Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Неприродные аминокислоты 11
1.2. Природные соединения, содержащие гуанидиновую группу 17
1.3. Методы синтеза гуанилинов 24
1.4. Особенности получения и применения полимеров на основе производных гуанидина 30
Глава 2. Объекты исследования 37
2.1. Выбор объектов исследования 37
2.2. N-Амидино-Пролин 38
2.2.1. Синтез защищенных производных N-амидино-пролина 39
2.2.2. Твердофазный синтез пептидов, содержащих TV-амидино-пролин 46
2.3. N-амидино-пироглутаминовая кислота 49
2.3.1. Гуанидилирование эфира пироглутаминовой кислоты..50
2.3.2. Окисление TV-амидино-пролина 52
2.3.3. Модификация глутаминовой кислоты 54
2.4. 2-имино-1-имидазолидин уксусная кислота (циклокреатин) 63
Глава 3. Синтез пептидов, содержащих tv-амидино- аминокислоты 68
3.1. Получение аналогов rgd-пептидов 68
3.2. Синтез аналогов люлиберина 73
3.3. Использование производных n-амидино-пролина при синтезе полимеров 79
Глава 4. Экспериментальная часть 89
4.1. Материалы и методы исследования 89
4.2. Синтез n-амидино-пролина и его производных 91
4.3. Синтез пептидов твердофазным методом 93
4.4. Синтез полирч[а-(к-амидино-пролил)орнитина] 101
4.5. Изучение стабильности rgd-пептидов 105
Заключение 106
Выводы 108
Список литературы 109
Приложения 126
- Природные соединения, содержащие гуанидиновую группу
- Особенности получения и применения полимеров на основе производных гуанидина
- Синтез защищенных производных N-амидино-пролина
- Синтез аналогов люлиберина
Введение к работе
Природные полипептиды и белки применяются при диагностике инфекционных заболеваний, разработке лекарственных препаратов и* систем адресной доставки биологически активных соединений в клетки-мишени. Однако использование природных соединений в качестве лекарственных препаратов зачастую ограничено из-за широкого спектра действия, недостаточной энзиматической стабильности и невозможности перорального введения. Одним из способов преодоления таких проблем является получение синтетических аналогов, лишенных перечисленных недостатков или создание пептидомиметиков — органических молекул, моделирующих особенности строения активных центров пептидов и белков. При синтезе рассматриваемых соединений широко используются так называемые неприродные аминокислоты. Проведение структурно-функционального анализа позволяет модифицировать первичную структуру пептида или белка таким образом, чтобы способствовать образованию наиболее выгодной для биологического эффекта конформации.
Таким образом, получение новых аминокислот и разработка методов их введения в полипептидную цепь представляется актуальной задачей.
Среди неприродных аминокислот особую роль играют соединения, содержащие гуанидиновую группу, поскольку она входит в состав многих биологически активных веществ: антибиотиков, ингибиторов ферментов, алкалоидов и т. п. Уникальность физико-химических свойств гуанидинов, заключающаяся в сохранении положительного заряда при физиологическом значении рН, обусловливает их важную роль во многих биологических процессах. В современной литературе представлены многочисленные методы, используемые при синтезе замещенных гуанидинов. Вместе с тем, их практическое применение не всегда приводит к положительным результатам, что свидетельствует о необходимости оптимизации способов
получения конкретных объектов. Для моделирования ключевых особенностей TV-концевой последовательности аргинил-пролин, входящей-в состав многих природных пептидов, нами был выбран iV-амидино-пролин и его аналоги: TV-амидино-пироглутаминовая кислота и 2-имино-1-имидазолидин-уксусная кислота (циклокреатин).
Целью данного исследования является разработка методов синтеза N-амидино-аминокислот и их защищенных производных для получения на- их основе биологически активных, пептидов, пептидомиметиков и полимеров медицинского назначения.
При этом были поставлены следующие задачи:
Синтезировать iV-амидино-пролин и его производные, защищенные по амидиновой группе;
Разработать методы синтеза пептидов, содержащих TV-амидино-пролин, 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин) и N-амидино-пироглутами новую кислоту;
На примере аналогов люлиберина и RGD-пептидов изучить особенности применения N-амидино-аминокислот в пептидном синтезе и исследовать их влияние на строение и свойства полученных соединений;
Разработать методы синтеза полимеров на основе iV-амидино-пролина.
Методы исследования. Для подтверждения индивидуальности и доказательства химической структуры синтезированных соединений использовали методы электрофореза, тонкослойной хроматографии, обращённо-фазовой ВЭЖХ, масс-спектрометрии (ESI MS) и спектроскопии ЯМР. Пространственное строение полученных олигопептидов изучали методом двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР.
Объектами исследования являлись. TV-амидино-аминокислоты, их защищенные производные, а также полученные при их использовании пептиды и полимеры.
Особенности применения TV-амидино-аминокислот в классическом и твердофазном пептидном синтезе определены на примере аналогов люлиберина и RGD-пептидов. Возможности получения гуанидин-содержащих полимеров исследованы при проведении полимеризации Ar-(N-амидино-пролил)-орнитина.
Научная новизна:
- разработаны методы синтеза олигопептидов, содержащих TV-амидино-
пролин, основанные на использовании мезитиленсульфонильного
производного или проведении реакции гуанидилирования на полимерном
носителе;
выявлено образование бициклического побочного продукта при активации карбоксильной группы свободного TV-амидино-пролина;
разработан способ получения пептидов, содержащих TV-амидино-пироглутаминовую кислоту, и получены данные об особенностях их поведения в растворе при различных рН;
предложен простой и эффективный метод синтеза олигопептидов, содержащих 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин);
установлено, что замена аргинина на TV-амидино-пролин приводит к значительному повышению устойчивости RGD-пептидов к энзиматическому расщеплению;
проведен синтез двадцати новых химических соединений, включая производные TV-амидино-аминокислот, олигопептиды и продукты побочных химических реакций, структуры которых подтверждены методами физико-химического анализа.
Практическая значимость работы. Разработанные методы синтеза N-амидино-аминокислот и их защищенных производных могут быть использованы при получении биологически активных полипептидов, пептидомиметиков и полимеров, содержащих iV-амидино-пролин, циклокреатин и JV-амидино-пироглутаминовую кислоту. На основе
последовательности RGDF, модифицированной циклокреатином, синтезирован высокоактивный аналог, перспективный при разработке систем направленной доставки противоопухолевых препаратов. Положения, выносимые на защиту:
при получении олигопептидов; содержащих iV-амидино-пролин, наиболее эффективным является метод гуанидилирования на полимерном носителе;
замена- аргинина на iV-амидино-пролин позволяет значительно повысить устойчивость аналогов RGD-пептидов к энзиматическому расщеплению;
проведение реакции внутримолекулярной* циклизации является предпочтительным вариантом при синтезе пептидов, содержащих N-амидино-пироглутаминовую кислоту.
Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты исследований докладывались на 29-м Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, 2006), III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007) и конкурсе молодых ученых ИВС РАН (2006).
Работа выполнена в ИВС РАН в Лаборатории синтеза пептидов и полимерных микросфер в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме: «Биологически активные полимерные системы: синтез, структура, свойства».
Личный вклад автора состоял в проведении экспериментальных работ по синтезу производных iV-амидино-аминокислот и исследованию особенностей получения пептидов и полимеров на основе таких соединений.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 140 страницах, содержит 4 таблицы, 56 рисунков и 11 приложений, список литературы включает 165 наименований.
и;
Природные соединения, содержащие гуанидиновую группу
Гуанидин образуется в организме человека в качестве продукта белкового метаболизма. Важной особенностью данного соединения является способность к протонированию и сохранению положительного заряда в физиологических условиях за счёт высокого рКа (12.5) сопряжённой кислоты . Он является гликогенной аминокислотой и может служить источником энергии в организме. В больших дозах Z-аргинин стимулирует секрецию гормона роста и пролактина, а также выделение поджелудочной железой глкжагона и инсулина. В- составе полипептидов гуанидиновая группа аргинина участвует в образовании множественных водородных связей, а её положительный заряд обеспечивает ионные взаимодействия.
Соединения; относящиеся к классу гуанидинов (рис. 5), широко применяются в медицине и смежных областях. Так, образование третичной структуры белков происходит в условиях конкуренции с процессом обратимой агрегации. В качестве вещества, подавляющего ассоциацию белковых молекул, широко используется гидрохлорид гуанидина, предотвращающий структурирование за счёт образования новых водородных связей с функциональными группами протеина. Аргинин также способен подавлять образование белковых ассоциатов [21], причем его этиловый эфир показывает более выраженный эффект в случае агрегации, вызванной повышением температуры [22]. Авторы работы [22] предполагают, что эфирные группы участвуют в процессе гидрофобного взаимодействия, а боковые цепи остатков аргинина повышают общий положительный заряд белка. В результате электростатическое отталкивание одноименных зарядов предотвращает образование ассоциатов.
Особенности физико-химических свойств гуанидинов обусловливают их важную роль во многих биологических процессах и широкую распространенность в природе. В частности, взаимодействие разноименно заряженных биополимеров имеет большое значение при передаче генетической информации, проявлении антимикробного действия или доставке биологически активных веществ в клетку.
Низкомолекулярные белки гистоны(рис. 6), обладающие положительным зарядом за счёт высокого содержания лизина и аргинина, являются основным компонентом хромосом. Положительный заряд способствует прочному связыванию гистонов с отрицательно заряженной ДНК, независимо от ее нуклеотидной последовательности. Особенностью гистонов является их консервативность: пять основных групп семейства составляют белки с близкими свойствами, выделенные из разных организмов. Например, полипептиды из тимуса быка и проростков гороха, относящиеся к одной группе, отличаются расположением только двух аминокислотных остатков [23]. Таким образом, сохранение и передача генетической информации были бы невозможны без участия специфических белков, содержащих катионную гуанидиновую группу.
Известно, что многие организмы вырабатывают поликатионные пептиды, богатые аргинином и лизином, для защиты от микробной инфекции. Эта реакция является неспецифической, т.е. направлена на широкий спектр микроорганизмов, и предшествует более сложному иммунному ответу, проявляющемуся во взаимодействии антиген-антитело. Предполагается, что антимикробный эффект во многом обусловлен электростатическим взаимодействием между положительно заряженным полипептидом и отрицательно заряженным липидным бислоем клеточной мембраны микроорганизма. В настоящее время предложены три модели, объясняющие антимикробное действие поликатионных пептидов. Во-первых, вследствие адгезии и последующего внедрения полипептида в клеточную стенку происходит повреждение молекулярной архитектуры последней, приводящее к дисбалансу транспорта электронов, процессов окисления и фосфорилирования. Во-вторых, так называемый амфипатический эффект -разрушение клеточной стенки и образование микропор — приводит к нарушению избирательной проницаемости клеточной мембраны. В-третьих, предполагается, что проникновение поликатионного пептида в клетки микроорганизма может ингибировать. процесс репликации нуклеиновых кислот [24, 25]. К природным полимерным антибиотикам относят є-поли-L-лизин, мульти-Ь-аргинил-поли-Ь-аспарагиновую кислоту и др. Недавно из культутры дрожжей Verticillium был выделен уникальный антимикробный препарат (RH)5, представляющий собой повторяющиеся дипептидные фрагменты (аргинил-гистидин) [26]. В ходе изучения механизма действия пептида было показано, что он не приводит к разрушению мембраны клеток и не образует микропор на их поверхности. При этом флуоресцентно-меченый препарат проникает внутрь дрожжевых клеток и локализуется в ядре. На основании полученных данных было сделано предположение, что на первоначальном этапе происходит электростатическое взаимодействием (RH)5 с клеточной мембраной. В дальнейшем пептид проникает в клетку, где связывается с находящимися в ядре нуклеиновыми кислотами, приводя к нарушению процессов репликации и транскрипции. Результаты этого исследования свидетельствуют в пользу общности механизма действия поликатионных антибиотиков, к которым относятся и полимерные производные гуанидинов.
Способность белка Tat (/nm -activator of transcription) ВИЧ-1 к проникновению в клетки из культуральной среды была зафиксирована в конце 1980-х годов [27]. Этот протеин, состоящий из 101 аминокислотного остатка, участвует в процессе репликации вируса. Позднее было показано, что проникающая способность обусловлена наличием последовательности (49-57), в которой восемь остатков приходится на основные аминокислоты, преимущественно аргинин [28, 29]. Этот участок последовательности может быть использован в качестве носителя для доставки лекарственных препаратов в клетки при лечении заболеваний, связанных с генетическими нарушениями или злокачественными новообразованиями. Фрагменты белка Tat ВИЧ-1 и олигоаргинины [30] составляют особую группу пептидных средств доставки, для которых существенную роль в эффективности переноса играет взаимодействие катионного вектора и отрицательно заряженной мембраны клетки.
Таким образом, благодаря высокому положительному заряду, в случае биополимеров - производных гуанидина — реализуется принцип электростатического взаимодействия, являющийся основой многих природных процессов. Это обусловливает высокую значимость рассматриваемых соединений в осуществлении таких функций живого организма, как сохранение и передача генетической информации, а также защита от различного рода инфекций.
Например, микроорганизмы видов Streptomyces sp., Actinomycete sp., Lysobacter sp. и др., обитающие на земной поверхности, являются источниками антибиотиков и ингибиторов ферментов. Эулицин (рис. 7) — антибиотик, подавляющий развитие широкого спектра Грамм — положительных и отрицательных бактерий, а также предотвращающий инфицирование и репликацию ВИЧ. Моноамидомицин (рис. 7), N-[(S)-5-гуанидино-2-гидроксипентаноил]--фенилаланин - активный ингибитор связывания фибриногена с гликопротеиновыми рецепторами GP ИЬ/Ша. Одно из производных гуанидин-содержащей 8-(2-иминоимидазолидин-4-ил)-1,2-диамино-5,6-дигидроксиоктановой кислоты (рис. 7) оказалось эффективным ингибитором роста клеток опухоли кишечника человека (DLD-1).
Ряд биологически активных гуанидинов выделен из микроорганизмов, обитающих в море. К ним можно отнести циклический декапептид из сине-зелёных водорослей, подавляющий грибковую инфекцию. При этом было показано, что сине-зелёные и некоторые представители рода зелёных водорослей также содержат гепатотоксины, включающие гуанидиновую группу.
Морские губки как представители морских беспозвоночных являются источником большого количества гуанидин-содержащих соединений, в том числе алкалоидов, проявляющих токсические и антибактериальные свойства. Некоторые из них, в сочетании с противогрибковым эффектом, оказывали цитотоксическое действие на клеточной линии лимфоцитов, инфицированных ВИЧ-1.
Особенности получения и применения полимеров на основе производных гуанидина
Одним из следствий стремительного развития методологии синтеза гуанидинов является интерес к получению полимерных соединений на основе мономеров, содержащих положительно заряженную гуанидиновую группу. В ряде случаев, это позволяет ожидать изменения свойств полимера по сравнению с мономерными молекулами за счёт увеличения числа гуанидиновых фрагментов. В настоящее время гуанидин-содержащие олигомеры и полимеры широко примененяются- при разработке новых лекарственных средств, косметических композиций [54], антимикробных агентов, сорбентов и др.
Первые сообщения о замещённых гуанидинах с противомикробной активностью появились в 1930-х годах, после чего различные производные гуанидина были предложены в качестве антисептиков для медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности и пр. Большинство гуанидиновых препаратов растворимы в воде и безопасны для окружающей среды, что создает преимущества при их использовании. Вопросы получения гуанидин-содержащих полимеров и физико-химические методы, используемые для их исследования, подробно рассмотрены в монографии [55]. В качестве мономеров предложены диаллил- и акрил-соединения, которые могут быть полимеризованы или сополимеризованы по радикальному механизму. Устойчивость к нагреву является необходимым условием для применения полигуанидинов в качестве добавок в процессе получения волокон [56] или в случае проведения полимеризации при повышенной температуре.
Особенностью получения полигуанидинов в расплаве, как и любых полиэлектролитов, является отсутствие закономерности между вязкостью полимеризационной массы и характеристической вязкостью (а, следовательно, и молекулярной массой) продукта синтеза. Этот факт объясняется образованием ионных пар, мультиплетов и кластеров, приводящих к снижению реакционной способности функциональных групп [58]. В работе [57] показано, что в силу высокой термостабильности, полимерные гуанидины и бигуанидины обладают биологической активностью даже после нагрева до 280С в течение 15 мин, что позволяет рекомендовать их в качестве термостойких антисептиков для таких полимеров, как полиэтилен и полипропилен. Противомикробные гуанидин-содержащие полимерные соединения (рис. 14) находят применение в качестве дезинфектантов воды в бассейнах, а также в химической технологии как низкотоксичные стабилизирующие добавки для латекса [59].
Синтез мультивалентных лигандов белковых рецепторов является перспективным направлением при поиске высокоактивных лекарственных препаратов. Для повышения доступности функциональных групп таких лигандов за счёт гидрофильности и гибкости боковых цепей был разработан метод получения пептоидов, содержащих хорошо растворимые в водных средах гуанидиновые группы [60]. В работе [61] описан синтез поливалентного ингибитора сиалидазы. Сиалидаза - один из мембранносвязанных гликопротеинов вирусов гриппа А и В, ответственных за процесс инфицирования. Существует ряд специфических ингибиторов этого фермента, в том числе лекарственных препаратов, однако, практически нет данных о полимерных соединениях с такой активностью. Для получения нового препарата была проведена модификация боковых карбоксильных групп поли-Ь-глутаминовой кислоты (М=50 000-70 000) низкомолекулярным ингибитором занамивиром, содержащим в боковой цепи гуанидиновую группу. Полученные соединения оказались примерно в 100 раз более активными по отношению к сиалидазе, чем занамивир, в пробе на выживаемость инфицированных вирусом клеток. По-видимому, этот результат обусловлен образованием интерполиэлектролитного комплекса (ИПК) между звеньями полимера и сиалидазы. Показана высокая эффективность полимерного ингибитора и в опытах in vivo на мышах.
В настоящее время применение олигонуклеотидов в молекулярной биологии связано с разработкой новых терапевтических препаратов. Специфические комплексы олигонуклеотидов с ДНК, РНК или белками позволяют регулировать функциональную активность биополимеров, тем самым оказывая положительный эффект при лечении генетических заболеваний. Аналоги олигонуклеозидов, способные влиять на внутриклеточные процессы на уровне трансляции и транскрипции через связывание с комплементарной РНК или ДНК, известны как «антисмысловые» агенты.
В последние годы получила развитие методология включения положительно заряженных группировок в олигомерные «антисмысловые» соединения путём модификации азотистого основания или кольца углевода нуклеотида, а также замены внутринуклеозидной фосфатной связи положительно заряженной гуанидиновой группировкой (рис. 15) [62, 63]. В последнем случае становится возможным повысить как устойчивость соединений к действию ферментов, так и их проникающую способность за счёт электростатического взаимодействия с мембранами клеток и стимуляции эндоцитоза.
Введение в структуру полимеров ионогенных фупп позволяет получить ионообменные смолы для извлечения органических веществ, иммобилизации ферментов и других биологически активных соединений, а также в качестве комплексонов для переходных металлов. К настоящему моменту достаточно полно изучен процесс получения и основные характеристики смол на основе различных синтетических полимеров, содержащих концевые гуанидиновые группы [65 — 69]. Такие материалы могут быть использованы, в частности, для сорбции ионов золота или меди.
Большой интерес вызывает возможность применения синтетических полимеров в качестве векторов для доставки терапевтических агентов, поскольку это позволило бы преодолеть такие недостатки природных носителей, как неустойчивость к действию ферментов, низкая проникающая, способность широкий спектр биологического действия путём создания высоких локальных концентраций в мишени. В этой области перспективным является получение высокоактивных аналогов аргинин-содержащих пептидов, таких как олигоаргинины и фрагменты белка Tat. Симметричные тетрагуанидиновые векторы (рис. 16) не подвержены протеолизу, а их синтез проходит с высоким выходом [70]. Биологические испытания in vitro серии флуоресцентно-меченых соединений показали, что проникающая способность новых векторов превышает эффективность природных пептидов — доменов трансдукции белков. Более того, тетрагуанидиновые препараты склонны к локализации в митохондриях.
Синтез защищенных производных N-амидино-пролина
Для блокирования гуанидиновой группы аргинина в классическом пептидном синтезе наиболее часто используют защиту протонированием, а также NO2-, Z-, Вое- и Adoc-группировки [76].
Поскольку наиболее простым способом блокирования гуанидиновой (и амидиновой) группы является защита протонированием, прежде всего нами была исследована такая возможность. При этом с целью улучшения растворимости в органических растворителях в качестве противоиона использовали яяря-толуолсульфонат. Полученный ияра-толуолсульфонат N-амидино-пролина обладал хорошей растворимостью в диметилформамиде. Однако попытки активации его карбоксильной группы с помощью NJV -диизопропилкарбодиимида в присутствии 1-оксибензотриазола приводили к практически количественному образованию побочного продукта, имеющего высокую электрофоретическую подвижность. Поэтому в ходе дальнейшей работы исследовались другие методы блокирования амидиновой группы. Другим перспективным вариантом представлялось применение щелочнолабильной трифторацетильной защиты. Литературные данные относительно возможности трифторацетилирования гуанидиновой группы аргинина противоречивы. Так, сообщается, что при обработке дихлоргидрата эфира аргинина трифторуксусным ангидридом происходит образование только іУ,ІУ-бис-замещенного производного [78]. Вместе с тем, в работе [79] трифторацетильная группировка предложена в качестве ортогональной защиты при использовании замещенных гуанидинов в классическом и твердофазном пептидном синтезе. При этом авторы применили многостадийную схему синтеза, предусматривающую использование производных тиомочевины. В тоже время, в некоторых публикациях содержатся указания на возможность прямого трифторацетилирования гуанидиновой группы [80].
Для получения трифторацетильного производного, исходя из свободного TV-амидино-пролина, мы использовали два варианта: а) действие трифторуксусного ангидрида в трифторуксусной кислоте и б) действие пара-нитрофенилтрифторацетата в пиридине (рис. 20). В первом случае, вне зависимости от условий проведения реакции (количества эквивалентов ацилирующего агента и времени выдерживания), вместо трифторацетильного производного наблюдалось образование побочного продукта, обладающего более высокой, чем TV-амидино-пролин, электрофоретической подвижностью. Это может быть связано с процессами, приводящими к потере карбоксильной группы. Аналогичные результаты были получены нами ранее при попытках активации карбоксильной группы «ара-толуолсульфоната TV-амидино-пролина.
Сопоставление масс-спектров полученного продукта и исходного N амидино-пролина (приложение 2) свидетельствует о значительной склонности рассматриваемых соединений к образованию кластеров. В случае исходного вещества наблюдаются дополнительные сигналы соответствующего димера и тримера, а в случае побочного продукта — димера. Молекулярная масса исследуемых соединений отличается на 18 единиц, что указывает на возможность потери молекулы воды в результате реакции внутримолекулярной циклизации TV-амидино-пролина. Для проверки правильности данного предположения был проведен анализ спектров LH (рис. 21) и С-ЯМР (рис. 22) полученного продукта. Отнесение сигналов спектра в сочетании с результатами масс-спектрометрического анализа позволяет сделать вывод о внутримолекулярной циклизации при участии азота амидиновой группы с образованием второго пятичленного цикла (структура II, рис. 19). Внутримолекулярная циклизация в большей или меньшей степени протекает также при активации карбоксильной группы ияря-толуолсульфоната iV-амидино-пролина NJV диизопропилкарбодиимидом в присутствии 1-оксибензотриазола.
Синтез аналогов люлиберина
Возможности применения іУ-амидино-пролина при синтезе аналогов биологически активных природных олигопептидов были исследованы нами на примере люлиберина. Люлиберин (GnRH), регулируя секрецию передней долей гипофиза лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, обеспечивает контроль за ходом процессов овуляции и сперматогенеза. В настоящее время аналоги данного рилизинг-гормона широко используются при лечении эндометриоза, нарушений полового созревания, а также ряда опухолевых заболеваний [137].
Последовательность люлиберина содержит десять аминокислотных остатков: pGlu1-His2rp3-Ser4yr -Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10-NH2. Поскольку время полужизни рилизинг-гормона в организме человека составляет порядка 4 мин [138], значительное количество исследований посвящено синтезу аналогов, обладающих устойчивостью к действию ферментов и повышенной биологической активностью. Изучение «биологически активной» конформации люлиберина (т.е. конформации, в которой гормон взаимодействует с соответствующим рецептором) показывает, что характерной особенностью является наличие р-изгиба на участке 5-8 природной последовательности (рис. 45) [139]. р-изгиб
Введение )-аминокислот в положение 6 способствует образованию 0-изгиба и приводит к получению высокоактивных аналогов люлиберина таких, как [D-Ala6]-GnRH [140], а одновременная модификация положений 2 и 6 позволяет получить высокоактивные антагонисты [141]. Замена глицинамида в структуре вышеперечисленных аналогов на этиламидную группу способствует еще большему повышению биологической активности [142].
Таким образом, при модификации природной последовательности ключевыми положениями являются остатки 2, 6 и 10. Поскольку эффективность действия антагонистов может быть повышена за счет включения в положение 3 остатка пролина, в качестве исходной структуры нами была выбрана последовательность: PGlu,-i)-P e2-Pro3-Ser4yr5-i -Xv5 J-Leu7-Arg8-Pro9-Glyl0-NH2. Для определения влияния природы iV-концевого аминокислотного остатка на конформацию аналогов и оценки возможности стабилизации Р-изгиба за счёт ионного взаимодействия концевых группировок нами были получены соединения (XVIII) и (XIX). Синтез пептидов проводили твердофазным методом на полимере Меррифильда и 4-метилбензгидриламино-полимере. gPro1-D-Phe1-Vro3-SeT4yv5-D-Lys6-LQu7-Arg8-Fro9-G\y10-OU (ХУЛІ) gPro1-D-P e2-Pro3-Ser4yr5-i -j;s6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10-NH2 (XIX)
При этом для введения в структуру аналогов N-амидино-пролина использовали два подхода. Попытки присоединения мезитиленсульфонил-ІУ-амидино-/,-пролина карбодиимидным методом приводили к образованию незначительного количества целевого продукта, несмотря на увеличение продолжительности реакции до 40 ч. В то же время, была показана высокая эффективность реакции гуанидилирования N-концевого остатка пролина на полимерном носителе под действием (NJV -бг/с-Аягрет-бутилоксикарбонил)-1//-карбоксамидин-бензотриазола и N,N-диизопропилэтиламина. В этом случае по данным изатинового теста реакция завершается за 18 ч и позволяет получить аналоги (XVIII) и (XIX) с достаточно высоким выходом.
Таким образом, гуанидилирование на полимерном носителе при использовании (АУУ -бис-т/?ега-бутилоксикарбонил)-1і?-карбоксамидин бензотриазола является предпочтительным методом синтеза олигопептидов, содержащих TV-амидино-пролин. Из литературы известно, что пептидная связь преимущественно принимает транс-конформацию, однако для имидной связи с участием пролина характерна цис-транс-язомерия (рис. 46) [143, 144]. Скорость такой изомеризации играет важную роль в процессах сворачивания белков, инициировании рецептор-опосредованной передачи сигнала через клеточную мембрану и, в конечном счёте, оказывает влияние на биологическую активность пептидных препаратов. Поэтому определение влияния остатков пролина на изомеризацию пептидной связи представляет интерес при изучении взаимосвязи структура — активность [145, 146].
Полученные ранее в лаборатории 29 ИВС РАН аналоги люлиберина, содержащие в положениях 1, 3 и 9 остатки пролина, не проявляли тенденции к образованию стабильных конформеров. В то же время, при проведении хроматографического анализа аналогов, содержащих iV-амидино-пролин, методом ОФ ВЭЖХ было отмечено образование «плеча» основного пика (рис. 47). При разделении в условиях повышенной температуры (50С) наблюдается эффект коалесценции. Эти результаты в сочетании с литературными данными [147, 148] и данными масс-спектрометрического анализа свидетельствуют об изомеризации пептидной связи с образованием устойчивых конформеров.
Непосредственное подтверждение изомеризации пептидной связи может быть получено при использовании метода спектроскопии ЯМР [148 — 151], в особенности методики корреляционной спектроскопии, позволяющей получить информацию о взаимодействии соседних ядер. В ходе изучения влияния TV-амидино-пролина на конформацию аналогов (XVUL1) и (XIX) были получены Н-, С- (приложение 7), NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, спектроскопия с использованием ядерного эффекта Оверхаузера), (1Н-13С) COSY (Correlation Spectroscopy, корреляционная спектроскопия) и ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy, спектроскопия с использованием ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат) спектры ЯМР (приложения 8 — 10) при комнатной температуре и градиентном нагреве до 50С.
В соответствии с полученными спектральными данными, для аналогов люлиберина, модифицированных TV-амидино-пролином, характерна изомеризация пептидной связи, образованной остатками пролина в положениях 3 и 9 аминокислотной последовательности (рис. 48).
