Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические маркеры экспозиции и эффекта в профилактической токсикологии 19
1.1. Терминология 19
1.2. Биомаркеры экспозиции и их роль в биологическом мониторинге на производстве 20
1.2.1. Биомаркеры экспозиции 20
1.2.2. Биологический мониторинг экспозиции 23
1.2.3. Классификация методов биологического мониторинга экспозиции 27
1.2.4. Преимущества биологического мониторинга экспозиции 29
1.2.5. Условия и ограничения биологического мониторинга экспозиции 31
1.3. Биомаркеры эффекта 33
1.3.1. Биомаркеры раздражающего эффекта 33
1.3.2. Биомаркеры общетоксического действия промышленных веществ 35
1.3.3. Биомаркеры гепатотоксического и нефротоксического эффектов 38
1.3.4. Рекомендации ВОЗ и МОТ по этическим и социальным аспектам использования биомаркеров 40
Заключение 42
Глава 2. Объекты, объем и методы исследований 45
Глава 3. Обоснование новых метаболических биомаркеров эффекта для гигиенического нормирования и оценки риска воздействия промышленных веществ 60
3.1. Исследование ПГС и уровня Цх Р-450 после однократного воздействия сероуглерода 61
3.2. Исследование ПГС и уровня Цх Р-450 после однократного воздействия стирола 63
3.3. Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия хлорбензола 66
3.4. Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия хлористого метилена 71
3.5. Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия дихромата натрия 71
3.6. Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия этинилвинилбутилового эфира (бутоксибутенина) 75
3.7. Исследование параметров биотрансформации после однократного и повторного воздействия тетрафторэтилового эфира фенола (фенталена) 76
3.8. Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия толуола 81
3.9. Исследование уровня цитохрома Р-450 и восстановленного глутатиона в печени после однократного воздействия 4-бром-о-ксилола 82
3.10. Исследование уровня цитохрома Р-450 и восстановленного глутатиона в печени после однократного воздействия изобутилбензола 84
3.11. Исследование уровня цитохрома Р-450 и восстановленного глутатиона в печени после однократного воздействия мерказолила 87
3.12. Исследование уровня цитохрома Р-450 и восстановленного глутатиона в печени после однократного воздействия о-бромтолуола 89
3.13. Исследование уровня цитохрома Р-450 и восстановленного глутатиона в печени после однократного воздействия аллетрина 90
Глава 4. Исследование патогенетических биомаркеров эффекта и их соотношений при гигиеническом нормировании и оценке риска воздействия химических веществ 93
4.1. Патогенетические биомаркеры эффекта и их соотношение при воздействии 2,6-диизопропилфенилизоцианата (ДФЦ) 94
4.1.1. Изменение биомаркеров эффекта при однократном воздействии ДФЦ в различных концентрациях 94
4.1.2. Парный корреляционный анализ соотношений патогенетических биомаркеров эффекта при экспозиции ДФЦ 97
4.1.3. Экспериментальная терапия интоксикации, вызванной ДФЦ 101
4.2. Патогенетические биомаркеры эффекта и их соотношение при воздействии морфолинборана 105
4.2.1. Изменение биомаркеров эффекта после однократной ингаляции морфолинборана в различных концентрациях 105
4.2.2. Парный корреляционный анализ соотношений биохимических биомаркеров эффекта при экспозиции морфолинборана 108
4.3. Патогенетические биомаркеры эффекта и их соотношение при воздействии олеиновой кислоты 112
4.3.1. Изменение биомаркеров эффекта после однократной ингаляции олеиновой кислоты в различных концентрациях 112
4.3.2. Парный корреляционный анализ биомаркеров эффекта при воздействии олеиновой кислоты 114
4.4. Патогенетические биомаркеры эффекта и их соотношение при воздействии изобутнлового эфира 3,5-диашшо-4-хлорбензойной кислоты (ИБЭДАХБК) .119
4.4.1. Изменение биомаркеров эффекта при экспозиции ИБЭДАХБК 119
4.4.2. Парный корреляционный анализ соотношений биомаркеров эффекта у экспериментальных животных при экспозиции ИБЭДАХБК 120
4.5. Патогенетические биомаркеры эффекта и их соотношение при воздействии аллетрина 123
4.5.1. Изменение биомаркеров эффекта при однократной экспозиции аллетрина 123
4.5.2. Парный корреляционный анализ биомаркеров эффекта при ингаляции аллетрина 126
Глава 5. Сравнительная характеристика биомаркеров специфического и общетоксического эффектов при оценке риска профессионального воздействия вредных веществ 130
5.1. Прогнозирование риска развития неблагоприятных эффектов в зависимости от интенсивности воздействия химических веществ, обладающих избирательным действием 133
5.1.1. Исследование соотношения параметров токсикометрии раздражающих веществ к ПДК 133
5.1.2 Анализ зависимости степени выраженности неблагоприятных эффектов от уровня превышения гигиенических стандартов раздражающих веществ 135
5.1.3. Модификация классов условий труда для раздражающих веществ 137
5.1.4. Исследование соотношения параметров токсикометрии и ПДК для веществ - ингибиторов холинэстеразы 139
5.2. Прогнозирование риска развития неблагоприятных эффектов в зависимости от интенсивности воздействия химических веществ общетоксического действия 141
5.2.1 Исследование отношения параметров токсикометрии к ПДК в группах веществ общетоксического действия, объединенных по химическому строению 141
5.2.2 Анализ зависимости степени выраженности неблагоприятных эффектов от уровня превышения гигиенических стандартов веществ общетоксического действия, объединенных по классу опасности 144
5.2.3 Модификация границ классов условий труда для веществ общетоксического действия 149
Глава 6. Биомаркеры раздражающего эффекта при тестировании химических веществ в опытах in vitro 153
6.1. Исследование раздражающего действия химических соединений на инфузориях Paramecium caudatum 154
6.2. Исследование раздражающего действия химических соединений на клетках Hela (метод MIT-24) 155
6.3. Исследование раздражающего действия химических соединений на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона (НЕТ-САМ тест) 158
6.3.1. Анализ связи показателей раздражающего действия веществ по НЕТ-САМ тесту и тесту Draize в зависимости от их растворимости в воде или в жирах 158
6.3.2. Связь между оценкой выраженности раздражающего эффекта по методу Draize и НЕТ-САМ тесту 160
Глава 7. Биомаркеры экспозиции и биологические ПДК промышленных веществ 164
7.1. Анализ принципов обоснования биологических гигиенических стандартов в разных странах 164
7.2. Сравнение величин биологических ПДК и гигиенических стандартов для воздуха рабочей зоны вредных химических веществ, принятых в различных странах 170
7.3. Обоснование биологической ПДК сероуглерода 173
7.3.1. Биомаркеры экспозиции CS2 в крови/сыворотке 174
7.3.2. Биомаркеры экспозиции CS2 в выдыхаемом воздухе 174
7.3.3. Биомаркеры экспозиции CS2 в моче 175
7.3.4. Обоснование биологической ПДК сероуглерода 178
7.4. Обоснование биологических ПДК группы неорганических фторидов 182
7.4.1. Биомаркеры экспозиции неорганических фторидов 183
7.4.2 Обоснование биологических ПДК неорганических фторидов 185
7.5. Обоснование биологической ПДК оксида углерода 188
7.5.1 Токсикокинетика и токсикодинамика СО в организме 189
7.5.2. Биомаркеры экспозиции СО 189
7.5.3. Обоснование биологической ПДК оксида углерода 192
Глава 8. Обсуждение результатов 197
8.1. Критерии отбора биомаркеров для оценки риска воздействия промышленных веществ 200
8.2. Метаболические биомаркеры при обосновании гигиенических нормативов промышленных веществ 202
8.3. Патогенетические биомаркеры в системе оценки риска промышленных веществ 208
8.4. Биомаркеры специфического и общетоксического эффектов в системе оценки риска промышленных веществ 213
8.5. Биомаркеры экспозиции и биомониторинг работающих 216
Выводы 221
Список использованной литературы 223
Приложение 1 263
Приложение 2 268
Приложение 3 270
Приложение 4 271
Приложение 5 273
- Биологический мониторинг экспозиции
- Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия дихромата натрия
- Анализ зависимости степени выраженности неблагоприятных эффектов от уровня превышения гигиенических стандартов веществ общетоксического действия, объединенных по классу опасности
- Биомаркеры экспозиции и биомониторинг работающих
Введение к работе
Актуальность проблемы В последнее десятилетие в медицине труда успешно разработана концепция оценки профессионального риска. Учитывая перспективность применения в РФ методологии оценки риска, подчеркивается необходимость ее дальнейшей научной проработки, развития и приведения в соответствие с требованиями, принятыми в нашей стране [Г.Г. Онищенко, 1997; Н.Ф.Измеров, 1993; Н.Н.Молодкина, 1996; А.И.Халепо, 2001]. Усовершенствование научно-методических подходов в системе гигиенического нормирования и оценки потенциальной и реальной опасности воздействия химических веществ на здоровье работающих признается в документах МЗСР РФ одним из актуальных направлений для медицины труда [Г.Г.Онищенко, 2002]. При этом гигиенической стандартизации отдается первостепенная роль в профилактике профессиональной заболеваемости. Гигиенические нормативы, установленные с учетом пороговости токсического действия химических веществ, признания приоритета медицинских и биологических показателей, результатов клинико-гигиенических исследований - являются общепризнанными критериями оценки безопасности на химическом производстве. Риск здоровью считается неприемлемым в условиях несоблюдения безопасных уровней воздействия (ПДК, ОБУВ, ПДУ) химических веществ [Н.Ф. Измеров, 1997; И.В.Саноцкйй, 1994; С.М.Новиков, 1996 и др.].
Точность определения величины порога действия промышленного яда в значительной степени зависит от выбора адекватных биомаркеров. Согласно определению ВОЗ «Биомаркер - практически любой измеряемый показатель, отражающий взаимодействие между биологической системой и фактором окружающей среды (химический, физический или биологический). Этот показатель может быть функциональным, физиологическим или биохимическим и отражает взаимодействие на клеточном или молекулярном уровне [WHO, 1993].
Биологические маркеры издавна используют в экспериментальных и клинических исследованиях для изучения характера острого и хронического ток-
4
сического действия соединений, обнаружения признаков нарушения
здоровья и биологического мониторинга потенциально опасных экспозиций. Вопрос об их применении для оценки риска стал рассматриваться сравнительно недавно. Число публикаций на эту тему в мировой литературе неуклонно растет, появились журналы "Biomarkers", "Biomarkers & Prevention" и др., которые рассматривают использование биомаркеров для оценки риска.
В РФ система обоснования гигиенических нормативов вредных веществ как в воздухе рабочей зоны, так и в других средах построены на принципе изменения биомаркеров эффекта в зависимости от величины действующей концентрации (дозы) и продолжительности воздействия вещества. Созданы специальные комплексы биомаркеров для оценки нейротропного, гепатотропного, раздражающего, кардиотропного, сенсибилизирующего и др. эффектов. Однако общие принципы выбора и исследования биомаркеров эффекта при оценке риска промышленных веществ не сформулированы в должной степени, не оценена роль специфических и интегральных биомаркеров различных эффектов действия веществ в системе гигиенического нормирования.
Несмотря на обширность накопленного материала, работы по выявлению корреляций между биохимическими и физиологическими параметрами, характеризующими работу отдельных органов или систем, практически не проводились. Однако такие исследования могут не только прояснить механизм действия яда, но и обосновать применение новых, универсальных биомаркеров эффекта, которые можно будет использовать при исследовании большинства промышленных ядов.
Значимость биохимических исследований в профилактической токсикологии несомненна [ЛАТиунов, 1994; JATimbreU, 2000, 2004; AMutti, 1996]. Однако в РФ при установлении гигиенических нормативов крайне редко используются показатели, отражающие процессы детоксикации чужеродных веществ, которые включают энзиматическую трансформацию в системе цито-
хром-зависимых монооксигеназ, реакции конъюгации, антиоксидантной защиты и обеспечивающие их биоэнергетические процессы.
5
С 80-90-х г. г. прошлого века стремительно растет число научных
публикаций о биомаркерах экспозиции для новых и уже используемых в промышленности веществ. Регулярно публикуемый журналом «Analytical Chemistry» обновляемый и дополняемый список биомаркеров экспозиции насчитывает уже более 400 наименований. Такой подход обусловлен в первую очередь необходимостью более точно оценивать величину экспозиции для определения реального риска при контакте с тем или иным промышленным веществом для каждого работающего, возможности выделения лиц с повышенным индивидуальным риском, ранними признаками интоксикации при биологическом мониторинге [AAitio, 1999].
К сожалению, в РФ в силу ряда причин не уделяется должного внимания указанной проблеме, несмотря на то, что для некоторых промышленных веществ были разработаны и рекомендованы биологические ПДК (биоПДК).
Учитывая значительные методические трудности и высокую стоимость выполнения подобных исследований, целесообразно для обоснования биоПДК актуальных для России веществ использовать зарубежный опыт.
В последние годы активно проводится разработка методов оценки риска различных видов токсических эффектов альтернативными методами. На наш взгляд, в настоящее время необходимо сформулировать требования к выбору биомаркеров эффекта для используемых в токсикологических исследованиях методов in vitro, определить перспективные способы тестирования веществ на стадии предварительной оценки токсичности и характера вредного действия на организм.
Цель работы: Научное обоснование принципов и методов использования биомаркеров эффекта и экспозиции в системе оценки риска и гигиенического нормирования промышленных веществ.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. На основе анализа данных литературы и результатов собственных исследований обосновать критерии выбора биомаркеров экспозиции и эффекта
для гигиенического нормирования и оценки риска
воздействия промышленных ядов.
Провести поиск и обосновать новые критериально значимые метаболические биомаркеры по данным экспериментальных исследований при воздействии промышленных веществ из различных классов химических соединений.
Проанализировать и систематизировать отечественный и зарубежный опыт по обоснованию биологических стандартов по биомаркерам экзогенного воздействия химического фактора, определить зависимость между уровнем биомаркеров экспозиции в биологических средах и концентрацией широко используемых в промышленности неорганических фторидов, сероуглерода и окиси углерода в воздухе рабочей зоны, обосновать для них величины биологических ПДК
Исследовать соотношение биомаркеров эффекта на органном, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях при воздействии промышленных ядов и обосновать новые перспективные биомаркеры эффекта.
Определить роль биомаркеров избирательного и общетоксического эффекта при исследовании риска воздействия промышленных ядов в условиях превышения ПДК.
На основе анализа современных альтернативных методов разработать и апробировать методические подходы использования методов in vitro для оценки риска местного раздражающего действия промышленных ядов.
Научная новизна и теоретическая значимость работы На основании материалов собственных токсикологических исследований различных классов химических соединений (органические растворители, изо-цианаты, пиретроиды, производные морфолина, эфиры фенола и др.) и анализа данных литературы установлено, что биомаркеры эффекта, используемые для оценки риска воздействия промышленных веществ, должны обладать критерием вредности.
Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомальной
фракции печени белых крыс при краткосрочном воздействии веществ является гигиенически значимым биомаркером эффекта, который использован для прогнозирования нормативов промышленных веществ, метаболизм которых осуществляется с участием монооксигеназной системы.
Характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации является новым видом биомаркеров эффекта. Регистрация указанных биомаркеров, требующая минимальных материальных затрат, позволяет получить достоверную информацию о порогах вредного действия веществ, патогенезе и эффективности экспериментальной терапии отравлений.
На примере исследования раздражающих ядов показано, что использование биомаркеров специфического эффекта повышает обоснованность прогноза нарушения состояния здоровья работающих при превышении гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны по сравнению с биомаркерами общетоксического эффекта.
Создана классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих ядов и веществ общетоксического действия в зависимости от кратности превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, которая отражает связь между величиной действующей концентрации химических соединений и выраженностью симптомов интоксикации (биомаркеров эффекта).
На основании анализа данных о содержании вещества в воздухе производственных помещений, состояния здоровья работающих и уровне биомаркера экспозиции обоснованы биологические ПДК широко используемых в России сероуглерода, окиси углерода и группы неорганических фторидов.
Практическая значимость работы и внедрения в практику
Результаты исследований реализованы при разработке следующих документов:
Методические рекомендации «Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ» MP № 5205-90.
Методические указания «Постановка исследований по
выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюнктиву глаза с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона» МУ 2.2.756-99.
Новая редакция Руководства Р.2.2.755-99 «Гигиенические критерии оценки и классификация условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса» (находится на утверждении в МЗ и СЗ РФ).
По материалам диссертации установлены и утверждены в законодательном порядке ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны для 30 веществ (включены в ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.1314-03), ОБУВ в атмосферном воздухе населенных мест для 16 веществ (включены в ГН 2.1.6.1339-03), рекомендованы биологические ПДК для сероуглерода, оксида углерода и группы неорганических фторидов.
Создан банк данных, содержащий параметры токсикометрии и гигиенические нормативы более 600 промышленных веществ.
Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре медицины труда МПФ последипломного профессионального образования ММА им.И.М.Сеченова.
Положения, выносимые на защиту
Разработанные биомаркеры эффекта (содержание цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени и характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации) обладают критерием вредности и могут быть использованы для оценки риска и обоснования гигиенических нормативов промышленных веществ.
Классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих веществ и веществ общетоксического действия в зависимости от превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны.
9
Для повышения точности и надежности оценки риска
воздействия вредных веществ используемые в России методы контроля производственной среды и состояния здоровья работающих должны быть дополнены биологическим мониторингом, разработанным на основе биомаркеров экспозиции.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ МТ РАМН (2001,2004), Секциях Проблемной комиссии «Научные основы медицины труда» (1991, 2004), представлены на симпозиумах, конференциях, международных совещаниях: Finnish-Russian Symposiums on Occupational Health (Lappeenranta, 1991, 1996), конференции НИИ МТ РАМН «Актуальные проблемы медицины труда и промышленной экологии (1994), SETAC 18th annual meeting «Bridging the Global Environment: Technology, Communication, and Education» (1997), Joint Conference of Scandinavian Society of Cell Toxicology & Estonian Society ofToxicology (1998), VIIIlh International Congress ofToxicology "Chemical safety for the 21st Century" (1998), Всероссийских съездах токсикологов (1998, 2003), Международной конференции "Медицина труда в 3-м тысячелетии" (1998), North-Atlantic Treaty Organization Advanced Study Institute (1999), 2nd Croatian Congress ofToxicology CRO-TOX (2000), International Conference "Molecular Epidemiology in Preventive Medicine: Achievements and New Challenges" (2002), 5th International Congress of Turkish Society ofToxicology" (2003), Международном Конгрессе «Профессия и здоровье» (2004).
Личный вклад автора. Материалы, использованные в диссертации, получены в результате исследований, в которых автор являлась ответственным исполнителем НИР № 022 00 400693 (2003), № 022 00 100875 (2000), либо разделов НИР: № 019 10 046236 (1995), № 029 10 022457 (1990).
Во всех исследованиях, включенных в диссертацию, автором выполнены следующие виды работ: обоснование актуальности, научной и практической значимости, определение цели и задач исследования; организация и координа-
10
ция исследований, непосредственное участие в
экспериментальных работах по сбору первичного материала и формированию исходных баз данных; выбор научно-методических подходов, освоение, апробация и применение необходимых методов исследований; обоснование и формулировка исходных научных гипотез и их анализ на основе результатов исследований; обобщение результатов исследований, формулировка выводов, теоретических положений и концепций; разработка рекомендаций, написание научных отчетов. В составе авторского коллектива принимала участие в разработке двух методических документов (анализ материалов и написание разделов) и руководства.
По теме диссертации опубликовано 44 научные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, списка использованной литературы, включающей 365 источников отечественных и зарубежных авторов, 4 приложений. Работа изложена на 296 стр. машинописного текста, иллюстрирована 45 таблицами и 40 рисунками.
Биологический мониторинг экспозиции
Биологический мониторинг экспозиции промышленными химическими веществами оценивает риск здоровью путем определения биологическими методами поглощенной организмом дозы вещества. Как видно из рисунка 1.1., абсорбированное из окружающей среды химическое соединение с кровью распространяется по организму и, в зависимости от структуры вещества, частично может выводиться в неизменном виде с выдыхаемым воздухом или через почки. Органические чужеродные соединения обычно подвергаются биотрансформации, при этом повышается водорастворимость их производных, что способствует выведению таких метаболитов с мочой или желчью (в виде парных соединений).
Исходные химические вещества или их метаболиты могут обратимо или необратимо связываться с белковыми молекулами. Связывание с функционально незначимыми участками молекул может вызывать невредные эффекты разной степени обратимости. При достижении определенного количества связей с «критическими» участками можно ожидать развития вредных эффектов, особенно при недостаточности или неадекватности механизмов защиты. Это ведет к появлению доклинических признаков на ранних стадиях интоксикации, а затем и клинической симптоматики в условиях продолжения воздействия химического вещества. Необходимо заметить, что для некоторых соединений системный, угрожающий жизни, вредный эффект зависит не от связывания вещества и его метаболитов с критическими участками белковых молекул, а, например, от нарушения механизмов гомеостаза (кислотно-щелочное равновесие при воздействии метанола) [294], либо гипоксии (при воздействии фреонов).
На практике все три вида мониторинга, как правило, применяются одновременно. Известно, что большая часть химических соединений способны вызывать, как местный, так и системный эффекты. Так, для предупреждения острого раздражающего эффекта достаточно соблюдать ПДК в воздухе и выполнять правила техники безопасности. Более того, биологический мониторинг практически не способен выявлять пиковые концентрации вредных веществ. С другой стороны, соблюдение гигиенических стандартов содержания химических веществ в воздухе и определение поглощенной (внутренней) дозы на уровне установленных биологических лимитов может быть недостаточным для сохранения здоровья у индивидуумов с повышенной чувствительностью к конкретному веществу. Кроме того, разработка критериев вредности для биологических эффектов остается краеугольным камнем в токсикологии и продолжает развиваться параллельно с выяснением тонких механизмов действия веществ и появлением новых методических приемов оценки токсичности [165, 110, 341, 132].
Биологический мониторинг экспозиции направлен на оценку внутренней дозы. В зависимости от химического вещества и анализируемых биологических параметров под термином внутренняя доза (поглощенная доза) в литературе подразумеваются разные понятия [357, 169]:
А. Внутренней дозой считается количество вещества, абсорбированного за относительно короткое время:
1) за несколько часов перед определением (концентрация растворителя в выдыхаемом воздухе или в крови, измеряемая во время рабочей смены);
2) за всю рабочую смену (концентрация растворителя в выдыхаемом воздухе или в крови, измеряемая сразу, либо через 16 часов после окончания рабочей смены);
3) за последний месяц, если величина периода полувыведения вещества колеблется в пределах одного месяца (концентрация некоторых металлов в моче или в крови).
Б. Для высококумулятивных веществ внутренней дозой называется количество вещества, содержащегося в организме в целом или в отдельных его тканях. Например, концентрация полихлорироваиных бифенилов (ПХБ) в крови отражает их количество в жировой ткани - депо для ПХБ. Уровень кадмия в моче, как правило, отражает его кумуляцию в почках (в условиях относительной сохранности функции почек).
Следовательно, в зависимости от длительности периода полувыведения чужеродного вещества из организма, под внутренней дозой понимается абсорбированная, либо накопленная (кумулированная) доза.
На наш взгляд, разница между биомаркерами, относящимися к п.п. А2) и A3) более существенна, чем между биомаркерами п. A3) и п. Б. Действительно, процессы абсорбции, кумуляции и элиминации являются основными звеньями токсикокинетикп чужеродного вещества в организме и провести четкие временные границы между ними, если период полувыведения вещества приближается к 1 месяцу, невозможно. Тем не менее, мы полагаем, что определение вещества в крови или в моче при постоянном/периодическом (характерном для производственного воздействия) поступлении яда в организм, характеризует в большей степени накопленную дозу.
В. Наконец, в идеале тест биологического мониторинга экспозиции должен отражать количество вещества, связанного с критическими участками белковых молекул в организме. К сожалению, развитие таких методов ограничивается знанием механизма действия вещества и «доступностью» связанных молекул (напр., определение карбоксигемоглобина в крови при воздействии оксида углерода). Схожесть процессов связывания вещества с белками крови и с белками других тканей, мало доступных для изучения, привела к развитию методов определения аддуктов гемоглобина в качестве суррогата для оценки биологической эффективной дозы вещества. Однако, подавляющая часть таких тестов до сих пор не получила достаточного обоснования и используется практически как показатель абсорбированной дозы [359].
Исследование параметров биотрансформации после однократного воздействия дихромата натрия
Метаболизм шестивалентных соединений хрома в организме, в частности - в печени, изучен недостаточно. По данным [238] однократное введение 1/6, 1/3 ДЬ5о хромата натрия не оказывает эффекта на микросомальную систему, хотя в опытах in vitro выявлена способность ингибировать активность анилингидроксилазы. Об угнетении активности N-деметилирования аминопирина и О-деметилирования п-нитроанизола у крыс при введении 60 мг/кг (DL5o для крыс колеблется в пределах 50 100 мг/кг при введении в желудок [33] ионизированного шестивалентного хрома свидетельствуют данные других авторов [301]. Длительное введение хрома в дозе 0,05 г/кг (сублетальная доза) крысам приводило к 6-кратному усилению перекисного окисления липидов по накоплению малонового диальдегида [160]; активность пероксидазы в крови увеличивалась [328]. Описывается два возможных механизма ингибирования соединениями хрома системы Цх Р-450. Воздействие хроматов и бихроматов приводит к индукции процессов ПОЛ, что в свою очередь может приводить к снижению Цх Р-450 [160, 229]. Кроме того, имеются сведения об усилении процессов распада Цх Р-450 за счет индукции неорганическими соединениями хрома и солями других тяжелых металлов фермента гемоксигеназы [55, 229, 328].
Анализ литературных данных показывает, что Limac для дихромата натрия по различным биомаркерам следующие: 5 мг/мЗ (снижение клиренса мочевины и креатинина), 1,89 мг/мЗ (повышение коэффициента массы печени), 0,5 мг/мЗ (повышение содержания мочевины в сыворотке, выходящее за пределы Х±2о), а также 0,35 мг/мЗ (изменение ЭКГ с нагрузкой) [66, 114].
Влияние шестивалентного хрома на ПГС и Цх Р-450 у крыс оценивали после однократного 4-часового ингаляционного воздействия водного аэрозоля дихромата натрия в концентрациях: 1,89; 0,35; и 0,12 мг/м3 . На время затравки подопытных и контрольных животных помещали в индивидуальные домики. Учитывая длительный период полувыведения хрома из организма (при подкожном введении за 7 дней с мочой выводится 36%, с калом - 13,8% [368], в проведенном эксперименте исследовали состояние микросомальных оксигеназ в динамике до 14 дня, т.е. - сразу, на 2, 8 и 14 дни.
Полученные данные представлены на рисунке 3.4. Сразу после воздействия на всех исследуемых уровнях было обнаружено приблизительно одинаковое снижение ПГС на 33-28%. Содержание Цх Р-450 снижалось на уровне 0,35 мг/м в 1 день (на 28%) и на уровне 1,89 мг/м (на 19%) на 2 день.
Влияния Na2Cr207 на ПГС и Цх Р-450 в другие сроки (до 14 дня) не было обнаружено.
Следует обратить внимание на более высокие показатели средней величины ПГС в контрольной группе в первый день по сравнению со вторым и остальными днями обследования. Накопленный в лаборатории опыт показывает, что 4-час. пребывание в индивидуальных домиках не является безразличным для лабораторных животных. Как правило, после затравки животные внешне вялые, несколько заторможенные, биохимические показатели в контрольной группе на первый день могут отличаться от параметров, полученных у контрольных животных на следующий день после такого вида затравки. Следует подчеркнуть, что средние величины по уровню цитохрома Р-450 в контрольных группах также отличались (1 день 0,86±0,04; 2 день 1,11±0,04 нмоль/мг микросомального белка). Следовательно, в контрольных группах соблюдалась прямо пропорциональная зависимость между количеством и уровнем активности фермента. Принимая это во внимание, полагаем, что ценность полученных нами результатов повышается, если при стандартном ответе контрольной группы (низкий уровень фермента - низкая его активность - повышение вещества достоверно отличался от контрольного (снижение уровня фермента - уменьшение ПГС, т.е. - активация фермента). Из этого следует, что дихромат натрия вызывает индукцию одних изоформ цитохрома Р-450 в микросомальной системе и ингибирование других. Ранее такой феномен был известен лишь для других соединений. Более того, факты несоответствия эффекта на разные изоформы Цх Р-450 при воздействии одного и того же вещества встречаются в литературе нечасто, что, вероятно, связано и с методическими трудностями. Так, известна различная способность гербицидов — производных мочевины при 3-кратном введении повышать субстратную активность Цх Р-450 максимально в 18 раз, при этом активность метаболизма по некоторым другим субстратам не изменяется [322]. Подкожное введение трнхлорэтилена крысам в дозе 1,0 мл/кг в течение пяти дней приводило к одновременной индукции и ингибированию активности Цх Р-450 в зависимости от субстрата [246]. Заметим, что оба приведенных случая имели место в отличие от данных нашего эксперимента после 3-5 кратного введения промышленных ядов.
Вызывает интерес отсутствие зависимости «доза - эффект на ПГС» при исследовании уровней дихромата натрия, различающихся почти в 20 раз (0,12 - 1,89 мг/м). Можно лишь предположить вероятное влияние опосредованного, а не прямого влияния изучаемого яда на микросомальную систему, что могло вызвать компенсаторную активацию работы некоторых изоформ Цх Р-450 при ингибировании других.
Поскольку в эксперименте не была достигнута недействующая на ПГС концентрация дихромата натрия, то порогом, видимо, может являться концентрация, равная или меньше 0,12 мг/м . Limac дихромата натрия по снижению содержания Цх Р-450 в микросомальной фракции печени находится на уровне 0,35 мг/м .
Анализ зависимости степени выраженности неблагоприятных эффектов от уровня превышения гигиенических стандартов веществ общетоксического действия, объединенных по классу опасности
По-видимому, оптимальным на сегодняшний день подходом, является объединение веществ по классу опасности, поскольку этот показатель не только отражает опасность и параметры токсичности соединения, но утверждается в законодательном порядке и сопровождает величину гигиенического регламента в официальных документах (ГН).
Результаты статистической обработки рядов параметров токсикометрии представлены в таблице 5.6. Для всех классов химических соединений можно отметить частичное перекрывание рядов кратности превышения ПДК параметрами токсикометрии.
Выявлена общая закономерность снижения кратности средних величин всех параметров токсикометрии (CL5o , Lim ас и Lim сь ) от 1 к 4-му классу опасности, что закономерно и объясняется снижением коэффициентов запаса при относительном уменьшении токсичности веществ. В то же время отмечается близость величин кратности порогов острого и хронического действия к ПДК в группах веществ общетоксического действия 3 и 4 классов опасности. При анализе рядов с большим размахом крайних значений отдается предпочтение использованию средних геометрических перед средними арифметическими.
Исходя из приведенных данных, при воздействии веществ 1, 2 и 3-4 классов опасности вероятность острой интоксикации приближается к 100% при превышении их ПДК соответственно в 90, 60 и 35-40 раз; вероятность хронической интоксикации чрезвычайно высока на уровне 9 ПДК для 1-го класса, и 6 ПДК и выше для остальных классов.
Нами был проведен анализ распределения параметров токсикометрии веществ общетоксического действия по классам условий труда Руководства Р.2.2.755-99 в зависимости от степени превышения их ПДК, основываясь на приведенных выше средних величинах соотношений параметров токсикометрии (табл. 5.7 и 5.8). Как и в случае с раздражающими веществами, в целом отмечается картина несоответствия клинического описания подкласса условий труда тому токсическому эффекту, который был установлен в экспериментальных исследованиях.
Как видно из представленных данных, при существующих границах кратности превышения ПДК (до 3, 6, 10, 20 и более 20 ПДК) для веществ 1-2 классов опасности в каждый подкласс (3.1. - 3.4) 3 вредного класса попадает от 14 до 32% всех веществ на уровне порога хронического действия. Попадание 1/5 всех веществ 1-2 класса опасности при воздействии на уровне Lim ch («минимальные признаки хронической интоксикации») в подкласс 3.4 («тяжелые формы профзаболеваний, потеря общей трудоспособности») приводит к неоправданному завышению риска для этих соединений. Анализ распределения параметров токсикометрии для веществ 1 и 2 класса отдельно не отличается от описанного выше.
В группах веществ 3 и 4 классов опасности картина распределения схожа между собой, но отличается от распределения веществ 1-2 классов. В данном случае особенно настораживает такое превышение ПДК, которое может вызывать острые интоксикации и смертельные отравления. Поскольку границы подклассов условий труда ограничиваются подклассом 3.3 («профзаболевания легкой и средней степени тяжести в периоде трудовой деятельности») - «более 10 ПДК», то именно в этот подкласс без последующей дифференцировки попадают все 100% веществ 3-4 класса опасности при превышении ПДК более, чем в 10 раз, т.е. при достижении ими уровней Limac («минимальная токсическая концентрация при однократной ингаляции»), а также дальнейшем повышении концентраций вплоть до смертельных, включая средние смертельные концентрации (CL50). Такая ситуация означает резкое опасное и неоправданное занижение вероятности возникновения острых отравлений на производстве при оценке потенциального риска.
Таким образом, величина степени превышения ПДК для веществ общетоксического действия, согласно установленным для них классам условий труда (по Р.2.2.775-99), не соответствует клиническому описанию нарушения здоровья работающих в 3 (вредном) и 4 (опасном) классах условий труда.
Биомаркеры экспозиции и биомониторинг работающих
Упомянутые выше международные документы по риску предусматривают максимально полный учет суммарной экспозиции веществом из разных источников (воздух, вода, пища и т.д.).
При определении приемлемой дозы (ПД) вычисляют и ориентировочные величины содержаний вещества в различных объектах окружающей среды, сумма которых равна ПД.
Одновременное поступление вещества в организм на уровне ориентировочных величин не должно создавать риска для здоровья человека.
Однако мониторинг экспозиции химическими веществами имеет недостатки, основным из которых является недостаточная точность.
Применительно к практике медицины труда это обусловлено тем обстоятельством, что при основном пути поступления вредных веществ -ингаляционном регистрируется, даже в лучшем случае (при индивидуальной дозиметрии), лишь концентрация вещества во вдыхаемом воздухе, а количество вещества, поступившее в организм, не может быть оценено.
В настоящее время единственным методом, позволяющим измерять количество ксенобиотика в организме, является биологический мониторинг, основанный на регистрации биомаркеров экспозиции.
Биомониторинг на производстве позволяет наиболее точно оценить интегральную дозу вещества, попавшую в организм разными путями, выявлять отдельных лиц или группы работающих, подвергающихся повышенному риску воздействия веществ и нуждающихся в принятии необходимых мер по предупреждению нарушения здоровья. Кроме того, определение биомаркера экспозиции играет важную роль в диагностике и возможной предрасположенности к той или иной профессиональной патологии.
Биомаркеры экспозиции являются основой для разработки биологических гигиенических нормативов, которые широко используются в промышленных развитых странах для мониторинга риска профессионального воздействия вредных химических веществ.
Установление биоПДК в первую очередь целесообразно для веществ, обладающих высокой кумулятивной активностью и кожной резорбцией, а также присутствующих в воздухе рабочей зоны в виде аэрозоля (зависимость поступившей в организм дозы от дисперсности). Кроме того, необходимо учитывать количество работающих, контактирующих с веществом на производстве, статистику острых и хронических интоксикаций.
При выборе веществ для разработки и установления биоПДК следует учитывать также особенности условий их воздействия:
- работа в среде с резко колеблющимися концентрациями вещества в воздухе, особенно при наличии кратковременных пиков, с трудом поддающихся точному измерению;
- работа в условиях, способствующих загрязнению значительной поверхности кожи веществами, способными к проникновению через нее;
- работа в ограниченных пространствах, вынужденной позе и других условиях, затрудняющих непосредственное измерение концентрации в зоне дыхания рабочего;
- работа в респираторах или фильтрующих противогазах;
- наличие внепроизводственной (в т.ч. ингаляционной) экспозиции, когда значительный контингент работающих проживает в зоне существенного загрязнения объектов окружающей среды (атмосферный воздух, вода, почва, пищевые продукты) тем же химическим агентом, а также в соответствующих геохимических провинциях [13].
Для веществ, являющихся естественными метаболитами организма необходимо установить границы нормы (пределы нормальных колебаний) для лиц, не подвергавшихся профессиональному воздействию данного вещества с учетом географического региона, условий питания, возраста, времени года и других факторов, которые могут оказать влияние на этот показатель. Установленные величины биологических ПДК не должны превышаться при поступлении вредных веществ в организм одним или несколькими путями (при вдыхании, через кожу, через рот) [13].
Как отмечалось выше, в нашей стране также проведены исследования по обоснованию биоПДК ряда актуальных веществ по данным оценки условий труда, состояния здоровья работающих и содержания биомаркеров экспозиции в организме. На основе полученных результатов разработаны методические рекомендации «Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ» (№ 5205-90) и обоснованы биоПДК для бензола, стирола, толуола, хлорбензола и свинца.
Методические рекомендации определяли выбор веществ, разработку биомаркеров экспозиции и обоснования биоПДК, описывали методические подходы к обоснованию биоПДК, а также требования к проведению биомониторинга.
Анализируя указанный документ следует признать, что в целом он соответствует современным научным и методическим подходам.
Так, при обосновании биоПДК толуола, проведенной сотрудниками НИИ медицины труда РАМН при нашем участии, выполнялись измерения биомаркеров экспозиции (гиппуровой кислоты и о-крезола) в моче печатников в конце рабочей смены, регистрировались концентрации толуола в зоне дыхания рабочих. Учитывались содержания биомаркеров в моче лиц, не имевших контакта с толуолом. Установлена зависимость между содержанием гиппуровой кислоты в моче и экспозицией толуола, что позволило рекомендовать в качестве биоПДК указанного вещества уровень гиппуровой кислоты 1,08 г/ г креатинина (измерение в моче в конце смены).
Ряд положений методических рекомендаций безусловно нуждается в уточнении. Это касается, в частности, и разработки биомаркеров экспозиции, формулирования требований к отбору и анализу биоматериала.
Опыт обоснования биоПДК сероуглерода, окиси углерода и неорганических фторидов путем привлечения данных литературы и математического моделирования также следует отразить в методическом документе.
Это позволит избежать значительных материальных затрат и сохранить время. Подобные разработки могут быть сделаны и для некоторых других веществ, что могло бы существенно расширить список рекомендованных биоПДК вредных промышленных веществ в России.
Однако, следует учитывать, что при значительных различиях величин гигиенических нормативов в воздухе рабочих помещений (а в России ПДК, как правило, ниже гигиенических стандартов в западных странах) может потребоваться иной биомаркер экспозиции и метод его измерения в биосредах.
На последнем вопросе следует остановиться особенно. На наш взгляд, именно недостаточная методическая оснащенность санитарно-эпидемиологической службы СССР на момент разработки методических рекомендаций и величин биоПДК для ряда актуальных промышленных веществ не позволила принять решение о внедрении биоПДК в практику.
В настоящее время положение меняется. Возрос уровень оснащения современной аналитической аппаратурой, разрабатываются методические документы по измерению содержания вредных веществ в биологических материалах [90]. И, наконец, принято принципиальное решение о внедрении концепции риска воздействия вредных веществ окружающей среды на здоровье человека. Следует учитывать и перспективы гармонизации гигиенических норм и правил при вступлении России в ВТО и другие международные организации [101].
Таким образом, сложились необходимые условия для принятия решения об использовании биомониторинга в дополнение к существующим способам контроля условий труда и состояния здоровья работающих.
В заключение следует отметить, что в настоящее время основное преимущество биомаркеров экспозиции - точное определение количества вещества, которое поступило в организм человека, - наиболее полно реализовано при биомониторинге. Перспективно применение биомаркеров экспозиции при решении и других проблем, связанных с оценкой риска воздействия веществ, например, выделении индивидуумов или групп повышенного риска.
Реализация концепции единого гигиенического нормирования [37, 151], позволяющего регламентировать количество вещества, поступающего в организм через органы дыхания, пищеварительный тракт и кожу, может быть успешно решена с помощью биомаркеров экспозиции.
