Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Обзор литературы
Биоматериаловедение - междисциплинарный подход к изучению полимеров 10
Полимеры медико-биологического назначения 12
Тканевая инженерия 15
Принципы и методы тканевой инженерии 15
Основные требования, предъявляемые к полимерам
в тканевой инженерии 17
1.3.3 Синтетические биодеградируемые полимеры 19
1.4. Строение кожи и способы лечения повреждений кожного
покрова 24
Строение кожного покрова 24
Строение коллагена и его свойства 28
Подготовка клеточного продукта для трансплантаций 31
1.4.4 Формирование полимерных матриц для культивирования,
клеток 35
1.5 Взаимодействие клеток с полимерной поверхностью скаффолда....39
1.6 Модификация полимерного субстрата 41
Физические способы модификации 41
Химические способы модификации полимерной поверхности 44
Глава 2. Объекты и методы исследования 48
2.1. Приготовление материалов и реагентов 48
2.1.1 Синтез поли(0,Ь-лактида) 48
Формирование плёнок методом отлива из раствора 48
Получение тонких полимерных плёнок 49
2.1.4 Гидрофобизация покровных стёкол 49
2.1.5 Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ПЛ) и
полиэтиленгликоля (ПЭГ) 50
2.1.6 Получение коллагена 51
2.2. Модификация поверхности полилактидных пленок 52
Нанесение коллагена на полимерный субстрат 52
Аминолиз полилактидных плёнок 53
2.3. Методы исследования поверхности 54
2.3.1 Измерение гидрофильно-гидрофобных характеристик
поверхности полимерной плёнки методом пластинок
Вильгельми 54
Оценка количества растворённого ПЭГ по потере массы...55
Определение концентрации полиэтиленгликоля в водных растворах 56
Определение оксипролина в коллагене 56
Определение концентрации коллагена 57
Выявление структуры коллагена 58
Нингидриновый метод анализа 58
Ядерный магнитный резонанс 58
Сканирующая электронная микроскопия 59
2.4. Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых
субстратах 59
2.4.1 Выделение и культивирование первичных фибробластов.. .59
2.4.2 Выделение и культивирование первичных кератиноцитов...59
2.4.3. Оценка состояния клеток на полимерных плёнках 60
Адгезия фибробластов 61
Анализ структуры актинового цитоскелета 61
Глава 3. Результаты 62
3.1. Синтез поли(Б,Ь-лактида) 62
3.2. Получение полимерных плёнок из полилактида разными
способами 63
Плёнки, полученные методом полива из раствора 63
Полимерные плёнки, полученные на покровном стекле 64
3.3. Влияние условий получения полимерных плёнок на
взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной
плёнки 67
Исследование деградации полилактидных матриц in vitro 76
Исследование деградации полилактидных плёнок in vivo 79
3.6. Модификация полилактидных плёнок 82
3.6.1 Нанесение коллагена на поверхность полилактидных
плёнок 82
3.6.2 Влияние покрытия полимерных пленок коллагеном на
поведение культивируемых кератиноцитов 91
3.7. Формирование пористых плёнок на основе смеси полилактида и
полиэтиленгликоля 104
3.7.1 Исследование скорости растворения ПЭГ 105
3.7.2 Культивирование кератиноцитов на плёнках на основе
смеси ПЛ и ПЭГ 111
3.7.3 Модификация коллагеном пористых плёнок и
культивирование на них кератиноцитов 115
3.8. Модификация полилактидных плёнок раствором лизина 121
Глава 4. Обсуждение результатов 127
Выводы 141
Список сокращений 142
Список литературы 143
Введение к работе
Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей методами заместительной клеточной терапии является перспективным направлением современной регенеративной медицины. В основе этого метода лечения лежит введение в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток, которые замещают утраченные. Для этой цели используют культивируемые клетки, которые выделяют из костного мозга и тканей самого пациента или здоровых доноров.
Актуальность работы. Восстановление целостности повреждённой
ткани требует создания нормального микроокружения для
трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и созданию нормальных структур тканей. В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют, поэтому, при культивировании клеток и при создании клеточных композиций для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе клеток из культуральных сосудов в раны возникают, однако, проблемы сохранения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с недостаточной механической прочностью клеточных ассоциаций и с неизбежным повреждением клеток в результате ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют.
Размножение и рост клеток на полимерных матрицах, обладающих достаточной механической прочностью и имеющих определённую пространственную архитектуру, может способствовать формированию структурной основы дифференцирующихся тканей. Поэтому в последнее время приходят к заключению о том, что при создании клеточных продуктов
и их трансплантации, необходимо использовать полимеры, для обеспечения сохранения исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клеток. В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, в том числе, биосовместимость и способность рассасываться в процессе восстановлении структуры ткани. Таким образом, в настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки - тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы инженерии, химии, физики и клеточной биологии. В основе тканевой инженерии лежит культивирование клеток на искусственных полимерных матрицах.
Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности повреждённых кожных покровов, возникающих в результате ожогов, трофических язв и другого рода повреждений. Культивирование кератиноцитов на полимерных матрицах и последующая трансплантация сформировавшегося клеточного пласта вместе с такой матрицей в организм позволяет исключить процедуру обработки клеток протеолитическими ферментами. Перенесённая в организм биодеградируемая полимерная матрица со временем рассасывается, а клетки способствуют восстановлению кожных покровов.
Целью диссертационной работы является изучение возможности формирования биодеградируемых полимерных плёнок из поли (D,L-лактида), предназначенных для культивирования и трансплантации эпителиальных клеток кожи.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Отработать условия синтеза поли(0,Ь-лактида) как основного полимера для формирования плёнок.
Отработать методику формирования полимерных плёнок различной толщины.
Сформировать полилактидные плёнки с нанесённым на их поверхность коллагеном в разных формах (молекулярной и фибриллярной).
Приготовить плёнки на основе смеси поли(0,Ь-лактида) и полиэтиленгликоля.
Модифицировать полилактидные плёнки для повышения основности и гидрофильности их поверхностей.
Исследовать адгезию и пролиферацию фибробластов и кератиноцитов на модифицированных плёнках.
Исследовать скорость деградации плёнок в условиях культивирования клеток и в организме.
Научная новизна работы. Впервые для формирования многослойного пласта кератиноцитов были использованы плёнки на основе аморфного поли(0,Ь-лактида), прикреплённые к поверхности покровного стекла. Такой способ позволяет отделить плёнку со сформированным клеточным пластом от подложки и перенести его на рану даже при толщине плёнки 5 мкм.
Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура нанесенного белка. Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов. Впервые разработаны условия, при которых фибриллообразование коллагена осуществляется в момент нанесения коллагена в молекулярной форме на поверхность полилактидной плёнки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности.
Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин. Показано, что такая обработка способствует распластыванию кератиноцитов.
Практическая ценность. Сформированный клеточный продукт, который состоит из выращенного на биодеградируемой полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на повреждённый участок кожного покрова.
Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения. В частности разработанные методы модификации могут быть применены в процессе разработки трёхмерных пористых полимерных матриц. Такие матрицы позволят создать условия для формирования сложных клеточных композиций, максимально приближённых по их пространственной организации к условиям существования клеток в тканях организма.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ из них 2 статьи и 13 тезисов. Результаты исследования были представлены на 3 научной сессии У НИХ (Санкт-Петербург, 1-4 октября, 2004), международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г.), С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 1-3 февраля 2005 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г.), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005), European Polymer Congress (Moscow, June 27-29, 2005), International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (Jerevan, Republic Armenia, July 12-14, 2005), International symposium"Biomaterials" (Hamburg October 1- 4, 2006), Международная конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург 17-19 октября,
2006), IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 12-16 марта, 2007), British-Russian workshop"Stem cells: policy, research, and innovations. European Union -Russian Federation perspectives" (Moscow, March 15, 2007).
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (207 ссылок). Работа изложена на 163 страницах текста.
![Синтез азациклопента[c,d]феналенов на основе реакции Шмидта и электрофильного аминирования азидом натрия в полифосфорной кислоте](/i/i/4468/466102.png "Синтез азациклопента[c,d]феналенов на основе реакции Шмидта и электрофильного аминирования азидом натрия в полифосфорной кислоте Андриенко, Анна Валериевна")
