Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Самоорганизация липидов и липид-(со)полимерных систем 10
1.1.1. Самоорганизация липидов на примере лецитина. Строение клеточной мембраны 10
1.1.2. Самоорганизация макромолекул на границе раздела фаз 22
1.1.3. Полимеризационный липидный монослой 29
1.2. Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев 34
1.2.1. Метод смачивания 34
1.2.2. Термодинамика поверхностного слоя 37
1.2.3. Монослои Ленгмюра на основе полимеров и амфифильных сополимеров 43
2. Экспериментальная часть 50
2.1. Исходные вещества и методики очистки 50
2.1.1.Синтез полимеров и сополимеров 52
2.1.2. Синтез фосфатидилхолина (лецитина яичного) 53
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Методика получения монослоев Ленгмюра 56
2.2.2. Измерение краевых углов смачивания 61
3. Обсуждение результатов 65
3.1. Смачивание и термодинамические свойства тонких пленок амфифильных (со)полимеров и их смесей с лецитином 66
3.1.1. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса как мера сродства ВМС к полярным и липофильным биологически системам и средам 67
3.1.2. Определение поверхностной энергии Гиббса сополимеров 68
3.1.3. Определение межфазной энергии Гиббса и ее составляющих для гидратированных сополимеров 72
3.1.4. Смачивание смесевых пленок "лецитин - сополимер" 79
3.2. Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра 85
3.2.1. Монослои амфифильных сополимеров и их смесей с лецитином на водной субфазе 86
3.2.2. Вязкость сильно разбавленных растворов сополимера Ст-МВПД 92
3.2.3. Влияние характера растекания растворов на свойства монослоев 95
3.2.4. Электронные спектры поглощения 97
3.3. Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул (липосом) 103
3.3.1. Агрегативная устойчивость везикулярных систем 106
3.3.2. Изучение адсорбции лекарственного препарата на поверхности 109
3.3.3. Механизм введения лекарственного препарата во внутреннюю полость везикул 113
Выводы 116
- Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев
- Методы исследования
- Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра
- Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул (липосом)
Введение к работе
В настоящее время активно используется метод моделирования, в рамках которого получают и исследуют искусственные мембраны как упрощенные модели биологических мембран. Важным требованием, предъявляемым к моделям мембран, является их устойчивость в условиях эксперимента. Традиционно используемые модельные мембраны - везикулы1 (липосомы), монослои на поверхности вода-газ, «черные» липидные мембраны", как и биологические мембраны, весьма лабильны, что в определенной степени ограничивает метод исследования.
В последнее время активно развивается направление по созданию стабильных искусственных липидных мембран, основанное на использовании липидов с полимеризуемыми группами [1]. Полученные таким образом высокостабильные полимерные везикулы используются для изучения механизмов взаимодействия везикул с клетками, фиксации ферментов в липидной мембране, создания средств направленного транспорта биологически активных веществ в организме и искусственных переносчиков кислорода. Полимерные моно- и мультимолекулярные слои находят применение при создании биосенсоров, модификации поверхности имплантантов и получении гемосовместимых материалов, при разработке запоминающих устройств [2].
Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев
Многочисленными исследованиями продемонстрирована возможность корреляции поверхностных свойств полимеров и смачиваемости их поверхности различными жидкостями [33]. Смачивание - это поверхностное явление, заключающееся во взаимодействии жидкости с твердым телом или другой жидкостью при наличии линии одновременного контакта трех несмешивающихся фаз, одна из которых обычно является газом (воздухом). В зависимости от числа фаз, участвующих в смачивании, различают два основных случая. 1. Смачивание при полном погружении твердого тела в жидкость, в котором участвуют только две фазы - жидкость и твердое тело. Иммерсионное смачивание реализуется обычно при смачивании порошков и мелких частиц. 2. Контактное смачивание, в котором на ряду с жидкостью и с твердым телом контактирует третья фаза - газ или другая жидкость. Возможны такие случаи, когда в смачивании участвуют четыре разных фазы - твердое тело, газ, две жидкости. Характер смачивания определяется, прежде всего, физико-химическими взаимодействиями на поверхности раздела фаз, которые участвуют в смачивании. Интенсивность этих взаимодействий при иммерсионном смачивании характеризуется теплотой смачивания. Контактное смачивание характеризуется чаще всего величиной краевого угла - угла между поверхностями жидкости и твердого тела на границе с окружающей средой. Наиболее наглядно представление о краевом угле можно получить из примера контакта капли жидкости с поверхностью твердого тела или пузырька газа с твердой поверхностью в жидкости. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса имеет двойную размерность - энергии Дж/м" и силы Н/м. В последнем случае говорят о поверхностном натяжении, которое направлено тангенциально к поверхности и в сторону ее сжатия. В таблице 1.2 приведены вектора поверхностного натяжения в различных системах. Необходимо различать равновесные и неравновесные краевые углы. Равновесный краевой угол 0() зависит только от термодинамических свойств системы, а именно, от поверхностных натяжений на границе раздела фаз, участвующих в смачивании. Поэтому для каждой системы при данных внешних условиях равновесный краевой угол имеет одно определенное значение. Краевые углы, которые измерены при отклонении системы от состояния термодинамического равновесия, называются неравновесными. Во время контакта фаз, участвующих в смачивании, неравновесные краевые углы могут изменяться.
Краевые углы, изменяющиеся в процессе растекания жидкости по поверхности твердого тела, называются динамическими. Для динамических краевых углов характерно, что их изменение происходит при перемещении линии смачивания. Зависимость динамических краевых углов от времени характеризует скорость растекания жидкости. Неравновесные краевые углы могут также изменяться при постоянной площади смачивания вследствие постепенного изменения свойств системы или объема капли за счет различных физико-химических процессов - испарения жидкости, взаимного растворения твердого тела и жидкости, адсорбции, химических реакций и так далее. В таких случаях изменение неравновесных краевых углов определяется уже не скоростью растекания жидкости, а одним из сопутствующих физико-химических процессов. В зависимости от значений равновесного краевого угла различают три основных случая. 1. Несмачивание (плохое смачивание) - краевой угол тупой: 18ОО 0() 9О (вода на парафине или тефлоне). 2. Смачивание (ограниченное смачивание) - краевой угол острый: 90 0( О (вода на металле, покрытом окисной пленкой). 3. Полное смачивание. Равновесный краевой угол не устанавливается, капля растекается в тонкую пленку (ртуть на поверхности свинца, очищенной от оксидной пленки). Величина равновесного краевого угла определяется соотношением сил притяжения жидкости к твердому телу и сил взаимного притяжения между частицами самой жидкости. Равновесный краевой угол представляет одну из важнейших характеристик смачивания. Уравнение, определяющее величину равновесного краевого угла, можно вывести разными способами. Наиболее строг и последователен метод, основанный на известном положении термодинамики о том, что в состоянии равновесия свободная энергия системы минимальна. В связи с этим для определения условий равновесия при смачивании необходимо учитывать энергетические изменения, которые происходят на поверхности раздела фаз. Количественной энергетической характеристикой поверхности твердых тел и жидкостей служат удельная поверхностная энергия Гиббса Y$, граница раздела твердое тело - жидкость, две несмешивающиеся жидкости характеризуют ys и ys). 1.2.2. Термодинамика поверхностного слоя. Значения поверхностной и межфазной энергии Гиббса связаны простыми соотношениями с работой когезии WK и адгезии Wa. Напомним, что под этими терминами подразумевается притяжение атомов и молекул внутри одной фазы и двух разных фаз. Естественно, что в последнем случае имеется в виду поверхность (граница раздела фаз) и пограничные слои. При разрыве цилиндра одной фазы единичной площади образуется две границы раздела на которых сконцентрирована поверхностная энергия Гиббса, следовательно WK=2 її или WK=2 Ys Если разорвать цилиндр идентичной площади состоящий из двух контактирующих фаз на границе раздела, то Wu . =У/+ Ys - Ys, Это соотношение называется уравнением Дюпре. Обычно ys определяют как половинную энергию когезии AGKor. твердой пленки (твердого тела). где G — энергия Гиббса; s - площадь раздела фаз.
В настоящей работе величины ys и ys находили исходя из значений равновесных углов смачивания идеальной поверхности твердого тела. Согласно уравнению Юнга: Ysv-Ysi=Ylv-Cos0{) (1.5), где Ysv, /si - межфазная энергия Гиббса на границах раздела твердое тело - пар, твердое тело - жидкость, соответственно; уы- межфазное натяжение на границе раздела жидкость - пар; 0() - равновесный краевой угол смачивания. Фундаментальным уравнением используемым для нахождения межфазной энергии Гиббса по данным краевых углов смачивания является уравнение вида, предложенное в работе [44]: П/=П+Г/-2Ф-(Г,-Г/),/2 (1.6), где Ф - параметр межмолекулярного взаимодействия (Ф 1). Подставив уравнение (1.5) в уравнение Юнга (1.6), получим уравнение с одной неизвестной ys. В основе развиваемых теоретических представлений и предлагаемых экспериментальных методов измерения межфазных энергий и компонент межфазных энергий лежат следующие допущения: 1. Общая поверхностная энергия твердых тел и жидкостей может быть представлена как сумма дисперсионной и полярной компонент; 2. Работа адгезии, равная Wsl = Ys+Yi Ysi также определяется суммой дисперсионных и полярных компонент: Wb = W: + W (1.9) 3. Как дисперсионная, так и полярная компонента работы адгезии могут быть выражены как среднегеометрические величины: wS! = 2(r;rD z (їло Щ=2(Г,ГГП"2 (i.il) 4. Компоненты свободной поверхностной энергии (в особенности, дисперсионные компоненты) твердых тел в неполярном окружении не зависит от природы неполярной фазы, (т.е. одинаковы для всех углеводородов и для воздуха). Отсюда следует, что г„ = ЇКГ- - W" Y + ЇГЇ)"2 -(r,")"2F (1.12) На основании этого уравнения можно делать определенные выводы о совместимости полимерного материала со средой. Межфазное натяжение может быть равным нулю, если Yi Ys и Yi Ys Такой материал будет идеально совмещаться с водной средой (компонентами крови), не промотируя адгезии. С другой стороны, такой материал согласно представлениям о лиофильности должен самопроизвольно диспергироваться в кровь. Поэтому величина У sl не должна быть меньше 3 мДж/м2. Из последнего уравнения видно, что некоторые комбинации полярных и дисперсионных составляющих свободной поверхностной энергии твердого тела могут давать межфазное натяжение кровь - биоматериал -1-3 мДж/м . Таким образом, критерию совместимости с водной средой могут отвечать любые, по крайней мере, сильно различающиеся по свободным поверхностным энергиям полимеры. Очень многие полимеры, при У sl — ЗмДж/м2, могут быть совместимы (кровесовместимыми) в течение короткого времени.
Методы исследования
Для моделирования биосистем были использованы сополимеры: Ст-NBYIJX (пъ=0.5), Ст-4ВП (т2=0.9), Ст-МАК (т2=0.35) и природный фосфалипид - яичный лецитин с молекулярной массой М=766, а также двойные системы (их смеси). Тонкая пленка мембраноподобных структур. Предварительную подготовку подложек для формирования тонкой пленки лецитиновых, полимерных и смешанных мембраноподобных структур проводили по следующей методике. Стеклянные подложки отмывали в хлороформе, затем выдерживали в горячем растворе хромовой смеси при 100С в течение 20 минут, промывали 10 минут в горячей воде при 90С, в холодной проточной воде и дважды в бидистиллированной воде комнатной температуры. Подложки подвергали термостабилизации при 160С в течение трех часов. Поверхность стандартизовали по измерениям краевых углов смачивания натек. КаПЛИ ВОДЫ. Для формирования тонкой пленки, очищенные подложки погружали в хлороформный раствор определенной концентрации(0.0001-0.8 г/л) на 1 минуту при комнатной температуре и затем высушивали в вакуумном эксикаторе в течение не менее 60 минут. Контроль поверхности осуществляли измерением краевых углов смачивания. Везикулярные системы. Метод обращения фаз. 0.036 г. вещества (лецитина или смеси лецитина и ВМС) растворяли в 10 мл. хлороформа, добавляли 5 мл. бидистиллированной воды и обрабатывали УЗ в течение 1 минуты при 44 кГц. Затем добавляли 150 мл воды и подвергали повторному озвучиванию в течение 1-2 мин при 44 кГц. Полное удаление органического растворителя производили на водоструйном насосе [75,76]. Получение везикул на подложке. Растворяли лецитин или его смесь с ВМС (0.036г) в 10мл хлороформа и микрошприцом наносили раствор на специальную стеклянную плоскую подложку. Высушивание проводили под вакуумом. Затем подложку с высушенным слоем смеси лецитина и ВМС погружали в стакан с бидистиллированной водой на короткое время ( 1 мин.) и сушили в вакуумном шкафу при комнатной температуре [77,78]. Получение мембраны. Мембрану получали с использованием метода Ленгмюра-Блоджетт на приборе, принцип действия которого основан на измерении зависимости поверхностного давления к от площади, занимаемой одной молекулой.
Для получения мембран наносили на поверхность воды (субфазы) ЗОмкл хлороформного раствора (лецитина, сополимера, смеси). Были использованы хлороформные растворы следующих составов и концентраций (табл.2.3.): под пылезащитный прозрачный колпак и заполняли жидкой субфазой ( 1 мм выше уровня ванны). Поверхность жидкости очищали при помощи тефлонового барьера 3. Для этого барьер 3 помещали на край ванны 4, таким образом, чтобы он касался жидкой субфазы, затем барьер перемещали по всей поверхности субфазы, собирая с нее пыль и другие загрязнения. Эту процедуру повторяли многократно, используя каждый раз новый барьер. Устанавливали измерительный (неподвижный) барьер 2 на поверхность жидкой субфазы при помощи проволочного держателя таким образом, чтобы исключить зазоры и трение между стенками ванны 4 и измерительным барьером 2. Нагружали неподвижный барьер 2, связанный с весами Ленгмюра, разновесами от 10 до 1000мг, компенсировали отклонения показаний компьютера (весов Ленгмюра) 6 относительно нулевого положения и строили калибровочную зависимость показаний шкалы прибора от истинного значения массы mnp=f(mMCT.) (рис.2.2) Проведение эксперимента и получение изотерм сжимаемости. Для получения плотноупакованного мономолекулярного слоя по методу Ленгмюра-Блоджетт необходимо нанесение на субфазу точно рассчитанного количества пленкообразующего вещества. Для полимеров проводили расчет количества вещества, приходящегося на единицу площади - м7мг. Полимеры растворяли в легколетучих органических растворителях, не смешивающихся с веществом субфазы. Для обработки экспериментальных данных была создана специальная компьютерная программа. Устанавливали нулевое значение показателя весов Ленгмюра и по каплям наносили из микрошприца по всей поверхности субфазы исследуемый полимер в легколетучем растворителе. Экспериментально устанавливали время Определение краевого угла смачивания погружным двухжидкостным методом. Анализируемый образец помещали на предметный столик, находящийся под слоем изучаемой жидкости в герметичной кювете 2 (рис.2.4). Смачивающую жидкость (йодистый метилен) фиксированного объема Імкл наносили микрошприцом МШ-10М через отверстие в крышке кюветы на верхнюю поверхность анализируемого образца.
С помощью шкалы отсчетного микроскопа 1 измеряли хорду профиля капли 1 и ее высоту h и, используя формулы (2.2.), рассчитывали краевой угол смачивания, считая каплю сферической. Определение краевого угла смачивания воздушного пузырька. Анализируемый образец помещали на предметный столик (рис.2.4), находящийся под слоем исследуемой жидкости в герметичной кювете 2 и подводили на нижнюю поверхность образца пузырек воздуха. Пузырек воздуха фиксированного объема Імкл подводили с помощью микрошприца для хромотографии марки МШ-10М с загнутым концом. Для каждой исследуемой жидкости использовали отдельный микрошприц. При помощи отсчетного микроскопа 1 измеряли хорду профиля I и высоту h капли, используя которые, рассчитывали краевой угол смачивания по формулам (2.2.,2.3.), считая пузырек воздуха сферическим. УФ-спектрофотометрические исследования. Электронные спектры поглощения растворов полимера и его смесей с лецитином в области 240нм - 800нм были получены на приборе «Bio line Specord s 100» фирмы Analytik Jena AG, толщина кварцевой кюветы 10мм. Изучение вязкостных характеристик. Измерение вязкости Пуд раствора полимера Ст-ЫВПД (іті2=0.5) и его смеси с лецитином, проводили на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,56мм. Поправка на кинетическую энергию течения составила менее 1,5% и поэтому при подсчете числа вязкости Пуд/С (л/г) не учитывалась Луд удельная относительная вязкость, С - концентрация полимера в растворе (г/л)]. Величину гуд определяли как Луд = Лоты -1, (2.3.) где готн = т/то, т и т0 - время истечения растворов лецитина (или Ст-МВПД т2=0.5) и хлороформа, соответственно. Атомно-силовая микроскопия. Топографию везикул исследовали на сканирующем зондовом микроскопе "Solver Bio NT-MDT" (Зеленоград) в неконтактном режиме. Образцы готовили нанесением эмульсии везикул из микрошприца на предметное стекло (толщина 1 мм) с последующим высушиванием под вакуумом. Проницаемость ДР в нанокапсулы липосом. Концентрацию ДР внутри везикул (заполняемость или «загруженность» везикул) устанавливали по анализу диализованного раствора ДР. Диализ осуществляли с использованием мембран из целлюлозы (М.М.= 10000) при ионной силе 0.1-0.2 (рис.2.5).
Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра
Систематические исследования мономолекулярных слоев Ленгмюра статистических (со)полимеров стирола с полярными мономерами на поверхности водной фазы впервые проведены сотрудниками кафедры ВМС и коллоидной химии ННГУ [83]. Состояние монослоев, полученных из полуразбавленных растворов, и изложенных терминами л А-изотерм, интерпретировано в рамках скеилинговои теории двухмерных полимерных растворов. Так, в изучаемых авторами условиях сополимер Ст-ЫВПД образуют монослои, представляющие собой двухмерную конденсированную фазу, а вода, на которой формируется монослой, является «0» (т.е. «идеальным») растворителем. Доказательством такого отнесения монослоев авторы считают удовлетворительное совпадение рассчитанной по экспериментальным данным и теоретически предсказанной величины критической скеилинговои экспоненты v для двухмерно ориентированных сополимеров Ст-ЫВПД с Ш2=0.42 и т2=0.51. Состояния монослоев статистических сополимеров, полученных из разбавленных растворов, не исследованы. По аналогии с агрегатными состояниями обычного вещества мономолекулярные пленки можно разделить на три типа: газообразные, жидкие и твердые пленки. Газообразные пленки могут неограниченно расширяться, не претерпевая фазовых изменений, постоянные контакты между молекулами отсутствуют. В жидких пленках эти контакты, обусловленные межмолекулярным взаимодействием, возникают. Различают растянутые и конденсированные жидкие пленки. В последних большие оси молекул ориентируются перпендикулярно поверхности. Твердые пленки характеризуются строго линейными зависимостями л-А. Сжимаемость таких пленок мала и близка к сжимаемости твердого вещества, что указывает на плотную упаковку углеводородных цепей. Наблюдаемые нами эффекты минимальной добавки амфифильных статистических сополимеров в раствор или пленку лецитина (интересные реалогические свойства и экстремальная зависимость 0a=f(CBMc)) побудили нас детально исследовать состояние и свойства ленгмюровских монослоев сополимера, его смесей с лецитином при концентрациях ВМС ниже точки кроссовера, а также условия и физико-химические закономерности формирования монослоев. 3.2.1. Монослои амфифильных сополимеров и их смесей с лецитином на водной субфазе На рис/ 3.8, 3.9 приведены изотермы поверхностного сжатия 7i=f(A0) для монослоя яичного лецитина (чистота 98% 1-олеил-2-пальмитоил-зп-фосфатидилхолина) и смесей с сополимерами Ст-ЫВПД (т2=0.5) и Ст-4ВП(пъ=0.9) . Экстраполяция на значение 71=0 позволяет оценить молекулярную площадь лецитина А0=0.54нм" (рис.3.8 кривая 1). Теоретический расчет площади, занимаемой двумя плотно-упакованными гидрофобными цепями лецитина (модель щетки), дает величину А0=0.41нм".
Однако, в реальных условиях молекула лецитина в монослое содержит адсорбированную воду в своей полярной части. Поэтому общепринятым значением для плотно -упакованного лецитинового монослоя является величина А0=0.52-0.56 нм [6]. массовом соотношении компонентов 100:3 на водной субфазе при Т=298К; сплошной линией обозначен прямой процесс (сжатие); обратный (растяжение). Принципиально иной характер имеют изотермы сжатия смесей лецитин - сополимер (рис.3.8 кривая 2, рис.3.9). На кривых 7F=f(А0) можно отметить две области, разделенные плато, различающихся по параметру сжимаемости р = — .В последнем случае экстраполяция величины А() в I и во II областях СІЛ равны (1.1±0.15)нм и (0.90±0.05)нм , соответственно. Рассчитанные величины параметров сжимаемости (3-(0.2 -0.7)-10 Н/м в обеих областях изотермы сжатия позволяют рассматривать фазовые состояния монослоев как «жидко-твердые» пленки, предполагающие включение воды, связанной связями с полярными группами (со)полимера, в состав пленки. Переходная область, соответствующая двухмерному фазовому переходу (т.е. переходу к плотно упакованному монослою), сопровождаемому вытеснением части гидратационной воды, более четко выражена для смесей лецитина с (со)полимером Ст-4ВП (ггь=0.9) (рис.3.9). Влияние сополимера на удельную площадь А0 более ощутимо в первой области. Во второй области возможны конформационные изменения полимерной цепи и изменения структуры монослоя, однако существенного вклада в величину А0 они не вносят и эффективная молекулярная площадь также значительно увеличивается по сравнению с А0 для лецитинового мономолекулярного слоя на границе раздела вода - монослой. Отсюда можно сделать вывод о том, что макромолекулы сополимеров иммобилизуются упомянутым слоем. На это же указывают заметно меньшие величины поверхностного давления, отвечающего коллапсу мономолекулярного слоя лецитина при малых добавках сополимера. Состояние монослоев смесей лецитина и сополимеров при массовом соотношении компонентов 100:3 практически не зависит от условий формирования монослоя на водной субфазе.
В области поверхностных давлений от 0 до 30мН/м практически отсутствует гистерезис сжатия, что следует из практического совпадения кривых сжатия и обратного ему растекания, количество вещества и объем наносимой пробы (т.е. количество хлороформа) мало влияют на вид изотермы сжатия (табл.3.5.). Поскольку эффект значительного увеличения удельной площади проявляется при малых концентрациях ВМС в монослое, то в следующих опытах было изучено влияние концентрации раствора сополимера, его абсолютного количества и объема, наносимого на водную подложку, на изотермы сжатия. На примере сополимера Ст-МВПД (пі2=0.5) показано, что при уменьшении концентрации раствора сополимера, наносимого на субфазу, существенно возрастает удельная площадь ВМС в монослое - от 0.34 до 30.5 нм7звено (таблица 3.5., рис.3.10. а, б, в). Результаты данных исследований свидетельствуют о наиболее сильном влиянии сополимеров в лецитиновои пленке на энергетические свойства в области малого и сверхмалого относительного содержания ВМС. Принимая во внимание тот факт, что осаждение пленок осуществлялось из сильно-разбавленных растворов лецитина при крайне низком относительном содержании полимера в смеси (0.01-1%), необходимо учесть характерные изменения в природе растворов полимеров, происходящие с изменением их концентрации. Наиболее простым и информативным методом для оценки последнего является вискозиметрия. 3.2.2. Вязкость сильно разбавленных растворов сополимера Ст-NBnA Используемые в наших опытах концентрации сополимера существенно ниже точки кроссовера (порядка 0,1%-1% в зависимости от М.М.), которая разделяет растворы полимеров с изолированными клубками и взаимопроникновением последних. Отсутствие перекрывания клубков благоприятствуют их вытяжке и ориентации макромолекул при внешнем воздействии, например в потоке. Хорошо известно, что малые и сверхмалые добавки полимеров уменьшают вязкость жидкостей [84,85]. В этом случае вязкость растворов полимеров становятся меньше вязкости растворителя. Эффект связывают с разворачиванием полимерных клубков и ориентацией макромолекул по потоку, что способствует переходу от турбулентного к ламинарному течению [85]. Для объяснения описанного выше явления, были проведены две серии экспериментов. Во-первых, была измерена вязкость растворов сополимеров Ст-МВПД двух составов в широком диапазоне концентраций. Оказалось, что при малых концентрациях сополимера, вязкость растворов становится меньше, по сравнению с вязкостью растворителя (т/т0 1), при этом значения приведенной вязкости (числа вязкости) становятся отрицательными величинами. Так при концентрации полимера 0.05 - 0.5г/л найдены отрицательные и крайне низкие значения вязкостных характеристик: г]уі)/С(0.05л г"1) = -0.4л г"1; rjy) /С(0.5л -"" ) = -0.04л г"1 (табл.3.4). В области концентраций полимера 3 r/л числа вязкости приобретают положительное значение и соответствуют 0.33 л/г. Отметим, что лецитин снижает вязкостные характеристики изучаемых растворов.
Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул (липосом)
Везикулы или липосомы известны, главным образом, как замкнутые сферические структуры, внутри которых находится водное содержимое. Оболочка представляет моно- или мультиламеллярную мембрану липидов. При инжекции дисперсии везикул из микрошприца на подложку самопроизвольно образуются плоские бислойные мембраны или везикулярные структуры, потерявшие полностью или частично сферическую форму (диски, трубки, эллипсоиды и др.), но сохранившие наноразмерность. Наноразмерность везикулярных структур является их важнейшим свойством, препятствующим возможности закупорки капилляров (эмболии). Поскольку диаметр эритроцитов, которые свободно проходят через любые сосуды составляет 7мкм, то с учетом деформируемости везикул считается безопасным размеры частиц меньше 1мкм. Для пассивной доставки лекарственного вещества немаловажным является соотношение размеров наночастиц и диаметра пор капилляров. Так как размер наночастиц больше диаметра пор капилляров, их объем распределения ограничивается компартаментом введения. Например, при внутривенном введении, они не выходят за пределы кровотока, т.е. должны плохо проникать в органы и ткани. Это свойство может служить основой для направленной доставки противоопухолевых препаратов в крупные опухоли и очаги воспаления, так как полимеры, снабжающие эти области, как правило, сильно перфорированы (рис.3.13.) [87]. Следовательно, наночастицы будут накапливаться в опухоли. Это явление получило название пассивного нацеливания, в результате которого отмечаются: уменьшение токсичности; уменьшение объема распределения и, вследствие этого, увеличение концентрации везикул в кровотоке; Таким образом, основной проблемой создания везикулярных частиц (липосом) является их невысокая термодинамическая (агрегати вная) устойчивость при хранении и низкая кинетическая устойчивость наночастиц в организме. Повышение агрегативной устойчивости заключается в предотвращении слияния наночастиц. Обеспечение кинетической устойчивости осуществляют стерической защитой полимерными цепями, создающими избыточное осмотическое давление в примембранном пространстве. Если рассматривать везикулы, как липосомальную лекарственную форму, то необходимо учитывать также высокую токсичность лекарственных веществ, для которых создается данная лекарственная форма.
Одним из приемов снижения токсичности липосомальной формы лекарственных веществ является введение его в оболочку везикулы (мембрану), что способствует максимальному снижению концентрации вещества во внутреннем объеме везикулы. Введение лекарственного вещества может быть за счет его комплексообразования с компонентами мембраны, физической и химической адсорбции лекарственного вещества на внешней или внутренней стороне мембраны. 3.3.1. Агрегативная устойчивость везикулярных систем В настоящей работе рассмотрена возможность стабилизации везикулярных структур (повышение агрегативной устойчивости при хранении и кинетической устойчивости в организме) введением в систему амфифильных статистических сополимеров. Совокупность рассмотренных данных (раздел 3.1.2, 3.2) указывает на иммобилизацию сополимеров с гидрофобно-гидрофильными звеньями, в особенности ионогенных сополимеров в би- и монослой лецитина. Стоило ожидать, что это обстоятельство найдет отражение при визуализации везикул лецитина. Из данных, полученных методом атомной силовой микроскопии видно, что в ряду изучаемых сополимеров наилучшие результаты были достигнуты с использованием сополимера Ст-4ВП (т2=0.9). Из рис. 3.15 видно, что в отсутствие сополимера наблюдаются следы слияния везикул. В присутствии малого количества сополимера в смесевой пленке, близкого к тому, что соответствует минимуму на кривых зависимости углов смачивания от состава смеси сополимер - ПАВ, следы слияния везикул практически отсутствуют. Особенно ярко этот эффект выражен для смеси лецитин - сополимер стирол - ВП. Видно, что присутствие данного сополимера полностью исключает следы слияния везикул, т.е. в максимальной степени стабилизирует везикулы. Можно полагать, что в данном случае фрагменты ламеллей лецитина армированы цепями амфифильных ионогенных сополимеров, как это было постулировано в работе [89] по отношению к полимер-коллоидным комплексам синтетических ПАВ с полиэлектролитами. Следует также отметить, что независимо от метода формирования (метод обращения фаз или получение на подложке) преимущественно образуются везикулы с размерами от 0.1 до 0.3мкм (малые и большие), т.е находятся в «нано» диапазоне (рис.3.15). При большой массовой концентрации сополимера в смешанной пленке образуются большие олигомерные везикулы с размером О.Ы.Омкм (рис.3.15.). Из данных рис.3.15. видно, что при большой массовой концентрации ВМС в ряде случаев теряется везикулярная структура системы. Кроме того, она становится неустойчивой, наблюдается агрегация частиц. Не исключено, что такое слияние обусловлено дополнительным электростатическим взаимодействием ионогенных звеньев ВМС, а также возможными межмолекулярными взаимодействиями ВМС и лецитина. Для изучения механизма введения доксорубицина (ДР) на поверхности везикулярных частиц нами изучена адсорбция ДР на поверхности тонкой пленки амфифильного сополимера и на поверхности везикулярных структур из водных растворов ДР. Везикулярные структуры на основе сополимера и лецитина получали методом обращения фаз с последующим инжектированием наноразмерной дисперсии через хроматографический шприц на стеклянную сухую подложку. Тонкий слой на подложке высушивали под вакуумом в среде аргона.
Подложку с липидно-полимерными везикулами выдерживали в растворах ДР различной концентрации в течение нескольких часов. Величину эффективной удельной адсорбции ДР рассчитывали по формуле: С%. и Сл/, - начальная и равновесная текущая молярная концентрации, устанавливаемые методом электронной спектроскопии по полосам 480 и 500нм (реперные полосы ДР) в соответствии с калибровочным графиком; А - площадь поверхности подложек, на поверхность которых адсорбировался ДР; V - аликвота (л). На примере системы лецитин - полимер Ст-4ВП (т2=0.9) при массовом соотношении 100:5 рассчитанная величина А ф. для липид-полимерной пленки равна 8.3-10" моль-см"". Показано, что ДР почти не адсорбируется на поверхность лецитина АЭфф = 1-10"13моль-см"2 и этой величиной можно пренебречь. В этом случае величину А- ф. (=8.3-10" моль/см"") можно отнести за счет адсорбции ДР на поверхность полимера. Более детально процесс адсорбции был исследован на поверхности тонкой пленки сополимера. В качестве примера был выбран сополимер Ст-ИВПД (т2=0.5), имеющий неионогенное физиологически активное звено, и представляющий интерес для медицины. Исследование адсорбции ДР на поверхности тонкой пленки СлЧЧВПД было проведено на основе анализа зависимости поверхностного натяжения от концентрации у=ґ(Сдр) в растворе до и после адсорбции, а также изучением изотерм смачивания 0а=А(Сдр). На рис.3.16. представлены изотермы поверхностного натяжения у=ґ(Сдр) до и после адсорбции. Расчет эффективной удельной адсорбции ДР на границе раздела «раствор -воздух» был выполнен графическим решением уравнения Шишковского. Рассчитанная величина Гтах=1.31-10" моль/см была определена по значению коэффициента b RTTmax в области концентраций ДР в координатах у0 у = ДІпС) в области средних концентраций. Го-у = ЪЩАС + \) (3.25), где b =rmax-RT, А -эмпирический коэффициент, определяющийся природой жидкой поверхности; R - универсальная газовая постоянная, Я=8.31Дж/К-моль; Т-температура, К. Величина Гтах=1.31-10" моль/см была определена по значению коэффициента Ь ЯТГтахв области высоких концентраций ДР. Величина эффективной адсорбции АЭфф. ДР на поверхности Ст-КВПД, вычисленная по формуле (3.24) равна Аэфф =Г (3.7±0.1)10" моль/см . Изучение зависимости 9а=ДСдр) на низкоэнергетических поверхностях полимеров позволяют рассчитать абсолютную адсорбцию по Гиббсу на границе раздела твердое тело - раствор [90], используя уравнение Юнга:
