Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Водорастворимые полимерные кислоты (анионные полиэлектролиты) и их биологическая активность 7
1.1.1. Полимерные кислоты живой природы 7
1.1.2. Синтетические полимерные кислоты 14
1.2. Предпосылки модуляции биоселективности полианионов путем введения в их макромолекулы алициклических структур 23
1.2.1. Стероид-подобные алициклы 23
1.2.2. Каркасно-сочлененные алициклы 31
2 Цель, задачи и объекты исследования 38
2.1. Цель и задачи исследования 38
2.2. Принципы макромолекулярного дизайна и объекты исследования 39
2.3. «Базовые» полимерные матрицы и их производные 41
2.4. Выбор алициклических модуляторов 42
3. Синтез полимерных и модельных соединений 44
3.1. Синтез полимерных карбокси- и сульфокислот 45
3.1.1. Поликислотные производные декстрана 45
3.1.2. Поликислотные производные сополимера малеинового ангидрида 48
3.2. Введение в макромолекулы алициклических структур 53
3.2.1. Синтез функциональных производных алициклов 53
3.2 Аминопроизводные моноциклических углеводородов 53
3.2.1 Холестенамины 54
3.2.2. Полимераналогичная модификация декстрана 59
3.2.3. Модификация сополимера малеинового ангидрида 60
3.3. Синтез и использование «модельных» соединений 69
3.4. Подготовка полимерных образцов для биологических испытаний 73
4. Структурно-зависимая модуляция биоселективности макромолекул 74
4.1. Цитотоксичность 75
4.2. Противовирусная активность и уровень ее селективности 78
5. Экспериментальная часть 83
5.1. Подготовка исходных реагентов и растворителей 83
5.2. Синтез аминов и модельных соединений 86
5.3. Синтез сополимера малеинового ангидрида 94
5.4. Полимераналогичные превращения 95
5.5. Методы исследования 97
Выводы 100
- Предпосылки модуляции биоселективности полианионов путем введения в их макромолекулы алициклических структур
- «Базовые» полимерные матрицы и их производные
- Введение в макромолекулы алициклических структур
- Синтез и использование «модельных» соединений
Введение к работе
Развитие новых подходов для создания биоселективных макромолекулярных систем медицинского назначения является одной из наиболее востребованных и интенсивно развивающихся областей современной науки и технологии высокомолекулярных соединений (ВМС).
В качестве иммуномодуляторов, микробицидов и противовирусных агентов наибольший интерес представляют синтетические и полусинтетические полиэлектролиты. Повышенный интерес к этому классу ВМС возник во второй половине прошлого столетия в связи с открытием способности многих природных, полусинтетических и синтетических полимерных кислот (полианионов) подавлять развитие вирусных инфекций. Это дало мощный стимул к развитию и интеграции исследований на стыке химии ВМС-поликислот и смежных медико-биологических наук. Исследование причин и механизмов противовирусной активности полимерных кислот и их взаимосвязи с химической структурой ВМС с одной стороны стимулировало химический синтез новых полимерных кислот разнообразной структуры, а с другой - детальное изучение их свойств и физиологической активности.
Полученные и экспериментально подтвержденные знания указывают на высокий потенциал поликислотных ВМС в качестве индукторов вируцидных форм интерферона, стимуляторов функционально-активного состояния иммунокомпетентных клеток и сопряженных с ними факторов иммунитета, а также в качестве агентов прямого электростатического воздействия на вирусы. Установлено, что фармакологически ценные свойства полиэлектролитов и полимерных кислот в частности определяются макромолекулярной кооперацией электрически заряженных (анионных или катионных) групп и их многоточечным воздействием на биологические мембраны и рецепторы.
5 Иммуномодуляционные свойства синтетических полимерных кислот уже сегодня находят применение в официальной медицинской практике, как на уровне препаратов - индукторов интерферона и общеукрепляющих иммуностимуляторов, так и в области разработки более сложных препаратов - искусственных противовирусных вакцин нового поколения. Кроме того, в последние годы огромный интерес и широкие клинические испытания акцентированы на продуктах химии полимерных кислот применительно к критически актуальным задачам создания специализированных микробицидов прямой защиты кожных и слизистых покровов человека в целях профилактики и лечения ВИЧ-инфекционного заболевания СПИД, гепатитов и других опасных вирусных заболеваний, передающихся от человека к человеку.
Однако, один лишь электростатический фактор ионных функциональных групп полимерных кислот не обеспечивает достаточно высокой биоселективности противовирусного действия, существенно ограничивая возможности эффективного и безопасного применения синтетических полиэлектролитов в медицинской практике.
В этой связи особую актуальность приобретает разработка новых
стратегий макромолекулярной трансформации полиэлектролитов в более
совершенные «комбинированные» формы, в которых фактор
электростатячески-обусловленной («монофункциональной»)
избирательности был бы синергически усилен дополнительными факторами структурно-специфических и гидрофобных воздействий на биологические мишени. С учетом имеющегося теоретического и экспериментального задела в этой области данная диссертационная работа акцентирована на развитие именно этого направления научного поиска.
Белее детальное представление о современном состоянии проблемы изложено в обзоре литературы (глава I). Глава II посвящена постановке цели и задач, обоснованию принципов макромолекулярного дизайна и
выбору объектов собственных исследований. В главе III описан полимерный и полимераналогичныи синтез новых ВМС (а также промежуточных алициклических модификаторов и модельных соединений). Исследованию закономерностей структурно-зависимой модуляции противовирусной биоселективности новых полимерных продуктов посвящена глава IV.
Предпосылки модуляции биоселективности полианионов путем введения в их макромолекулы алициклических структур
Повышенный интерес к фармакологически ценным свойствам полимерных кислот стимулировал интенсивные исследования, которые позволили выявить и иные механизмы усиления полимерными кислотами сопротивляемости клеточных организмов к вирусным инфекциям. Многие полимерные кислоты оказались не только индукторами интерферона, но и более широкопрофильными модуляторами клеточных факторов иммунитета: роста, миграции и функциональной активности различных иммунокомпетентных клеток: макрофагов, В- и Т-лимфоцитов, стимуляторами продукции антител и иммуноадъювантами, усиливающими эффективность противовирусных вакцин (см. таблицу 3). Однако в отличие от индукции вируцидного интерферона (биоспецифической иммунной реакции против чужеродного генома вирусов) в отношении остальных вышеперечисленных видов биофункциональной активности было экспериментально установлено, что электростатический фактор отрицательного заряда макромолекулы (т.е. «поликислотность») не является исключительно существенным. Как было установлено, аналогично высокой эффективностью иммуностимуляции (кроме индукции интерферона) обладают не только анионные полиэлектролиты (поликислоты), но и полиэлектролиты всех других типов: положительно заряженные поликатионы (полиоснования) [69, Ш], например [112]: Аналогичную активность проявляют и комбинированные - амфолитные полиэлектролиты [113-15], или интерполимерные полиэлектролитные комплексы разноименно заряженных макромолекул [63]. Молекулярно-функциональная основа этого явления связана со способностью полиэлектролитных ВМС стимулировать электрически- восприимчивые поверностно-мембранные и межклеточные процессы. Реализация этих свойств на уровне контактов ВМС-полиэлектролитов с иммунокомпетентными клетками приводит к модуляции быстродействия и (или) амплитуды соответствующих иммунных реакций [112]. В частности, способность полиэлектролитов усиливать продукцию антител и эффективность вакцин [37,81,88,1 J 2] (замещая, в частности, антиген-презентационную функцию «хелперных» Т-лимфоцитов [112]) легла в основу мощного научного направления на стыке химии ВМС и медицины -создания нового поколения высокоэффективных синтетических вакцин [71, 112, 116]. Однако, несмотря на примерно эквивалентную эффективность как поликислотных, так и полиосновных и полиамфолитных иммуно-модуляторов, положительно заряженные ВМС следует признать наименее перспективными для медицинского применения в непосредственном контакте с организмом человека.
Дело в том, что как было показано выше, поверхность функционально нормальных клеток несет избыток отрицательного заряда, и введение положительно заряженных (поликатионных) ВМС приводит к наиболее значительным нарушениям электростатического баланса клеток. Это, в свою очередь, сопряжено с существенно более высокими уровнями цитотоксичности поликатионов по сравнению с анионными или амфолитными полиэлектролитами [1]. Сравнение же относительных перспектив полиамфолитов и полианионов в плане противовирусных агентов приводит нас к предпочтению анионных полимерных кислот. Во-первых (как подробно обсуждено выше) макромолекулы, генерирующие на своей поверхности именно отрицательный заряд, в отличие от остальных полиэлектролитов, способны к индукции интерферона - важнейшего фактора противовирусного иммунного ответа. А во-вторых, с учетом электростатической структуры самих вирусов (избытка положительного заряда на их поверхности, см. выше), именно полианионные (кислотные) ВМС обладают максимальным электростатическим потенциалом эффективного связывания - нейтрализации вируснвгх частиц. Последнее обстоятельство весьма актуально в связи с недостаточной эффективностью применения в современной медицине только иммуно-модулирующих технологий без прямого воздействия на вирусы и процессы их проникновения в клетки2. Электростатически-иейтрализующее воздействие ВМС-поликислот на вирусы и процессы их проникновения в клетки. Многие природные и синтетические имитаторы отрицательного заряда клеточной поверхности - полиэлектролитные ВМС анионного (кислотного) типа - проявили себя как эффективные конкуренты клеток за адсорбцию вирусных частиц. Как показали эксперименты с полиметакриловой кислотой, а затем и со многими другими полимерными анионами, электростатическое взаимодействие ВМС с вирионами предотвращает или замедляет процессы адсорбции вирионов на клеточных поверхностях [46,117-120].
В дальнейшем способность в той или иной степени препятствовать вирусной адсорбции вирусов на клетках была обнаружена для широкого спектра самых разнообразных отрицательно заряженных полимеров: 1) поликарбоновых кислот - карбоксилироеанных альбуминов [121-124], полиакриловой и полиметакриловой кислот [124-126], и др. [126,127]; 2) полифосфонатов -синтетических полинуклеотидое [124]; 3) полисульфатов и поли-сульфонатов - каррагинанов [128], сулъфатированных производных декстрана и декстрина [117-119,129-131], сулъфатированного галактаиа [132], курдлан сульфата [133], гепарина [118], сульфата целлюлозы [ 134,135], частично этерифицироеанной полидиманделовой кислоты (SAMMA) [136], сульфатированных политирозинов [137], сулъфатированого поливинилового спирта [124], поли(стирол-4-сулъфонат.а) [124,126),138], нафтолсульфонат- содержащих полимеров [126,139-141 ] и др. [124,126,142,143] Среди вирусов, взаимодействие которых с клетками подавляется полимерными кислотами, описаны: вирусы гриппа [129], простого герпеса [128,140], папиломавирусы [124], цитомегаловирус [124] и др. Особый интерес указанные свойства полимерных анионов вызывают именно в связи с проблемами защиты от ВИЧ-инфекции (СПИДА), а также гепатита, герпеса и других вирусных инфекций, передаваемых половым путем. Поэтому в последние годы полимерные анионы оказались в эпицентре внимания международных разработок «микробицидов» внутривагинального и иного защитного применения [144-145]. На различных стадиях доклинических и клинических испытаний находятся сегодня десятки композиций, основанных на собственной активности синтетических полианионов: каррагинананы [128,1.46], сульфат целлюлозы [77], декстран сульфат [147], полиакриловая кислота [126], поли(стирол-4-сульфонат) [126,135], нафтолсульфонат содержащие полимеры (PRO 2000) [126,135,140.141], полиметилен-гидрохинон сульфоиаты [Н7]: существу на образовании интерполимерных комплексов природных (вирусных) и искусственных ВМС-полиэлектролитов в водных растворах, носит обратимый характер. Поэтому рассматриваемое взаимодействие ВМС с вирионами (без дополнительного комплекса специфических связей) обычно не обеспечивает гарантированную блокаду вирусной интервенции, а лишь замедляет этот процесс [88]. Недостаточная эффективность противовирусной блокады, требует повышения рабочих концентраций полимерной кислоты для достижения желаемого терапевтического эффекта - зачастую до уровней, приближающихся к концентрационному порогу цитотоксического действия ВМС в отношении защищаемых от вирусов клеток. Так, на примере одного из наиболее активных представителей синтетических полимерных кислот -гидролизованиого сополимера малеинового ангидрида и дивинилового эфира (схема 1-2, структура (М9)) электростатическое подавления абсорбции вирионов ВИЧ-1 на мембране экспериментальных лимфоидных клеток (МТ4) было зарегистрировано при концентрациях 100 мкг/мл, тогда, как пороговые концентрации 50% цитотоксической безопасности («цитотоксичность») составляли -1500 мкг/мл. Это обеспечивало индекс селективности противовирусного действия данной полимерной кислоты на этапе абсорбции не более 1500/100= 15 [88].
«Базовые» полимерные матрицы и их производные
В качестве «базовых» полимерных матриц для полимераналогичного синтеза на их основе новых ВМС были выбраны два типа полимерных объектов (схема ЇІ-5): 1) типичный представитель природных водорастворимых полимеров полисахаридного ряда - декстран (Ш) и 2) синтетический продукт радикальной чередующейся циклосополи-меризации малеянового ангидрида с дивиниловым эфиром (П2), гидролизов анная поликарбоксилатная форма которого (ГО) также прекрасно растворима в водных (в том числе в физиологических) средах. Согласно данным предшествовавших исследований П1 и ПЗ, в области молекулярных масс (ММ) до 30-50 кДа характеризуются низкой токсичностью в отношении клеток человека и животных (ТС501 порядка 1000-2000 мкг/мл [данные НИФЗ]). Полисахаридный остов Ш подвержен биодеструкции, что может быть полезным для более быстрого выведения его производных из организма. С другой стороны, устойчивость к ферментам синтетической полимерной основы П2/ПЗ предпочтительнее для обеспечения стабильности как структуры (в т.ч. ММ), так и всего комплекса функциональной активности производных П2/ПЗ. Исходный неионный полисахарид Ш не проявляет каких-либо признаков специфического противовирусного действия, тогда как синтетический анионный пол икар бокси лат ПЗ широко известен и описан в литературе (включая результаты предшествовавших исследований ИНХС РАН и НИФ Здоровья) в качестве стимулятора реакций иммунитета, в т.ч. индуктора вируцидных форм интерферона (глава I). Однако указанные иммунные реакции являются лишь «ответными», укрепляя сопротивляемость целостного организма (in vivo), но на уровне клеток (in vitro) они не обеспечивают селективной защиты от проникновения вирусных паразитов (инфицирования). Сами же макромолекулы Ш и ПЗ, как было показано ранее [88], также не способны к прямой блокаде проникновения вирусов в клетки. В целях исследования возможностей химического регулирования электростатического фактора противовирусной эффективности базовых ВМС запланирован и ввгаолнен (глава Ш) синтез полиэлектролитных производных с более ввіраженной анионной активностью - за счет варьирования кислотных групп различной анионогенной силы (карбоксикислотные: изолированные -COOH/Na, вицинально- кооперированные -CH(COOH)-CH(COOH/Na)-; сульфокси-кислотные -S02OH/Na и их смешанные композиции) в составе производных Ш-ПЗ.
Второе стратегическое направление усиления противовирусного потенциала исследуемых макромолекул - рациональная модификация антициклическими структурами. 2.4. Выбор алициклических модуляторов Выбор модификаторов структуры полиэлектролитов в качестве потенциальных модуляторов их биоселективности и синергистов противовирусной активности основан на анализе литературных данных о противогриппозном действии низкомолекулярных производных норборнана (АЇ) и адамантана (А2) (препараты дейтифорин, амантадин, ремантадин и др.), и позитивных результатах предшествовавших исследований [ИНХС РАН, НИФ Здоровья], обнаруживших мощный потенциал усиления противовирусной активности в условиях макромолекулярной кооперации указанных каркасных структур на базе ряда поликарбоновых кислот. В развитие этих исследований в данной работе акцентировали внимание на расширение диапазона исследуемых алициклических и родственных (фенильных) структур, как в сторону более простых моноциклических аналогов (АЗ-А5), так и сложных полициклических, но сочлененных не по каркасному принципу (А6, А7). В последнем случае особый интерес представляют аналоги и производнвіе холестерина, поскольку, согласно современным литературным данным, именно холестерин- обогащенные микродомены - «платформы» ("raft") клеточных мембран являются эпицентрами повышенного риска паразитической интервенции в клетку не менее 80% известных вирусов человека, включая ВИЧ-возбудитель СПИДа (см. обзор литератур].і). В задачи работы входило варьирование не только алициклических структур, но и природы реакционных центров модификации макромолекул (Ш-Ш9), а также структуры промежуточных «спейсерных» мостиков. Это потребовало целевого решения промежуточной задачи - разработки схем синтеза соответствующих функциональных производных алициклов А1-А7. Практическая реализация целенаправленного синтеза в рамках поставленных задач и выбранных объектов исследования, представлена в главе III. В соответствии с целевыми установками (глава 11) выполнение указанных этапов требовало разработки рациональных схем синтеза, учитывающих специфику и биофункциональную ориентацию изучаемых ВМС-объектов, обеспечение чистоты продуктов, анализа их состава и структурных параметров с применением методов аналитической химии и спектроскопии. Кроме того, имелась необходимость обеспечения для конечных ВМС-продуктов хорошей (быстрой) растворимости в водных средах, а в ряде случаев - учета гидролитической или термической устойчивости промежуточных реагентов и конечных продуктов. Декстрин (Ш). В работе использован коммерческий продукт фирмы Pharmacia, ММ = 10 000. В качестве реакционных центров для проведения целевых полимераналогичных модификаций рассмотрены окси- группы.
При умеренных степенях конверсии полимераналогичной модификации подвержены ОН-группы преимущественно в положении 3 пиранового цикла, как наиболее пространственно доступные и реакционно-активные [216]. Модуляцию полиэлектролитных свойств Ш осуществляли по трем направлениям полимераналогичного синтеза: 1. этерификация окси- групп декстрана янтарным ангидридом с получением поликарбоновой кислоты, 2. карбоксиметилирование окси- групп хлоруксусной кислотой также с получением карбокислотного производного, 3. сульфоксиэтилирование окси- групп 2-бромэтилсульфокислотой - с получением полисульфокислотного продукта см. схему 6 Для получения полностью синтетических полимерных кислот не полисахаридной природы в рамках данной работы был использован полиангидрид - предшественник. Сополи(малеиновый ангидрид-черед-дившшлоеый эфир) (ГО) Синтез опытных образцов ГО осуществляли методом радикальной циклосополимеризации в бензоле или хлороформе в присутствии инициатора 2,2 -азо-бис-изобутиронитрила (схема 7). В целом была использована методика, описанная ранее [106], но впоследствии отработанная в ИНХС РАН и приводящая, как показали спектральные исследования [ПО], к «фурановой» модификации, которая наиболее активна в качестве индуктора вируцидного а-интерферона [88]. Наличие в структуре ГО ангидридных циклов, определяет его высокую гигроскопичность и гидролитическую лабильность, и если не принимать дополнительных мер, получаемый продукт содержит заметные количества гидролизованыых звеньев ПЗ. Это является существенной проблемой при последующем проведении целевых модификаций в тех случаях, когда гидролитической конверсии ГО в ПЗ предшествуют реакции с окси- или амино-реагентами (см. далее). Поэтому в данной работе все операции, включая подготовку реагентов, синтез, выделение, очистку полимерного продукта и его хранение, выполнены в условиях исключающих доступ влаги: в инертной атмосфере (Аг, бокс) или в вакууме [218]. ИК-спектр полученного сополимера характеризуется отсутствием признаков адсорбированной влаги или гидролиза, если подготовку образца для ИК-спектроскопии также проводить в сухой инертной атмосфере (в боксе). Напротив, кратковременная (2-3-х минутная) экспозиция образца на воздухе приводит к появлению интенсивной полосы поглощения адсорбированной влаги, 3300-3600 см"1 (V0-H, Н20), появлению плеча в области 1730 см"1 (vc=0, СООН), и приросту интенсивности поглощения при 1630 см" ((5о-н, ЬЬО) - см. рис. 6.
Введение в макромолекулы алициклических структур
С учетом необходимости регулирования дистанции и пространственно-конформационных параметров ковалентного связывания алициклов с полимерным остовом с использованием промежуточных «спеисерных» мостиков потребовалось целевое решения промежуточной задачи -разработки схем синтеза соответствующих функциональных производных алициклов. 3.2.1. Синтез функциональных производных алициклов Аминопроизеодные моноциклических углеводородов Синтез 2-циклопентилэтиламина (A3 " ) и 2-циклогексилэтиламина (А4" ) осуществляли из бромциклопентаиа и циклогексил-иара-толуолсульфоната согласно схеме 9, с общим выходом 22% и 14%, соответственно. Принятые и реализованные в данной работе схемы синтеза позволяли варьировать длину «спейсерного» мостика в интервале: -(CH -, п= 1-3 [219], который дополняется наличием коммерчески доступных аналогов с п =0. Холестенам ины Для получения аминопроизводных холестерина первоначально предполагалось использовать окси- группу холестерина в алкоголятной форме в целях поэтапной модификации в конечные аминопроизводные продукты, например по схеме, успешно применявшейся для аналогичной модификации других спиртов (схема 11) Однако, уже на первом этапе запланированного синтеза в среде абсолютного диметилформамида, в присутствии щелочных агентов КОН или NaOH, а также хлоруксусной кислоты (в качестве потенциального карбоксиметилирующего агента) даже при повышении температур до 80С карбоксиметияирование холестерина не наблюдалось. Вместо образования целевых продуктов из реакционной смеси практически количественно выделялся исходный холестерин. При дальнейших попытках получения реакционно-активного алкоголята холестерина прямым действием металлического натрия на расплав холестерина при 110-120С получить целевой реагент таюке не удалось. Наблюдалось количественное восстановление эндоциклической двойной связи с превращением холестерина в насыщенный холестановый аналог (Ш 50). Этот факт был четко зарегистрирован методами хромато-масс-спектрометрии (молекулярный пик m/e 388). Такое химическое поведение холестерина, обусловленное, очевидно, нестабильностью алкоголятов и присутствием также достаточно лабильной эндоциклической двойной связи, создавало существенные препятствия для дальнейшего количественно-селективного синтеза по целевому направлению.
В этой связи нами были разработаны и реализованы альтернативные подходы к синтезу аминолроизводных холестенового ряда по двум основным «синтетическим маршрутам»: через кето-производное холестерина, либо прямым замещением окси- группы аминореагентами. Так, аминопроизводное холестерина, не содержащее промежуточного «спейсерного» мостика, 4-холестен-За,р-амин (A7"0-N) получен в три стадии (схема 12) из 5-холестен-3[3-ола (холестерина) с общим выходом 73%, в результате последовательного его окисления до кетона (ЇЇЇ-5 J) (по Оппенауэру), получения оксима (Ш 52) и восстановления последнего до амина. А для получения аминопроизводных со вставкой между холестеновым алициклом и концевой аминогруппой промежуточных «спейсернвіх» мостиков различной длины использован второй синтетический подход. N-(3-аминопропил)-5-холестен-За,р-амин (A7 N"3"N) и ]М-(8-аминооктил)-5-холестен-За,р-амин (A7 N_8"N) получали алкилированием 1,3-Диаминопропана и 1,8-диаминооктана 5-холестен-3(3-олом в присутствие никеля Ренея с выходом 92% и 94%, соответственно (схема 13). Приведенные схемы синтеза позволяли получить аминопроизводные холестерина, в которых терминальная амино- группа, предназначенная для ковалентной «прививки» к полиангидридам (см. ниже), соединена с холестеновым алициклом через «спейсериые» мостики различной длины (А7 N"3"N, ATN"8"N), либо вовсе без такого мостика (AT14"0"1"). В дополнение к холестеновой группе в поле исследований был включен и более простой и доступный амин - производное абиетиновой кислоты (A6" "N). Кроме вышеописанных аминопроизводных моноциклического, абиетинового и холестенового ряда, в данной работе выборочно использованы также [218-221] производные каркасных алициклов -норборнана, норборнена и адамантана, ранее изучавшиеся, как базовые модуляторы противовирусной активности полимерных кислот карбоксилатного типа [88]. В качестве контрольной группы мы использовали хорошо зарекомендовавшие себя в качестве модуляторов противовирусного потенциала в основном аминометиленовьте продукты, и адамантанкарбонилхлорид, но для синтеза новых - ранее не исследовавшихся производных полимерных кислот (см. ниже).
Таким образом, в конечном итоге мы располагали достаточно широким набором алициклов, как с варьируемой структурой алициклической части (моноциклы, би- и трициклы каркасные и полициклы, сочлененные, но не по каркасному принципу - производные абиетина и холестерина), так и с регулируемой удаленностью амино- группы от алицикла [218-223]. 59 3.2.2. Полимераналогичная модификация декстрана Модификацию кислотных производных полисахарида Ш алициклическими структурами апробировали на примере адамантана -одного из наиболее эффективных фармакофоров противовирусной активности, из числа ранее изученных на примере других поликарбоксилатов. Здесь был использован адамантанкарбонилхлорид для этерификации оксигрупп Ш или продуктов его модификации П4 и П6 в присутствии триэтиламина в диметилсульфоксиде (схема 14): Структура полученных продуктов модификации подтверждена данными ИК-спектроскопии, а степени модификации, рассчитанные из данных элементного анализа, составляют: а2о ац 0.07-0.08 В отличие от декстрана и его производных для модификации сополимеров малеинового ангидрида наиболее удобны ангидридные реакционные центры полимера с применением амино- или окси- реагентов. Поэтому основными направлениями синтеза были избраны реакции амино-или окси-производных алициклов с ангидридными циклами исходного полиангидрида П2, либо его частично кислотно-модифицированных продуктов П8-П12 или П18 (но не гидролизованных аналогов - ШЗ-П17 и П19). В случае частично кислотно-модифицированных полимеров ГТ8-П12, Ш8 предварительно введенные в макромолекулу кислотные функциональные группы нейтрализовали противоионами (Na1 , Li+ или ЮҐ Еіз) - более сильными, чем используемые аминопроизводные алициклов. Синтез проводили в гомогенных средах апротонных полярных, растворителей (экспериментальная часть). И лишь после завершения алициклической модификации в неводных средах осуществляли второй этап - исчерпывающий гидролиз оставшихся ангидридных центров, получая по общей схеме 15 конечные водорастворимые продукты, представленные в таблице 4. Состав и структура продуктов синтеза исследованы стандартными методами аналитической химии и спектроскопии (ИК, ЯМР, УФ). В частности, в ИК-спектрах (рис. 9а) продуктов аминолиза полиангидридных форм по мере роста концентрации аминореагентов наблюдаются следующие превращения: 1) исчерпание ангидридных циклов, 1850 см", 1780 см", 2) образование амидных связей, 1640-1660 см"1 (полоса амид I), и 1540-1550 см"1 (полоса амид II), 3) образование карбоксильных групп, 1700-1730 см"1 и их связывание в аммониевые соли -СООН" +NHEt3, 1560-1570 см"1; 2450-2600 см"1, 4) рост характеристических полос алициклов - в зависимости от структуры конкретного модификатора.
Синтез и использование «модельных» соединений
Реакционными центрами модификации полимерной цепи синтетического полимера П2 и его производных являются структурные фрагменты янтарного ангидрида. Поэтому в качестве модельных соединений, имитирующих структурные фрагменты исходного сополимера и продуктов его полимераналогичных превращений, использованы янтарный ангидрид, янтарная кислота и соответствующие продукты их модификации [218]. Модельные соединения, включая специально синтезированные нами в рамках данной работы, использовались в дальнейшем для: 1) моделирования реакций модификации сополимера аминами, 2) моделирования структурных фрагментов полимерной цепи и их спектральных характеристик, 3) биологических исследований в качестве контрольных образцов -низкомолекулярных аналогов (таблица 6) В частности, на примере модельных соединений, аминолиза янтарного ангидрида аминометилен-: -бензолом, -норборнаном, -норборненом и -адамантаном, моделировались соответствующие модификации остатков 3,4-дизамещенного янтарного ангидрида в составе полимерных ангидридов П2, П8-П12, П18. А взаимодействие тех же аминов с янтарной кислотой моделировало аналогичные реакции остатков 2,3-дизамещенной янтарной кислоты в полимерной цепи гидролизов анных продуктов ПЗ и др.. Если в первом случае получались амидные, то во втором - только аммониевые продукты, которые были выделены, очищены и также рассматривались в качестве моделей - для спектральной идентификации и (или) для биологических испытаний. В основном, положение характерных спектральных полос модельных соединений отвечает интерпретации ИК- (ЯМР и УФ)-спектров полимерных продуктов. Однако более детальный анализ позволяет выявить закономерные микроструктурные различия. Так, кристаллический бензиламид янтарной кислоты характеризуется фиксацией траис-конфигурадии амидной связи (узкий интенсивный пик 3300 см" , (рис. 12), типичный для высококристалличных форм полиамидов [The Aldrich Library of Infrared Spectra]). А для синтезированных нами полимерных продуктов это не характерно [218]. Такого рода конфигурационная фиксация микроструктуры модифицированного звена сополимера препятствовала бы конформационной подвижности полимерной цепи в целом. Очевидно, что в данном случае при переходе от низкомолекулярного состояния вещества к высокомолекулярному энтропийная составляющая энергии полимерной макромолекулы становится более предпочтительной, чем стабилизация транс-конфигурации амидной группы, локализованная в пределах микроструктурных фрагментов остатков янтарной кислоты.
Тем не менее, положение важнейших характеристических полос поглощения vc=o основных типов образующихся функциональных групп в ИК-спектрах полимерных продуктов (рис.9) сопоставимо с таковыми в ИК-спектрах модельных соединений (рис. 12.), в частности: амидная группа (-CO-NH-) - 1640 см"1; карбоксильная группа (-СО-ОН) - 1690-1740 см" ; карбоксианион солевых форм (-СОО") - 1550-1620 см"1. Кроме указанных в таблице 6 низкомолекулярных аналогов исследуемых ВМС, в ряде случаев спектральной идентификации и особенно для контрольных биологических испытаний использовали водорастворимые хлоргидраты аминопроизводных алициклов. Биологические испытания предъявляют повышенные требования к чистоте и стерильности испытуемых соединений. Кроме того, желательно получение субстанции вещества в такой форме, которая обеспечивает быструю растворимость в водно-физиологических растворах. С учетом этого целевые и контрольные полимерные продукты (Ш, ПЗ-П7, П13-П17, Ш9-П32, П37-П58) проходили специальные процедуры многоэтапной очистки от низкомолекулярных примесей и выделения опытных субстанций: 1) последовательная экстракция хлороформом, а затем диэтиловым эфиром в аппарате Сокслета (в инертной атмосфере, предохраняющей от окисления), 2) удаление следов растворителя в высоком вакууме при 40-50С, 3) 3 - 4 цикла ультрафильтрации, обеспечивающие 103-104-кратную очистку полимера бидистиллированной водой от возможных водорастворимых примесей на селективных мембранах (фирмы Миллипор) с проницаемостью ММ 1-3 103, 4) при необходимости - стерилизация фильтрацией очищенного раствора через мембраны с порогом проницаемости ММ 100000, 5) выделение чистого образца в форме высокопористого и быстрорастворимого продукта лиофильной сушки. В целях предотвращения кислотного «шока», к которому мог бы приводить контакт полимерной кислоты с клеточными культурами, на завершающих этапах процесса полимерно-кислотные формы переводились в рН- нейтральные соли. В качестве противоионов использовали Na+, реже -Li+. Выбор предпочтительно Ш+-содержащих солей (из расчета на -50% карбоксильных и на 100% сульфокислотных групп) был сделан ввиду ранее описанных данных о минимальной токсичности и наилучшей иммуномодулирующй - противовирусной активности именно натриевых солей аналогичных полимерно-карбоновых кислот [88]. Результаты и анализ биологических испытаний представлены в следующей главе.
В ряду биометрических методов экспериментального изучения свойств химических соединений, в том числе ВМС, в данной работе были использованы два направления: оценка цитотоксической безопасности и противовирусной эффективности. Исследования осуществлялись совместно со специалистами медико-биологического профиля НИФ Здоровья, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) и ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово). Ряд экспериментальных измерений токсикологических параметров на компьютерно-автоматизированном стенде оценки безопасности полимеров в отношении мужских половых клеток млекопитающих освоены и выполнены соискателем лично. 2.6.1. Цитотоксичность Количественная мера снижения цитотоксичности - рост значений ТС5о -пороговых концентраций вещества, вызывающих 50% подавление жизнеспособности клеток. Экспериментальная оценка безопасности испытуемых ВМС в отношении клеток человека и животных проведена in vitro - на клеточных культурах: мужские половые клетки млекопитающих (быка), экспериментальные аналоги лимфоцитов человека (МТ4) и выборочно - на других клетках (MDCK, Hella, Vero). При планировании стратегии синтеза мы учитывали опыт ранее полученных данных о диапазоне цитотоксически безопасного насыщения аналогичных поликарбоксикислотных макромолекул алициклами (адамантана/норборнана) до степеней модификации не более 15-20% от общего числа анионогениых групп. В частности, на новых ВМС объектах -производных Ш {глава III, стр. 62, таблица 4) внутримолекулярное соотношение Ali/An, рассчитываемое по формуле: АН/An = а/п/(А-а/п), было выдержано в пределах 1-7%, за исключением контрольного ряда алициклически- родственных фенилсодержащих модификаций (П28 и П29 с соотношением Ali/An = 0.33 и 1.00, соответственно). Предварительный скрининг цитотоксичности поликарбоновых кислот модифицированных бензиламином (как наиболее доступным и родственным по гидрофобности алициклическим производным аналогом) был проведен нами целенаправленно - для экспериментальной проверки целесообразности ограничения степеней модификации кислотных групп. Поэтому мы исследовали широкий диапазон молярных соотношений (Амин : Сомономерное звено) вплоть до максимальных значений равных 4 - т.е. до полной конверсии 4-х карбокси- кислотных групп сомономерного звена П2/ПЗ в амидные, а затем и в аммониевые производные (рис. 13). Как видно из рис. 13, минимум цитотоксичности наблюдается при соотношении (Амин : сомономерное звено) = 0.5, что соответствует модификации 0.5/4 = 0.125 потенциально кислотных (анионогенных) групп, т.е. - каждой восьмой анионогенной группы.
