-Петербург, 2009); XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2010); XV Юбилейного Российского национального конгресса «Человек и его здоровье и III российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010).
Реализация результатов исследования
Результаты исследований изложены в 2 главах в книге «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов; в главе в книге «Избранные лекции по геронтологии», рекомендованной УМО при ММА им. И.М. Сеченова в качестве учебного пособия для системы послевузовского медицинского образования.
Результаты работы используются в научной, педагогической
и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Белгородского государственного университета.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них -
16 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ,
2 статьи в других изданиях, 2 монографии, 2 главы в руководствах и
23 тезиса докладов.
Связь с научно-исследовательской работой института
Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции
и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
