Введение к работе
Актуальность. Химиотерапия является одним из перспективных направлений в онкологии, значение которой с каждым годом возрастает. Решающую роль в эффективности противоопухолевого действия химиопрепарата играет его доза. Однако, увеличение дозы в большинстве случаев приводит к развитию побочных реакций, обусловленных токсическим повреждением нормальных органов и тканей (Ганцев Ш.Х., 2004). Побочное действие цитостатиков – «ахиллесова пята» химиотерапии опухолевых заболеваний. По данным некоторых авторов, почти в 25% случаев лечение цитостатиками приходится прекращать из-за развития выраженных побочных эффектов (Блохин Н.Н., 1998; Корман Д.В., 2006). В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, прежде всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов химиотерапевтических препаратов (Гершанович М.Л., 2004).
Основной причиной развития токсических эффектов противоопухолевой терапии является общность мишеней цитостатической терапии в опухоли и в нормальных органах и тканях (, 1998; Жуков Н.В., Тюляндин С.А., 2008). Развивающаяся при применении цитостатиков токсичность является фактически продолжением их терапевтической активности и характеризует их низкий терапевтический индекс. В этой связи, побочное действие цитостатиков подобно токсическому поражению, реализация которого происходит через различные механизмы повреждения клетки (Grant R.L., et al., 1997). К этим механизмам относятся повреждения генетического аппарата клетки; активация процессов свободнорадикального окисления; повреждения клеточных мембран; нарушения процессов синтеза белка и клеточного деления; повреждающее действие избытка ионов Ca2+ в клетке; нарушения энергетического обмена (Барабой В.А. и др., 1998; Глушков С.И., 2006).
Тем не менее, патогенез побочного действия противоопухолевых препаратов, несмотря на кажущуюся полноту, изучен фрагментарно. Успехи последних десятилетий, достигнутые в изучении патогенеза опухолевых заболеваний и их лечения, открыли новые грани токсичности, обусловленные дизрегуляторными изменениями в клетке, а не прямым поражением цитостатиком биологически значимых структур. В частности, дизрегуляторные расстройства связаны с нарушением регуляции тиол-дисульфидного статуса, потерей чувствительности рецепторов к специфичным лигандам, развитием общей и метаболической иммунодепрессии (Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004).
Важнейшим условием нормальной жизнедеятельности клеток является поддержание определенного редокс-состояния в цитоплазме, поскольку оно играет существенную роль в таких процессах, как синтез ДНК, экспрессия генов, ферментативная активность и др. (, 2000; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005). Изменения редокс-состояния внутриклеточного содержимого и отдельных молекул, являющиеся следствием стрессовых воздействий или результатом активности самих клеток, вовлечены в регуляцию многих клеточных процессов, в том числе и устойчивости к токсичности. Физиологически неадекватная редокс-регуляция способна инициировать комплекс изменений аналогичных прямому действию токсиканта на различные клеточные структуры.
Экспериментально и клинически доказано, что в токсическом действии противоопухолевых средств одна из ведущих ролей принадлежит повышенной наработке АФК и реакциям СРО, приводящим к оксидативной модификации нуклеиновых кислот, белков и липидов (Стручков В. А., 1980; Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И., 1984; Альберт А., 1989; Минаева Л.В., 2007). Регуляцию изменяющейся при этом в окислительную сторону внутриклеточной среды осуществляют различные редокс-буферы, важнейшим из которых является система глутатиона, участвующая в утилизации АФК и перекисных соединений (Кулинский В.И., 1990; Mannervik B., 1989; Meister A., 1983). Таким образом, внутриклеточный уровень восстановленного глутатиона и ферментов его обмена являются маркерами активности процессов СРО и, следовательно, устойчивости клетки к токсическим повреждениям. В целостном организме количество опухолевых клеток не превышает 1% (Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004). Их вклад в системные показатели редокс-обмена невелик. Поэтому системные показатели отражают состояние редокс-обмена прежде всего в нормальных клетках. Учитывая способность цитостатиков изменять интенсивность СРО в сторону окислительного стресса в нормальных клетках, изменения системных показателей редокс-баланса в крови отражает его состояние именно в нормоцитах.
Редокс-изменения предшествуют морфологическим и структурным нарушениям в нормальных клетках (гепатоцитах, миокардиоцитах, энтероцитах и др.). В этой связи, отклонения системных маркеров редокс-обмена от нормальных значений отражают текущее состояние и направление возможного изменения редокс-обмена. Эритроциты являются частью нормального пула клеток, и закономерности нарушения редокс-баланса в эритроцитах идут параллельно аналогичным изменениям во всех других нормальных клетках. Эритроциты играют ключевую роль в межорганном и межтканевом обмене глутатиона и, выполняя, таким образом, роль интегративной системы, отражают состояние общего редокс-статуса организма, в том числе и состояние редокс-статуса при действии цитостатиков (Колесниченко Л.С. и др., 2007; Kyлинский В.И. и др., 2007). В этой связи, изменения редокс-обмена в эритроцитах отражают в той или иной степени его изменения в других клетках. Однако диагностические возможности определения показателей системы глутатиона в эритроцитах для оценки побочного действия противоопухолевых препаратов практически не изучены.
В развитии системы диагностики токсических поражений основной упор делается на маркеры цитолитического синдрома внутренних органов, определяемых в сыворотке крови. Однако повышение активности креатинкиназы отмечается не только при поражении сердечной мышцы, но и при опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта (Тиц Н., 1997). И хотя среди пациентов кардиологического профиля этот тест имеет чувствительность 97% и специфичность 67% для поражения сердечной мышцы, повышение активности креатинкиназы свидетельствует об остром повреждении и гибели кардиомиоцитов. Цитостатики даже в высоких кумулятивных дозах не вызывают острого повреждения структуры кардиомиоцитов, поэтому уровень сердечного тропонина T и активность креатинкиназы MB не изменяются при развитии токсической кардиомиопатии (Гершанович М.Л., 2004). Трансаминазы распределены во всех тканях тела. Повышение активности аланинаминотрансферазы наблюдается при поражениях печени, а аспартатаминотрансферазы – сердца. Тем не менее, при токсических поражениях печени так же, как и при заболеваниях сердца преобладает повышение активности аспартатаминотрансферазы (Тиц Н., 1997).
Таким образом, изучение показателей обмена глутатиона, играющего важную роль в поддержании нормальной жизнедеятельности клетки и организма в целом и обеспечивающего многоуровневую и эффективную защиту тканей от повреждающего действия противоопухолевых препаратов, представляется актуальным для создания новых подходов ранней диагностики токсического действия средств химиотерапии и возможности их коррекции.
Целью исследования явилось определение возможности использования показателей обмена глутатиона в эритроцитах в качестве лабораторных тестов для прогнозирования и диагностики развития побочных эффектов при токсическом действии средств химиотерапии и эффективности их коррекции средствами фармакотерапии.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи исследования:
- определить особенности изменений показателей обмена глутатиона и перекисного окисления липидов в различных органах и в эритроцитах белых беспородных крыс при однократном и повторном введении циклофосфана (ЦФ) в различных дозах;
- определить особенности изменений показателей обмена глутатиона и перекисного окисления липидов в различных органах и в эритроцитах белых беспородных крыс при однократном и повторном введении доксорубицина (ДР) в различных дозах;
-определить особенности изменений показателей обмена глутатиона и перекисного окисления липидов в различных органах и в эритроцитах белых беспородных крыс с лимфосаркомой Плисса при повторном введении ЦФ;
- исследовать влияние на показатели обмена глутатиона и перекисного окисления липидов в различных органах и в эритроцитах лабораторных животных лекарственных средств различных фармакологических групп (антиоксиданты, антигипоксанты, производные глутатиона и предшественники его синтеза), используемых для защиты клеток от повреждающего действия цитостатиков;
- определить особенности изменений показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в эритроцитах пациентов, получающих средства химиотерапии (включая ЦФ и ДР);
- оценить информативность показателей системы глутатиона в эритроцитах для диагностики тяжести цитотоксического повреждения внутренних органов при применении средств химиотерапии (ЦФ, ДР) и эффективности средств фармакологической коррекции.
Научная новизна. Патогенетически обоснована возможность использования ряда показателей обмена глутатиона и процессов ПОЛ в эритроцитах пациентов, получающих полихимиотерапию, для оценки тяжести побочного действия ДР и ЦФ. Впервые проведена комплексная оценка показателей системы глутатиона и процессов перекисного окисления липидов в тканях печени, почек, сердца, головного мозга и в эритроцитах лабораторных животных (здоровых и с лимфосаркомой Плисса) при однократном и повторном введении ЦФ и ДР в различных дозах. Наряду с определением содержания восстановленного глутатиона, свободных сульфгидрильных групп белков, продуктов перекисного окисления липидов и оценки динамики их сдвигов, исследованы патобиохимические изменения, связанные с нарушением активности ферментов обмена глутатиона. Проведен анализ причин, вызывающих нарушения обмена глутатиона и активацию процессов перекисного окисления липидов в исследуемых тканях и органах. Установлено, что в условиях курсового применения исследуемых цитостатиков динамика изменений ряда показателей системы глутатиона в эритроцитах (концентрация ВГ, СГ, МДА и активность Г-6-ФДГ, ГР, ГП) отражает состояние его обмена в повреждаемых тканях внутренних органов (печень, сердце, почки) и эффективность проводимой цитопротекторной терапии. Для оценки риска развития и тяжести цитотоксического поражения тканей внутренних органов, эффективности применяемых препаратов цитопротекции в клинической практике предложено проведение динамического исследования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов перед каждым новым циклом полихимиотерапии и на 7-е сутки после введения ДР и ЦФ.
Практическое значение работы заключается в том, что полученные в ходе диссертационного исследования данные о динамике изменений показателей системы глутатиона в органах и тканях лабораторных животных и в эритроцитах человека при применении ЦФ и ДР позволяют сформулировать представление о патогенетических механизмах цитотоксического действия исследуемых цитостатиков, связанных с повреждениями указанной биохимической системы. Полученные в ходе экспериментального исследования данные о динамике состояния показателей системы глутатиона и процессов ПОЛ в эритроцитах могут быть использованы в качестве лабораторных тестов оценки тяжести поражения и прогноза исхода интоксикации. Выявленное патогенетическое значение нарушений системы глутатиона может служить основанием для поиска новых эффективных лекарственных средств, обладающих цитопротекторными свойствами, для профилактики и лечения побочных эффектов применения исследуемых препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
- патогенетическая роль системы глутатиона в реализации цитотоксических эффектов противоопухолевых средств подтверждается экспериментальными данными о нарушениях обмена глутатиона в органах мишенях (ДР – сердечная мышца, ЦФ – печень), их усилении в результате кумуляции цитостатиков и частичной коррекции при использовании цитопротекторных препаратов;
- исследование обмена глутатиона в эритроцитах и органах мишенях позволяет оценить выраженность цитопротекторных эффектов фармакологических препаратов, а поиск новых средств, действие которых связано с нормализацией обмена глутатиона, является современным направлением фармакологической защиты тканей от побочных эффектов кумулятивного действия ЦФ и ДР;
- определение показателей обмена глутатиона в эритроцитах пациентов, получающих полихимиотерапию, является патогенетически обоснованным для их применения в клинической практике при решении вопросов оценки риска развития побочных эффектов действия ДР и ЦФ и их тяжести, а также для скрининговой оценки цитопротекторных свойств препаратов фармакологической коррекции.
Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедрах клинической биохимии и лабораторной диагностики, патологической физиологии, военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии. Диссертационное исследование выполнено в рамках плановых НИР шифр «Циклофосфан», «Цитотоксичность».
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всеармейской научно-практической конференции «Терапевтическая помощь в экстремальных ситуациях» (Санкт-Петербург, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), XXXVI World Congress on Military Medicine (Санкт-Петербург, 2005), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИО обитаемости и профессионального отбора ВМедА (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной, 45-летию ФГУП «НИИГПЭЧ» ФМБА России (Санкт-Петербург, 2007), 3-й Международной научной конференции «Донозология-2007» (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики» (Санкт-Петербург, 2008), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008), Российской и Всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога» (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации. По теме научно-исследовательской работы опубликовано 40 печатных работ, из них в рекомендуемых ВАК изданиях – 7.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 371 странице машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученных результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 33 рисунка и 119 таблиц (46 в тексте и 73 в приложении). Список литературы содержит 261 библиографический источник, из них 99 отечественных и 162 иностранных публикации.
