Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 6
2.1 .Модельные липидные мембраны 6
2.1.1. Липиды и их самоорганизация в водной среде 6
2.1.2. Липидные везикулы и плоские бислои 8
2.1.3. Диффузия липидов и фазовые переходы в модельных липидных бислоях 13
2.2. Поликатионы и их взаимодействие с модельными липидными бислоями 28
2.2.1. Адсорбция 28
2.2.2. Структурные перестройки в липидном бислое, вызываемые адсорбцией поликатиона 29
2.2.3. Обратимость взаимодействия поликатионов с отрицательно заряженными липосомами 31
2.2.4. Слияние липосом, индуцируемое адсорбцией полиэлектролитов 32
2.2.5.0бласти применения комплексов поликатионов с модельными липидными мембранами 37
3. Экспериментальная часть 39
3.1. Используемые реагенты 39
3.1.1 Фосфолипиды и ПАВ 39
3.1.2. Полимеры 39
3.1.3. Низкомолекулярные реактивы 39
3.1.4. Вода 40
3.2. Объекты исследования 41
3.2.1. Меченые липосомы из фосфатидилхолина и кардиолипина 41
3.2.2. Нанесенные липидные мембраны 43
3.3. Методы исследования 43
3.3.1. Квазиупругое рассеяние лазерного света (КУРЛС) 43
3.3.2. Флуориметрия 44
3.3.3. Препаративное центрифугирование 44
3.3.4. Спектрофотометрия 44
3.3.5. Атомно-силовая спектроскопия 44
3.3.6 Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия 45
3.3.7. Кондуктометрия 45
4.Результаты и их обсуждение 46
4.1 Формирование комплексов катионных полимеров с малыми анионными липосомами 46
4.2 Влияние липидного состава мембраны на устойчивость комплексов поликатиона с малыми анионными липосомами в водно-солевых средах 60
4.3. Влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплекса поликатиона с малыми анионными липосомами 66
4.4. Комплексы катионного полимера с большими анионными липосомами 71
4.5. Адсорбция катионного полимера на липидных бислоях, иммобилизованных на твердой поверхности 75
Выводы 88
Список цитированной литературы 90
- Поликатионы и их взаимодействие с модельными липидными бислоями
- Меченые липосомы из фосфатидилхолина и кардиолипина
- Атомно-силовая спектроскопия
- Влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплекса поликатиона с малыми анионными липосомами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Постоянно расширяющееся использование синтетических водорастворимых полимеров, в том числе полиэлектролитов, в биологии и медицине заставляет обратиться к исследованию их поведения в биологическом окружении и, в первую очередь, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками. При рассмотрении физико-химических аспектов такого взаимодействия наряду с клетками часто используются модельные системы, среди которых широкое распространение получили сферические бислойные везикулы (липосомы), сформированные из липидов и синтетических липидоподобных соединений.
Систематическое исследование адсорбции полимеров на биологических мембранах ведётся с конца 60-х годов прошлого столетия. В литературе описаны индуцированные полимерами структурные перестройки в липидных мембранах, конформационные переходы в адсорбированных макромолекулах, встраивание полимеров в липидные мембраны, влияние полимеров на мембраны и ряд других эффектов. Однако несмотря на большое количество публикаций, посвященных влиянию адсобированных полимеров на свойства липидных мембран, ряд принципиальных вопросов остается открытым. Это касается, в частности, взаимосвязи между строением межфазных комплексов полимер-липидная мембрана и морфологией частиц с участием макромолекул и липосом. Между тем, свойства межфазного слоя (его толщина, поверхностный заряд, наличие дефектов упаковки липидов и т.д.) в значительной степени определяют направление, по которому будут развиваться морфологические изменения в липосомах после адсорбции полимеров, будет это путь агрегации, слияния или разрушения. Подобные рассуждения справедливы и при рассмотрении клеток в контакте с синтетическими полимерами.
Цель работы заключалась в изучении влияния строения и свойств синтетических катионных полимеров и анионных липосом на стабильность и морфологию полимер-липидных частиц. Для этого в работе было исследовано формирование комплексов синтетических поликатионов с анионными липосомами; определены толщина межфазных полимер-липидных слоев, стабильность комплексов поликатион-липосома в водно-солевых средах, целостность липосом в адсорбированными поликатионами, а также морфология комплексных частиц с участием макромолекул и липосом.
Научная новизна. Установлено, что стабильность комплексов анионных липосом с поликатионом в водно-солевых средах определяется набором факторов: степенью заряженности липосом, геометрической формой анионных липидных молекул, фазовым состоянием липидного бислоя и размером липосом. Впервые продемонстрировано, что способность катионных полимеров инициировать слияние анионных липосом зависит от
толщины адсорбированного полимерного слоя: если при 30 нм он слиянию препятствует, то при толщине 5 нм приводит к активации этого процесса. Показано, что адсорбция поликатиона на анионном липидном бислое, иммобилизованном на поверхности твердого носителя, развивается в две стадии, электростатическое связывание макромолекул и их последующее встраивание в липидный бислой.
Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании модельной системы поликатион-липосома, имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия клеточной мембраны с синтетическими поликатионами и биологически активными веществами на их основе. Эти результаты позволяют прогнозировать поведение синтетических полимеров на поверхности клетки и реакцию клетки на адсорбированный полимер и могут быть использованы при разработке новых эффективных липосомальных контейнеров для транспорта биологически активных веществ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 45-ом и 49-ом Международных микросимпозиумах "Структура и динамика макромолекулярных систем" (Чехия, Прага, 2006, 2009), 4-ой Международной Каргинской конференции "Наука о полимерах 21-му веку" (Россия, Москва, 2007), Европейском полимерном конгрессе (Словения, Портороз, 2007), 6-ом Совместном конгрессе Британского биофизического общества и Европейского биофизического общества (Англия, Лондон, 2007), Балтийском полимерном симпозиуме (Литва, Друскининкай, 2007), Международной конференции по коллоидной химии и химико-физической механике (Россия, Москва, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в рецензируемом сборнике статей и 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунок , 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 143 ссылки.
Поликатионы и их взаимодействие с модельными липидными бислоями
Модификация поверхности отрицательно заряженных липосом поликатионами - макромолекулами, звенья которых содержат группы, способные к диссоциации, используется для решения ряда фундаментальных и практических задач. Так, полимер, адсорбированный на поверхности способен увеличивать жесткость липидной мембраны, термодинамическую стабильность липосом, придавать липосомальным контейнерам векторные свойства. В разбавленных растворах полиэлектролитов взаимодействием между цепями полимера можно пренебречь, рассматривая свойства индивидуальной макромолекулы. В сильно разбавленных растворах энтропийный проигрыш при адсорбции противоионов очень велик, поэтому противоионы распространяются по всему объему, а цепи макромолекул свободно диффундируют. С увеличением концентрации полимера энтропийный проигрыш начинает уменьшаться, вследствие чего начинается конденсация противоионов в объеме вблизи полиэлектролита. Это явление носит название конденсация противоионов Маннинга-Оосавы. Увеличение ионной силы раствора также способствует увеличению числа сконденсированных противоионов. Обычно количество сконденсированных противоионов составляет 20-30% по заряду[76, 77].
Образование комплексов между полиэлектролитами и противоположно заряженными липосомами обуславливается выигрышем в энтропии за счет высвобождения противоионов, находящихся в ионной атмосфере полимера и липосом в объем раствора. Скорость электростатической адсорбции значительно превышает скорость процесса агрегации частиц комплекса. Таким образом в процессе образования агрегатов принимают участие уже сформированные комплексы поликатион-липосома. Стоит отметить, что вследствие электростатического притяжения между полимером и противоположно заряженными липосомами и отталкивания между одноименно заряженными частицами адсорбированные полимерные цепи распределяются неравномерно, создавая участки с локальным пересыщением положительных и отрицательных зарядов. Это и приводит к агрегации липосом[78]. Адсорбированный полимер может нарушать распределение липидов в липосомальной мембране. Так в мембране, состоящей из смеси дипальмитоилфосфатидилхолина и кардиолипина, находящейся в жидком фазовом состоянии, липиды распределены равномерно. Методом микрокалориметрии было показано, что адсорбированный поликатион способен вызывать латеральную сегрегацию отрицательно заряженных липидов (образование кластеров) во внешнем слое липидов[79]. Так же некоторые поликатионы, например поли-г4-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП), способны индуцировать флип-флоп липидных молекул. Отрицательно заряженный липид перемещается из внутреннего слоя мембраны на внешний, а его место занимает электронейтральный липид. Таким образом, в комплексе реализуется микрофазовое разделение.
При добавлении избытка поликатиона весь отрицательно заряженный липид оказывается во внешнем слое мембраны, в то время как внутренние слой формируется только электронейтральными липидами[80]. Образующаяся асимметрия липидного бислоя сохраняется только в присутствии адсорбированного поликатиона. Удаление полимера с поверхности приводило к восстановлению равномерного распределения липидов во внешнем и внутреннем слоях липосом. Стоит отметить, что индуцированные полимером перестройки в липидных мембранах происходили в течение нескольких секунд, в то время как обратный процесс занимал около часа. На способность поликатионов вызывать структурные перестройки в липидной мембране после адсорбции влияют: фазовое состояние мембраны -в гелеобразном состоянии индуцированных фазовых перестроек не наблюдается; длина цепи поликатиона - молекулы ПЭВП со степенью полимеризации меньше 30 не вызывали флип-флоп, но вызывали латеральную сегрегацию; природа полимера - поли-Ь-лизин не вызывает флип-флопа, вызывая латеральную сегрегацию. В то же время стоит отметить, что при этой степени полимеризации поликатион утрачивал способность образовывать петли и хвосты, адсорбируясь на поверхности[80, 81]. На ряде полиамфолитов на основе поли-4-винил пиридина, алкилированного бромкарбоновыми кислотами было показано, что уменьшение метиленовой развязки между атомом азота и карбоксильной группы с четырех до двух атомов приводит к последовательному исчезновению способности полимеров вызывать флип-флоп и латеральную сегрегацию. Полиамфолит с одной метиленовой группой и вовсе не взаимодействует с отрицательно заряженными липосомами[82]. 2.2.3. Обратимость взаимодействия поликатионов с отрицательно заряженными липосомами В случае электростатической адсорбции поликатионов на отрицательно заряженные малые липосомы удалить поликатион с поверхности липосомальной мембраны можно двумя способами. Увеличение ионной силы раствора путем введения низкомолекулярного электролита приводит к компенсации энтропийного выигрыша от образования комплекса полимер-липосома, что в свою очередь ведет к десорбции полимера[83].
Другой способ состоит в добавлении к комплексу поликатион - отрицательно заряженная липосома избытка (по заряженным группам) полианиона. В результате конкурентных реакций в растворе появляются свободные липосомы и интерполиэлектролитный комплекс, несущий избыточный отрицательный заряд. Комбинаторная энтропия образующейся системы выше, чем для смеси комплекса поликатион-липосома и свободного полианиона[84]. Описанное выше справедливо для случая, когда мембрана находится в жидкокристаллическом состоянии [4]. Адсорбция поликатиона может быть и необратима. Так наличие в полимере гидрофобных групп обеспечивает необратимость адсорбции, за счет их встраивания в гидрофобную область бислоя (область хвостов липидов)[85]. При адсорбции поликатиона на большие липосомы цепь полимера способна заглубляться в бислой - мембраны больших липосом обладают спонтанной кривизной, что приводит к образованию временных дефектов в мембране, куда и заглубляется поликатион[86]. Дальнейшее
Меченые липосомы из фосфатидилхолина и кардиолипина
Кардиолипин (КЛ "), раствор в этаноле с концентрацией 25 мг/мл; фосфатидилсерин (ФС1") раствор в этаноле с концентрацией 20 мг/мл, фосфатидилхолин (ФХ), раствор в этаноле с концентрацией 20 мг/мл, дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) - липиды фирмы Avanti Polar Lipids; меченый флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ, C HnOsNS) дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (ДПФЭ-ФИТЦ) фирмы "Sigma" (США). Додецилфосфат натрия (ДФН2") фирмы "Sigma" (США). Тритон X-100 производства "Sigma" (США). Все липиды и ПАВ использовали без дополнительной очистки. Статистический сополимер Т-этил-4-винилпиридиний бромида и 4-винилпиридина («поли-1Ч-этил-4-винилпиридиний бромид», ПЭВП) получали по методике [131] кватернизацией поливинилпиридина этилбромидом. Полученный полимер осаждали из реакционной смеси в сухой диэтиловый эфир, осадок промывали эфиром и сушили в вакууме. Степень алкилирования, определенная методом ИК-спектроскопии, составляла 95%. В работе использовали фракцию полимера со степенью полимеризации 600. Величину степени полимеризации определяли методом светорассеяния. Поли-Ь-лизин гидробромид, степень полимеризации 340, фирма "Sigma" (США), использовали без дополнительной очистки. В работе использовали буру, ШгВдОуЛОНгО, (марки х.ч.) фирмы "Реахим" (Россия) без дополнительной очистки. Растворы с концентрацией буры 10"" М (рН=9,2) готовили по навеске.
В работе использовали хлорид натрия (марки х.ч.) "Реахим" (Россия) без дополнительной очистки в виде 4 М раствора в воде. Воду очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему "Milli-Q" фирмы "Миллипор" (США), включающую ионообменные, адсорбционные колонки для глубокой очистки от органических примесей и фильтры для удаления крупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность 0,56 мкСм/см. Структурные формулы использованных веществ приведены ниже. Малые моноламеллярные липосомы из ФХ и КЛ получали методом озвучивания[132]. Раствор ФХ смешивали с необходимым количеством метанольного раствора КЛ" и дипальмитоилфософэтаноламина, меченного флуоресцеин изотиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ) (0,02 мг ДПФЭ-ФИТЦ для приготовления липосом с молярной долей флуоресцентно меченого липида Ф=0,005) и тщательно удаляли органический растворитель на вакуумном роторном испарителе "Rotavapor" фирмы "Buchi" (Швейцария) при температуре Т=35С и скорости вращения 60 об/мин. Образующуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл боратного буфера. После этого на препарат воздействовали ультразвуком частоты 22 кГц в течение 600 с (3x200с) в непрерывном режиме при постоянном охлаждении водой. Использовали ультразвуковой диспергатор 4710 (фирма "Cole-Parmer Instrument", США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге в течение 5 минут при скорости 12 тыс. об/мин и использовали в течение суток. Малые моноламеллярные липосомы, содержащие в качестве отрицательно заряженного липида ФС" и ДФН", а также электронейтральные липосомы из ФХ готовили аналогично. Малые моноламеллярные липосомы из ДПФХ и КЛ готовили аналогично методике, описанной выше, проводя отгонку растворителя и озвучивание при температуре Т=55С.
Мольную долю отрицательно заряженных полярных головок рассчитывали как Большие моноламеллярные липосомы из ФХ и КЛ получали по следующей методике[133]. Пленку из растворов ФХ, КЛ и ДПФЭ-ФИТЦ получали аналогично по методике, описанной выше. Образующуюся пленку диспергировали в 7 мл смеси хлороформа, диэтилового эфира и боратного буфера (3:3:1). Затем органический растворитель удаляли на роторном испарителе «Rotavapor» фирмы "Buchi" (Швейцария) при комнатной температуре, скорости вращения 60 об/мии и слабом вакууме, не допуская кипения смеси. Полученный препарат подвергали воздействию ультразвука частоты 22 кГц в течение 60 с (2x30с). Заполненные 1 М раствором NaCl липосомы получали в соответствии с вышеописанными методиками. В качестве буфера использовался 0,01 М раствор буры, содержавший 1М NaCl. Полученные липосомы диализовали против 0,01 М боратного буфера. Концентрация получаемых липосом составляла 10 мг/мл.
Атомно-силовая спектроскопия
Рельеф поверхности высушенных образцов нанесенных липидных мембран и мембран с адсорбированным ПЭВП изучали с помощью атомно-силовой микроскопии (Dimension, VEECO, США) в полуконтактном режиме («tapping mode») с использованием кремниевых кантилеверов (резонансная частота в интервале 200-300 kHz. длина 225 мкм, VEECO, США). In situ измерения проводили в жидкостной ячейке Multimode (VEECO) в полуконтактном режиме с использованием покрытых золотом кантилеверов из нитрида кремния (частота в интервале 200-300 kHz, длина 100 мкм, VEECO, США). Статистическая обработка результатов была проведена с использованием программы Nanoscope III (Digital Instruments). 3.3.6 Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия Образцы для криогенной трансмиссионной электронной микроскопии готовили в специализированной камере, в которой поддерживались заданные температура и влажность. Капля суспензии липосом или комплекса липосом с полимером наносилась на медную сетку, покрытую перфорированной углеродной пленкой. Избыток суспензии удаляли фильтровальной бумагой. Затем образец погружали в жидкий этан, находящийся при температуре замерзания (90 К). Обезвоженный таким образом образец помещали в охлаждающую ячейку Oxford СТ-3500 и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе Philips СМ 120 при температуре -180С в режиме малых доз электронных пучков, чтобы предотвратить радиационное повреждение образца. Изображения оцифровывали и записывали на комьютер с помощью камеры Gatan 791 MultyScan CCD camera [136]. 3.3.7.
Кондуктометрия Измерение электропроводности растворов проводили на кондуктометре CDM 83 Radiometer (Дания). Для измерений использовали полиэтиленовую кювету, объем пробы составлял 1 мл. Для регистрации взаимодействия ПЭВП с малыми анионными КЛ2" /ФХ липосомами использовали метод лазерного микроэлектрофореза. Адсорбция поликатиона сопровождается нейтрализацией поверхностного заряда липосом, что отражается на величине их электрофоретической подвижности (ЭФП). На рис.5а приведены зависимости ЭФП для КЛ 7ФХ липосом с различным содержанием анионного липида v от концентрации добавленного ПЭВП. Во всех случаях добавление ПЭВП вначале приводило к уменьшению ЭФП до нуля, затем происходила перезарядка поверхности липосом и, наконец, ЭФП достигала своего предельного положительного значения. Концентрация поликатиона, вызывавшая полную нейтрализацию поверхностного заряда липосом [ПЭВПЭФП=О] линейно возрастала по мере увеличения доли анионного липида в мембране (рис. 56, прямая 1). Апрокисмация зависимости [ПЭВПЭФП=О] ОТ и к нулевой концентрации липида давало значение 4x10"5 осново-моль/л ПЭВП. Это означает, что мембрана липосомы, состоящая исключительно из ФХ, содержит отрицательный заряд. Это может быть обусловлено тем, что природный ФХ содержит небольшое количество цепей, подвергшихся окислению, результатом которого является появление дополнительных карбоксильных групп в молекулах липидов [137]. Параллельное измерение размера частиц в суспензиях зафиксировало агрегацию липосом при добавлении поликатиона (рис. 6). Максимальный размер агрегатов достигался при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом, т.е. при ЭФП=0. Дальнейшее введение ПЭВП приводило к значительному уменьшению размера частиц. Очевидно, что стабилизация липосом была обусловлена появлением на их поверхности избыточного положительного заряда, привнесенного адсорбированным поликатионом.
Для оценки эффективности связывания ПЭВП с КЛ 7ФХ липосомами мы провели следующий эксперимент. Частицы комплекса были отделены от раствора на центрифуге, а затем проанализировали состав супернатанта на наличие ПЭВП методом УФ-спектроскопии. На рис. 7 изображена зависимость концентрации поликатиона в надосадочной жидкости от его общей концентрации в суспензии для липосом с различным содержанием анионного компонента. Видно, что молекулы ПЭВП количественно связываются с липосомами вплоть до [ПЭВП]макс (рис.7 прямая 2), при больших концентрациях поликатион начинает накапливаться в растворе. По достижении предельной концентрации связывания количество полимера в надосадочной жидкости возрастает линейно, причем линейный участок кривой параллелен графику зависимости концентрации ПЭВП в супернатанте от коцентрации ПЭВП в растворе, не содержащем липосом (рис.7 прямая 1). Таким образом, увеличение концентрации ПЭВП в супернатанте комплексов обусловлено исключительно молекулами несвязанного полимера. Видно, что по мере возрастания доли анионного липида в липосомальной мембране [ПЭВП]макс также увеличивается, при этом зависимость [ПЭВП]макс от v имеет линейный характер (рис. 56, прямая 2). Полученная прямая оказывалась сдвинутой параллельно вверх по отношению к прямой 1 на том же рисунке, описывающей зависимость [ПЭВПЭФП=О] от v. Таким образом, для всех типов липосом (с разным содержанием анионного липида) предельная адсорбция ПЭВП превышала нейтрализующее количество поликатиона на одну и ту же величину. Иными словами, [ПЭВЩмакс - [ПЭВПЭФП=о] = А[ПЭВП] = 6.5x10 5 М. Этот избыток поликатиона сообщал липосомам ЭФП близкую к +3 (мкм/с)/(В/см) (рис. 5а). При этом на липосомальной мембране формировался электростатический барьер, препятствовавший дальнейшей адсорбции поликатиона.
Влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплекса поликатиона с малыми анионными липосомами
Методами лазерного микроэлектрофореза, динамического светорассеяния, тушения флуоресценции и кондуктометрии исследовано влияние фазового состояния мембраны анионных ДПФХ/КЛ"" (v=0.2) липосом на обратимость комплексообразования с ПЭВП и состав/строение образующихся комплексов. Ранее с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что мембрана смешанных ДПФХ/КЛ " (v=0.2) липосом характеризуется широким фазовым переходом с максимумом при Ti=33.2C и плечом при Т2=37ЛС [82]. Ниже температуры Ті липидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидных молекул («твердые» липосомы). При температуре выше Т2 мембрана переходит в жидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает («жидкие» липосомы). В нашей работе переход липидного бислоя из состояния геля в состояние жидкого кристалла и в обратном направлении вызывали путем изменения температуры липосомальной суспензии. Твердые ДПФХ/КЛ2" (v=0.2) липосомы получали охлаждением суспензии до 20С, жидкие - ее нагреванием до 55С. Существенное отличие от опубликованных ранее работ состояло в том, что переход от твердого состояния к жидкому (и в обратном направлении) инициировался не в исходных липосомах, а в уже сформированном комплексе.
Однако прежде чем обратиться к анализу поведения такой системы, мы исследовали по отдельности связывание поликатиона с твердыми и жидкими анионными липосомами. На рис. 19 представлены зависимости ЭФП комплексов ПЭВП с липосомами, мембрана которых находится в жидком (кривые 1 и 3) и твердом (кривые 2 и 4) состоянии. При этом фазовое состояние мембраны задавалось как до образования комплекса с поликатионом (кривые 1 и 2), так и после оного (кривые 3 и 4). В случае твердых липосом комплексообразование развивается как адсорбция поликатиона на поверхности с фиксированным положением отрицательных зарядов. При этом только молекулы анионного липида, расположенные на внешней стороне мембраны, участвуют в образовании электростатического комплекса с поликатионом. После нагревания смеси твердых липосом и ПЭВП до 55С ЭФП системы уменьшается. Это связано с тем, что при переходе липосомальной мембраны в жидкое состояние ПЭВП индуцирует флип-флоп и мембрана преобретает дополнительный отрицательный заряд. Видно, что концентрация ПЭВП, при которой наблюдается полная нейтрализация заряда поверхности липосом для «разжиженной» мембраны (рис. 19 кривая 3) примерно в 2 раза превышает концентрацию ПЭВП, необходимую для нейтрализации поверхностного заряда твердых липосом (рис. 19 кривая 2). При этом кривая ЭФП для комплексов «разжиженных» липосом практически совпадает с кривой для комплексов «жидких липосом (рис.19 кривые 3 и 1 соответственно). Таким образом, для комплексов «жидких» и «разжиженных» липосом с ПЭВП все молекулы КЛ находятся на внешнем слое липидной мембраны. При этом охлаждение смеси «жидких» липосом и ПЭВП (далее «отвержденные» липосомы) приводит к незначительному изменению ЭФП — доля отрицательного заряда уменьшается, но не достигает значений, полученных для «твердых» липосом. Такое изменение ЭФП может быть обусловлено либо перемещением молекул КЛ с внешнего слоя мембраны на внутренний, либо десорбцией полимера, либо совокупностью этих факторов.
Оценка степени связывания полимера с «жидкими» и «разжиженными» липосомами показала, что при охлаждении комплексов «жидких» липосом с ПЭВП полимер не покидает поверхность липидной мембраны (рис. 20). Оценка целостности липидных мембран методом кондуктометрии показала, что для комплексов ПЭВП с «твердыми», «разжиженными» и «отвержденными» липосомами происходит вытекание низомолекулярного электролита из внутреннего объема липосом, в то время как для «жидких» липосом целостность мембраны сохраняется. При этом обратимость адсорбции сохраняется только для комплексов «жидких» липосом с ПЭВП. Для всех остальных случаев ни добавление избыточного количества полиакрилата натрия, ни введение в систему низкомолекулярного электролита до концентрации 0,4 М NaCl не приводило к десорбции поликатиона с липосом. На основании полученных, а также с учетом литературных данных можно предположить следующее строение межфазных комплексов, образованных адсорбированным поликатионом на поверхности липосом (рис. 21). Для «жидких» липосом (рис.21а) поликатион находится на поверхности липосомальной мембраны, при этом все отрицательно заряженные липиды участвуют в комплексообразовании. Для комплексов «твердых» липосом не наблюдается латеральной сегрегации липидов, а также флип-флопа, поликатион располагается на поверхности, образуя полимерный слой такой же высоты, как и для «жидких» липосом — толщина слоя, измеренная светорассеянием составляла около 30 нм, но при этом в липидной мембране формируются дефекты, в которые заглубляется поликатион (рис. 216).
Изменение фазового состояния липосомальной мембраны в уже сформированном комплексе оказывает существенное влияние на его структуру и свойства. Так, нагревание суспензии, содержащей комплекс поликатион-твердая липосома, выше температуры фазового перехода липидного бислоя активирует флип-флоп анионных липидов. Однако такое «разжижение» липосомальной мембраны не устраняет дефектов, возникших в ней при формировании исходного комплекса (рис. 21в). Благодаря этим дефектам необратимость связывания поликатиона сохраняется и после разжижения мембраны. Более значительнее эффекты наблюдаются при охлаждении суспензии комплекса поликатион-жидкая липосома ниже температуры фазового перехода липидного бислоя. «Отверждение» липосомальной мембраны, вызываемое понижением температуры, сопровождается переходом части анионных липидов в обратном направлении — с внешней стороны мембраны на внутреннюю. В этот процесс оказывается вовлеченным и адсорбированный на мембране поликатион (рис. 21г). Встраивание поликатиона в липидную мембрану делает необратимым его контакт с отвержденными анионными липосомами.
