Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Процесс гидролиза - экстракции пектиновых веществ
1.1. Структура и строение протопектина клеточной стенки растений 12
1.2. Гидролиз протопектина и экстракция пектиновых веществ 30
1.2.1. Предварительная подготовка растительного материала 30
1.2.2. Сорбция гидролизирующего агента растительным выжимкам 36
1.2.3. Кинетика гидролиза протопектина клеточных стенок растительного материала 41
1.2.4. Действие ионной силы на гидролиз протопектина 56
1.3 Экстракция пектиновых веществ 64
1.3.1. Диффузия пектиновых веществ из клеточной стенки растительного материала 64
1.3.2. Выделение и очистка пектиновых веществ из раствора гидролизата 65
1.3.3. Использование мембранной технологии при очистке и концентрировании пектиновых веществ 68
1.3.4. Очистка и концентрирование яблочного пектина 72
1.3.5. Очистка и концентрирование подсолнечного пектина 80
Глава II Структура пектиновых веществ
2.1. Строение пектиновых веществ 88
2.2. Конформация пектиновых макромолекул 104
2.3. Химическая неоднородность пектиновых макромолекул 114
2.4. Молекулярная масса и молекулярно-весового
распределения пектиновых макромолекул 118
Глава III. Полиэлектролитические свойства пектиновых полисахаридов
3.1. Поведение анионных полисахаридов, в разбавленных растворах 130
3.1.1. Особенности ионизации низкометилированных пектинов 143
3.1.2. Свойства низкометилированных пектинов в разбавленном растворе 146
3.1.3. Некоторые аномалии в поведение пектиновых макромолекул в растворе .148
3.2. Свойства анионных полисахаридов в концентрированном растворе .155
3.2.1. Влияние поливалентных металлов на процесс гелеобразования низкометилированных пектинов 160
Глава IV Биологические свойства пектиновых веществ
4.1. Пектины—пищевые волокна 165
4.1.1. Роль пищевых волокон в лечении сердечно-сосудистых заболеваний 168
4.1.2. Влияние пектиновых волокон на химизм желчи 170
4.2. Пектин в лечении больных желчно-каменной болезнью 175
4.3. Пектин с антибиотиками при лечении острых кишечных инфекцией .179
Глава V. Методика экспериментальных исследований
5.1. Сбор и подготовка исходного сырья 186
5.2. Характеристика реагентов и рабочих растворов 188
5.3. Гидролиз-экстракция протопектина 189
5.4. Очистка пектиновых веществ 190
5.5. Определение растворимости 191
5.6. Определение содержания золы 191
5.7. Количественные методы анализа функциональных групп 192
5.7.1. Модифицированный титриметрический метод 193
5.7.2. Фотометрическое определение метоксильных групп 193
5.7.3. Карбазольный метод определения пектиновых веществ 193
5.8. Хроматографический анализ 194
5.8.1. Бумажная хроматография 194
5.8.2. Газожидкостная хроматография 194
5.8.3. Ионообменная хроматография .195
5.9. Спектроскопические исследования 196
5.10. Методы исследования гидродинамических свойств 197
5.11. Методики изучения сорбционных свойств выжимок после экстракции ПВ 199
5.12. Количественное определение содержания кальция в пектине 200
Выводы 202
Литература 206
- Структура и строение протопектина клеточной стенки растений
- Использование мембранной технологии при очистке и концентрировании пектиновых веществ
- Свойства анионных полисахаридов в концентрированном растворе
- Количественное определение содержания кальция в пектине
Структура и строение протопектина клеточной стенки растений
У высших растений клеточная стенка (КС) обычно состоит из трех слоев: срединной пластинки, первичной стенки и вторичной стенки. Срединная пластинка образует аморфный межклеточный слой между первичными стенками соседствующих клеток. Наиболее важными химическими компонентами всех клеточных стенок растений являются полисахариды. Их разделяют на две большие категории: кристаллические, которые в клеточной стенке агрегированы в пучки, называемые микрофибриллами, и полисахариды матрикса [1]. Срединные пластинки, влияющие на состав клеток, и первичная клеточная оболочка образуются преимущественно пектином [2]. Именно, уменьшение содержания этого вещества приводит к разрушению ткани.
Пектиновые вещества (ПВ) связанные с целлюлозой и другими биополимерами КС называют протопектином (ПП). С целью изучения структуры ПВ клеточной стенки проведены многочисленные исследования. В последние годы имеется значительный прогресс в исследовании полисахаридного матрикса благодаря успехам метода метилирования и последующими ананлизам фрагментов с использованием ГЖХ, хромато-масс и ЯМР-спектроскопии. Большой акцент уделяется модельной структуре рамногалактуронана, его боковых цепей из арабиноз и галактозовых остатков и ксилоглюкана, выработанной в [3] и затем в [4] (рисі.1). Более спорным оказалось предположение о ковалентной связи боковых цепей рамногалактуронана с целлюлозой, гемицеллюлозои и другими полимерами клеточной стенки. В работе [3] показано, что рамногалактуронан связан с поперечно связанные подигалактуроновые цепи с ионами кальция; рамногалактуронан 1 сязанные с арабинаногалактановые боковые цепи пектиновых полимеров;
Наличие ковадентной связи между этими полимерами не было четко доказано, что и привело к сомнению в существовании таких связей [5]. Во фрагментах ПВ путем ферментативного и кислотного гидролиза были обнаружены глюкоза и ксилоза, что явилось наиболее существенным доказательством наличия ковалентных связей между матрицами пектина и гемицеллюлозой. Однако, наличие иных связей между пектином и другими полимерами клеточной стенки и процесс размягчения плодов, вследствие плавного перехода протопектина в ксиглюканом посредством цепи галактана и с белками через арабиногалактаны,связанные с сериновыми остатками. растворимый пектин, дает повод усомнится в бесспорности модели [3].
Авторы [6] считают, что причиной нерастворимости протопектина являются: 1 - мостиковые связи кальция и магния между пектиновыми молекулами (модель яичной коробки); 2 - ковалентные связи пектина с другими клеточными полимерами; 3 - механическое сворачивание пектина с другими биополимерами.
Модель полимеров клеточной стенки ( рис 1.1) представленной Карпитом и Гибаутом [4] может, ответит на возникших вопросов. Как видно целлюлозно- ксилогюкановый матрикс, удерживающего нагрузку при плодоношении, укреплена пектиновыми полисахаридами, придающей растений гибкости
При экстракции ПВ из льна с помощью ЭДТУ с последующем фракционированием, получен продукт в состав которого входят галактоза, галактуроновая кислота, рамноза и следы арабинозы [7]. Путем дальнейшей очистки был выделен рамногалактуронан. На основе данных структурного анализа, полученного рамногалактуронана с помощью двухмерной корреляционной спектроскопии ЯМР на протонах (варианты CHORTLE,COSY и NOESY), установлено, что макромолекулы ПВ содержат боковые ответвления, состоящие из Ь-галактопиранозиловых остатков, связанных с основой цепью рамногалактуронана посредством гидроксильных групп, находящихся при 4-ом углеродном атоме рамнозы.
Показано, что боковые цепи полисахарида состоят из трех мономерных единиц b-галактозила. В целом, структура рамногалактуронана льна находится в близком соответствии со структурой цепи ПВ, полученных из суспензионной культуры явора [3].
При обработке клеточных стенок яблок эндо-а (1- 4) - D-галактуроназой [8] были выделены как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные фракции полисахаридов. Путем гидролиза метилированных образцов с последующим анализом ЯМР С-спектра продуктов установлено, что высокомолекулярная функция полисахарида построена из связанных между собой следующих моносахаридов: (1- 4) галактозы, (1-»5) арабинозы, (1-Й-) галактуроновой кислоты и (1,2,4) рамнозы, содержание которых в ПВ падает в соответствии с представленным рядом. Низкомлекулярная функция полисахарида состоит из (1,3,4) -связанной галактуроновой кислоты, остатков рамнозы, связанных по 1-, (1,3)-и (1,3,4)-положениям, а также из остатков разветвленной арабинозы и галактозы.
При действии на высокоразветвленные фрагменты ПВ яблок [9] фермента (3(1— 4)-0-галактоназы был получен олигосахарид со степенью полимеризации -25, содержащий остатки L-арабинозы и D-галактозы, что указывает на наличие в пектиновых веществах боковых цепей в виде арабиногалактана. Путем последовательной обработки яблочной выжимки пектиновым (К.Ф. 4.2.2.10) и пектатовым (К.Ф. 4.2.2.2) ферментами с последующим разделением полученных продуктов, были получены фракции, содержащие более 90% остатков D-галактуроновой кислоты. Наряду с этим, получены также высокомолекулярные фракции полимера с разветвленной структурой, анализ которых показал, что остатки нейтральных Сахаров в основном сконцентрированы в боковых ответвлениях. Исходя из этого, сделано заключение, что в клеточных стенках яблок макромолекулы ПВ состоят из двух так называемых «волосистых» и «гладких» областей, причем в последних цепочки полисахарида образованы в основном из D-галактозилуроновых остатков [9-14].
Аналогичные результаты были получены авторами [15]. В частности, наличие линейной и разветвленной областей макромолекул ПВ клеточных стенок подтверждено исследованием фракций, выделенных из свекловичной выжимки [16-17] под действием фермента эндо- (а1 4)-0-галактуроназы (К.Ф. 3.2.1.15). В последнее время данный подход был использован для изучения структуры ПП клеточных стенок других растений. В частности в работе [18] под воздействием пектолитическими, гемиоцеллюлозитическими, и целлюлозитическими ферментами выделены пектиновые фракции-высокомолекулярные полисахариды, стойкие к дальнейшей деградации под действием упомянутых ферментов, от клетчатки картофеля, груши, моркови, лука и ткани лука. Эти фракции были охарактеризованы определением их моносахаридного состава, типа связи, степени этерификации (сложный метиловый и ацетиловый эфиры) и распределением молекулярной массы упомянутой волосистой области (ВО). В составе моносахаридов полученных фракций были идентифицированы галактуроновая кислота, галактоза, рамноза и арабиноза.
Использование мембранной технологии при очистке и концентрировании пектиновых веществ
Для осуществления мембранного разделения смесей необходимо подобрать подходящую мембрану. В реальном процессе разделения производительность мембраны, или, правильнее сказать, производительность всей системы, со временем может очень сильно измениться (обычно наблюдается падение потока во времени).
Роль этого явления в значительной мере зависит от типа решаемой задачи разделения. Уменьшение потока оказывается особенно драматическим в процессах микро фильтрации и ультрафильтрации: достаточно часто реализуется ситуация, когда в процессе разделения смесей поток составляет менее 5% от потока чистой воды. Падение потока может быть вызвано несколькими причинами - концентрационной поляризацией, адсорбцией, образованием слоя геля и забиванием пор [89]. Все эти факторы приносят дополнительное сопротивление транспорту через мембрану на входе в систему. Величина этих эффектов сильно зависит от типа мембранного процесса и свойств раствора, подающегося на мембрану. Особенно характерно это явление для растворов белков и высокомолекулярных веществ. В случае пористых мембран некоторые компоненты могут проникать внутрь мембраны и блокировать поры. Это дополнительное сопротивление называют сопротивлением блокированных пор. И, наконец, к возникновению сопротивления могут приводить адсорбционные явления. Адсорбция может происходить как на поверхности мембраны, так и на стенках пор. Падение потока отрицательно сказывается на технико-экономических показателях каждой мембранной операции, поэтому необходимо принимать определенные меры для устранения причин, связанных этим явлением.
Процессы мембранного разделения имеют большое значение в пищевой промышленности, из-за их способности осуществляться в обычных условиях, и не сопровождаются фазовыми изменениями или воздействиями химических агентов. В работе [90] приводятся результаты использования мембранных процессов для депектинизации при очистке фруктовых соков, сохраняющие естественный свежий вкус. Изучено, что процесс оптимизации и очистки сока яблока происходит при использовании мембранного ферментсодержащего реактора в лабораторных условиях и на полупромышленном оборудовании. В качестве характеристики мембранной системы исследована проникающая способность вещества и степень депектенизации. Была проведена оценка воздействия различных параметров (трансмембранное давление, скорость потока, подача смеси и т.д.) на загрязнение мембраны и механизм загрязнения интерпретировался в терминах полного блокирования поры или фильтрационной пробки. Поток растворенного вещества улучшается с увеличением процентного содержания фермента в подаваемой смеси.
Запатентован способ очистки пектинсодержащего раствора ультрафильтрацией через мембраны, пропускающие вещества с ММ 6000-20000 [91]. Предварительно отфильтрованный пектиновый гидролизат рН которого устанавливает NH4OH до 3,5, ультрафильтруют через коммерческую мембрану (IL-100 Ayahi KaseiCo) при 60С в течение 3 часов под давлением 1 кг/см2. При этом получают пектиновый препарат с градусом студнеобразования 190 SAG.
В работе [92] предложен способ осветления плодово-ягодного сока (яблочного, цитрусового, виноградного, морковного, земляничного) и выделение пектина с применением мембран. Этот процесс заключается в том, что прессованием сок подвергают ультрацентрифугированию через мембрану таким образом, чтобы в осветленной жидкой фазе остались сахара, ароматические вещества и витамины, а на мембране пектин. Пектин промывают водой, вновь подвергают ультрафильтрованию, получая вторичный осветленный сок и концентрат пектина, который подвергается сушке. Поверхность мембран при ультрафильровании составляет соответственно 150 и 50 м . Производительность процесса при этом 20000 л/ч. Предложенный метод может быть использован для осветления соков овощей и фруктов, содержащих пектин.
Фруктовые или овощные соки, например, из яблок, клубники и свеклы в [93], обрабатывали 2 циклами ультрафильтрации с получением очищенного сока и чистого пектина. Например, сырой яблочный сок нагревают до 57-59 С, рН поддерживают в пределах 3,5 и 4 и подвергают ультрафильтрованию через трубчатую мембрану, задерживающую вещества с ММ 20000, с выходом очищенного сока и сырого пектинового концентрата. Концентрат разбавляют и вновь ультрафильтруют с получением более чистого пектина и вторичного сока.
Авторами [94] установлено, что очистка и концентрирование пектиновых экстрактов из яблочного сырья, мандариновых выжимок и свекловичного жома более эффективны на трубчатых типа АР-6 разделительных модулях. В образующемся при этом пектиновом концентрате содержится 3,5-4,7% пектина, чистота его 92-95%. Кроме того, отсутствуют фракции низкомолекулярного (8000-15000 ед.) пектина, что представляет значительный практический интерес.
Исследована [95] возможность концентрирования пектиновых веществ диа- и ультрафильтрацией в солянокислых экстрактах свекловичного пектина, полученных методом кавитационно-кислотной экстракции из свежего и высушенного свекловичного жома. Перед ультрафильтрацией экстракты обрабатывали на центрифуге и фильтровали через бельтинг. Отфильтрованные экстракты подвергали концентрированию на отечественных пол овол оконных мембранах ВПУ-15 с фильтрующей поверхностью мембраны 6 м . Установлено, что для концентрирования и очистки экстрактов свекловичного пектина оптимальная температура 40 45С, давление 0,2 МПа.
Как отмечают авторы, простым концентрированием удается очистить пектины лишь частично; в концентрате остаются минеральные вещества, сахара, соли, часть красящих веществ. В то время диафильтрацией можно практически полностью отделить высокомолекулярные фракции от низкомолекулярных.
В [96] были исследованы также микрофильтрации раствора цитрусового и яблочного пектинов при скорости поперечного потока до 1,64 м/с с использованием трубчатой макропористой титановой мембраны диаметром 1,6 см с иммобилизованной пектиназой. Проводилось также в качестве контроля сравнительное изучение потока с использованием той же самой мембраны без иммобилизованной пектиназы. Показано, что величина потока была значительно выше через мембрану с иммобилизованной пектиназой, чем через контроль при значениях поперечной скорости - 0,80 и 1,2 м/с.
Свойства анионных полисахаридов в концентрированном растворе
В концентрированных растворах ионогенных полисахаридов происходит усиление межмолекулярных взаимодействий с одновременным увеличением связывания противоионов и коионов полимерными матрицами.
Согласно Рисе [209], можно выделить три типа связывания ионов -электростатическое, селективное и кооперативное. Естественно, что доля того или иного взаимодействия зависит как от природы полисахарида, так и от природы и заряда соответствующих противоинов. В частности, при связывании анионными полисахаридами ионов щелочных металлов, главным образом, реализуется обычное электростатическое взаимодействие. Такой тип взаимодействия обнаруживается на примере альгинатов натрия и калия как в разбавленных, так и в концентрированных растворах [210, 211], в широком интервале соотношений полиглюкуроната и полимануроната, являющимся носителями ионогенных групп [212]. Электростатическое взаимодействие между ионогенными группами пектиновых веществ и ионами металлов, также реализуется для образцов, получаемых из отходов яблок и цитрусовых. Эти образцы являются высокоэтерифицированными (СЭ 70%), а состояние карбоксильных групп достаточно изолировано.
ВМ-пектины в концентрированном сахарном растворе образуют гели за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий [213] . На молекулярном уровне гели ВМ- пектинов, в отличие от гелей многих денатурированных белков [214], являются гомогенным и их структуру можно описать как моделью «связанная сеть» [215]. Гелеоброзование полисахаридов в том числе ВМ-пектинов занимает особое место в пищевой промышленности и их реологические свойства достаточно хорошо изучена [213-218].
При снижении степени этерификации и возрастании содержания карбоксильных групп в макромолекуле пектина, проявляется селективность к связыванию ионов, особенно двухвалентных, и продолжается вплоть до образования гелей [194-204, 219]. Связыванию ионов кальция пектиновыми веществами посвящены многочисленные исследования, выполненные с использованием физико-химических методов: равновесного диализа, измерения плотности тока в гелях, определения коэффициента активности ионов кальция, оценки прочности гелей [136, 196, 200, 204, 221].
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что гелеобразующая способность пектиновых веществ зависит главным образом, от молекулярной массы и степени этерификации [204, 195, 219]. При изменении концентрации раствора процесс гелеобразования протекает в два этапа - димеризация макромолекул с участием ионов кальция и последующая агрегация [192,197-201]. Селективность связывания ионов кальция и гелеобразование пектиновых веществ зависят от микроструктуры полимерных цепей и порядка чередования моносахаридных остатков [196, 197]. Определением содержания одно- и двухвалентных ионов [136] с помощью специфических электродов и методом кондуктометрии показано, что высокозаряженные пектины с блочным распределением карбоксильных групп обладают высокой связывающей способностью по отношению к ионам кальция. Этот процесс происходит даже в разбавленном растворе, поведение которого, естественно, нельзя описать в рамках теории Маннинга [136, 197, 200]. Методом кругового дихроизма изучено гелеобразование в системе, содержащей альгинат (рис.3.13) и ионы кальция [192, 221]. При добавлении ионов кальция в раствор альгинтов происходит постепенное ослабление в п-л переходе, что идентифицировано со связыванием ионов кальция участками полисахарида, содержащими последовательности полиглюуронатных остатков, в то время как сегменты, содержащие остатки мануроната, не принимают участие в этом процессе. Показано, что селективность связывания ионов кальция альгинатами возрастает с увеличением длины последовательности полиуроната, а при достижении 20-24 звеньев приобретает кооперативный характер [175, 200, 221]. Изучение связывания ионов кальция полиуронатными блоками различной длины показало, что при цепной димеризации, конформация соседних звеньев принимает такую форму, при которой вдоль полимерных цепей образуются пустоты, размером в точности совпадающие с диаметром ионов кальция. При взаимодействии ионов кальция с сегментами полиуронатов происходит внедрение ионов кальция подобно яйцам, занимающим ячейки в яичной коробке. Такой механизм связывания ионов кальция альгинатами, впоследствии названный моделью «яичной коробки», широко используется в литературе при описании селективных и кооперативных взаимодействий анионных полисахаридов с ионами металлов. Ионы кальция не просто механически внедряются в пустоты, а химически взаимодействуют посредством ионных и координационных связей с остатками анионных полисахаридов, что непосредственно вытекает из данных спектров кругового дихроизма [221, 222], равновесного диализа [223] и ионного обмена [222].
Указанными способами показано, что альгинаты, богатые полиуронатными остатками, в присутствии ионов кальция дают чистые и хрупкие гели, в то время как полисахариды, богатые звеньями мануроната - слабые и мутные гели. Это явление находит свое объяснение на основании вышепредставленного механизма гелеобразования и модели «яичной коробки».
Другой подход при описании поведения анионных полисахаридов в концентрированных растворах в присутствии ионов металлов, основанный на ионообменной модели, применили Хоуг и Смидсрод [223, 225, 226], а также Кон с соавторами [227, 228]. На многочисленных образцах, полученных в системе полиуроновых кислот, альгинатов и поликарбоксильных смол, они установили, что селективность взаимодействия полимера с ионами двухвалентных металлов располагается в следующей последовательности:
Ba2+ Sr2+ Ca2+ Mg2+ Хотя эта модель удобна с точки зрения описания физико-химических процессов при гелеобразовании, однако она не дает наглядной картины структурных особенностей образовавшейся полимерной сетки. Поэтому многие авторы при описании механизма гелеобразования предпочитают интерпретировать экспериментальные данные на основании модели «яичной коробки», где были использованы в качестве анионного полисахарида низкометилированный пектин, олигосахариды альгинатов и полигалактуроната пектинов [136, 199, 227]. Тем не менее, модель «яичной коробки», хорошо описывающая поведение альгинатов и полигалактуронатов, не может быть в точности применена для описания поведения производных целлюлозы и дектсрана.
Таким образом, в концентрированных растворах поведение анионных полисахаридов в основном определяется интенсивностью межмолекулярных взаимодействий, которые стабилизируются ионами многовалентных металлов. При соответствии конформационного состояния полимерных цепей в ди- и полимолекулярных агрегатах ионы металлов способствуют образованию прочных студней и гелей, что имеет важное практическое значение.
Количественное определение содержания кальция в пектине
Для определения содержания кальция в растительном сырье, необходимо привести его из связанного в растворимое состояние. Для того, чтобы растворить кальций необходимы сильные кислоты, такие как HCI ,H2S04,HN03 и др.
Для определения Са + в ПВ , необходимое количество (- 100мг ) образца обрабатывают 4н раствором соляной кислоты (20 мл ) и нейтрализуют 4н раствором NaOH (20 мл ). Полученный раствор разбавляют до 100мл, добавляют 5 мл аммиачного буферного раствора, рН=10-11 (буферный раствор готовят следующим образом ; взвешивают на технических весах 54 г . NH4CI, отмеряют мензуркой 350 мл коцентрированного раствора NH4OH, смешивают их и разбавляют дистиллированной водой до общего оъема 1л. NH4CI и NH4OH не должны содержать щелочноземельных, цветных и черных металлов) и 0,5- 1,0 мл раствора индикатора эриохрома черного Т. ( вместо раствора индикатора можно брать порошкообразную его смесь с NaCI 1:100, прибавляя ее небольшими порциями до получения винно-розовой окраски раствора). Раствор нагревают до 40С и титруют 0,05н раствором трилона Б до перехода окраски в сине-зеленую. Если раствор не содержит заметных количеств солей магния, то перед титрованием вводят 5 г. комплексоната магния (Na+)2[MgY] "
Если в растворе имеется небольшое количество тяжелых металлов, то в его добавляют 0,5 г Na2S. Содержание кальция вычисляют по формуле : 2+_V.N. .20,04 где, V-объем раствора полученного после разведения, мл; Vi- объем раствора трилона Б, мл; Vy объем пробы раствора, взятой для титрования, мл; N- нормальность раствора трилона Б; 20.04- эквивалент ионов кальция.
Похожие диссертации на Физико-химические аспекты получения и применения пектиновых полисахаридов
