Ранняя диагностика эндогенного гиперкортицизма. Канонический WNT сигнальный путь и изменение костного метаболизма при глюкокортикоидном остеопорозе Белая, Жанна Евгеньевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Белая, Жанна Евгеньевна. Ранняя диагностика эндогенного гиперкортицизма. Канонический WNT сигнальный путь и изменение костного метаболизма при глюкокортикоидном остеопорозе : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.01.02 / Белая Жанна Евгеньевна; [Место защиты: Федеральное государственное учреждение Эндокринологический научный центр].- Москва, 2014.- 258 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 26

1.1.Классификация ЭГ 26

1.2 Эпидемиология эндогенного гиперкортицизма 27

1.3 Клинические проявления эндогенного гиперкортицизма 28

1.4.Лабораторная диагностика эндогенного гиперкортицизма 30

1.4.1 Свободный кортизол в суточном анализе мочи 33

1.4.2 Малая проба с дексаметазоном 34

1.4.3 Исследование кортизола в вечерней слюне 34

1.4.4 Сороковосьми-часовая проба с дексаметазоном 2 мг в

день 41

1.4.5 Сороковосьми-часовая проба с дексаметазоном 2 мг в день в сочетании со стимуляцией кортиколиберином 41

1.4.6 Вечерний кортизол в сыворотке крови 42

1.4.7 Тест со стимуляцией десмопрессином 43

1.4.8 Исследование остеокальцнна для диагностики ЭГ 43

1.4.90пределение кортизола в волосах 45

1.5 Нозологическая диагностика ЭГ 46

1.5.1 Дифференциальный диагноз АКТГ-зависимого н

АКТГ-независимого ЭГ 46

1.5.2 Дифференциальный диагноз АКТГ-зависимого ЭГ 46

1.5.3 Диагностические возможности селективного забора крови из НКС на фоне стимуляции кортиколиберином для дифференциальной диагностики АКТГ-зависнмого ЭГ 50

1.5.4 Сравнительный анализ диагностических возможностей селективного забора крови нз НКС на фоне стимуляции кортиколиберином с другими тестами для дифференциальной диагностики АКТГ-завнсимогоЭГ 51

1.5.5 Использование селективного забора крови из НКС для уточнения локализации аденомы 53

1.5.6. Альтернативные методы забора крови от гипофиза 54

1.5.7 Применение десмопрессина в качестве альтернативного кортиколибернну стимуляционного агента в ходе проведения селективного забора крови из нижних каменистых синусов 55

1.5.8 Ограничения метода селективного забора крови из нижних каменистых синусов 56

1.5.9 Варианты улучшения диагностических возможностей селективного забора крови из нижних каменистых синусов 57

1.5.10 Возможные осложнения селективного забора крови из нижних каменистых синусов 58

1.6 Глюкокортикоидный остеопороз. Общие сведения 60

1.7 Патогенез глюкокортнкондного остеопороза 62

1.7.1 Системные эффекты гипсркортицизма на костную ткань и повышение риска переломов 62

1.7.2 Влияние гипсркортицизма на костный обмен и клетки костной ремоделирующей единицы 63

1.8 Основы регуляции остеобластогенеза через Wnt-сигнал 67

1.8.1 Общие механизмы активации и подавления Wnt сигнала 67

1.8.2 Краткая характеристика агонистов и антагонистов Wnt сигнала 69

1.8.3 Wnt-сигнал ьный путь в дифференцировке остеобластов и их выживаемости. Влияниесупрафизиологических доз ГК 69

1.9 Распространенность низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ 71

1.10 Оценка минеральной плотности и качества кости. Предикторы низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ 74

1.10.1 Потеря МПК при ЭГ 74

1.10.2 Использование FRAX для выбора пациентов, которые нуждаются в лечении ГКО 75

1.10.3 Анализ факторов риска низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ 76

1.11 Восстановление костной ткани после достижения ремиссии ЭГ 77

1.12 Возможности медикаментозного лечения ГКО у пациентов сЭГ 77

1.13. Способы оценки качества жизни у пациентов с ЭГ 80

1.14. Качество жизни пациентов с ЭГ в активной стадии заболевания 80

1.15. Возможности реабилитации ЭГ. Качество жизни пациентов в ремиссии 81

Глава 2. Материалы и методы исследования 83

2.1 Пациенты, включенные в исследование 83

2.2 Этапы исследования 84

2.3 Анализ жалоб, проявлений и осложнений ЭГ, сбор анамнеза по низкотравматичным переломам 98

2.4 Лабораторные исследования 99

2.5 Методики забора биологического материала и проведения фармакологических проб 100

2.6 Технические особенности выполнения селективного забора венозной крови из нижних каменистых синусов (ИКС) 101

2.7 Инструментальные исследования 103

2.8 Изучение качества жизни и функциональных возможностей пациентов 103

2.9 Клинические базы для выполнения исследований 105

2.10 Статистический анализ данных 106

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 109

3.1 Распространенность клинических проявлений в когорте пациентов с ЭГ 109

3.2. Диагностические возможности определения свободного кортизола в слюне методом ЭХЛА среди пациентов с ожирением, направленных для исключения ЭГ 114

3.3 Оценка необходимой кратности исследования свободного кортизола в вечерней слюне 122

3.4 Сравнительный анализ различных методов диагностики ЭГ 125

3.5. Выбор оптимальной комбинации методов диагностики ЭГ для достижения максимальной чувствительности и специфичности 128

3.6 Определение остеокальцнна в сыворотке крови для верификации ЭГ среди пациентов с ожирением 131

3.7 Исследование остеокальцнна для верификации ЭГ среди пациентов в постменопаузе с остеопрозом 135

3.8 Возможности первых рутинных методов подтверждения АКТГ-зависимого гиперкортицизма для верификации этиологии заболевания 139

3.9 Двухсторонний селективный забор крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином в дифференциальной диагностике АКТГ-зависимого гиперкортицизма 143

3.10 Возможности повышения чувствительности и специфичности селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином 149

3.11 Безопасность селективного забора крови из НКС на фоне стимуляции десмопрессином 161

3.12 Антагонисты Wnt-сигналыюго пути в подавлении остеобластогенеза у пациентов с ЭГ 163

3.13 Содержание РАНКЛ, остеопротегернпа в сывороте крови у пациентов с ЭГ 174

3.14 Сывороточные уровни ингибиторов Wnt сигнала и РАНКЛ, ОПГ у пациентов с ЭГ в зависимости от наличия или отсутствия низкотравматичных переломов 177

3.15 Распространенность низкотравматичных переломов в когорте пациентов с ЭГ 180

3.16 Предикторы развития низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ 182 3.17 Влияние низкотравматичных переломов на функциональные возможности и качество жизни пациентов с эндогенным гиперкортицизмом 189

3.18 Клинический случай 1 (иллюстрирует сложности первичной диагностики ЭГ) 198

3.19 Клинические случаи 2 и 3 (иллюстрируют сложности дифференциальной диагностики АКТГ- зависимого ЭГ) 207

3.20 Клинический случай 4 (иллюстрирует возможности оценки градиента пролактина для контроля положения катетера при заборе крови из НКС; успешную беременность на фоне приема ибандроновой кислоты) 215

Выводы 227

Практические рекомендации 229

Приложение 1. Список публикаций по теме диссертации 231

Приложение 2. Опросник по здоровью EQ-5D; визуально аналоговая шкала 239

Приложение 3. Опросник ECOS 16 242

Приложение 4. Шкалы для оценки выраженности болевого

синдрома 248

Список литературы

Сороковосьми-часовая проба с дексаметазоном 2 мг в день в сочетании со стимуляцией кортиколиберином
Применение десмопрессина в качестве альтернативного кортиколибернну стимуляционного агента в ходе проведения селективного забора крови из нижних каменистых синусов
Методики забора биологического материала и проведения фармакологических проб
Двухсторонний селективный забор крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином в дифференциальной диагностике АКТГ-зависимого гиперкортицизма

Введение к работе

Актуальность темы

Эндогенный гиперкортицизм (ЭГ), обусловленный гиперсекрецией кортизола вследствие адренокортикотропин (АКТГ)-, кортиколиберин (КРГ)- или кортизол-секретирующего новообразования различной локализации, - одна из наиболее тяжёлых патологий в эндокринологии. Заболеваемость ЭГ варьирует по различным источникам от 2-3 (Steffensen С, et.al., 2010) или 10 случаев на миллион (Guaraldi F, et.al., 2012) до 2-5% при активном скрининге пациентов с плохоконтролируемыми заболеваниями, такими как сахарный диабет, гипертония, остеопороз (Catagri В, et.al.,2003, Chiodini I, et.al.. 2007 Chiodini I, 2009). Течение ЭГ, как правило, прогрессирующее с увеличением риска всех осложнений инвалидизации и летальности (Nieman LK, et.al, 2008), что определяет необходимость ранней диагностики.

Исследование уровня кортизола в слюне кажется наиболее привлекательным первым исследованием скрининга среди пациентов с клиническими симптомами ЭГ, т.к. не требует участия среднего медперсонала, фармакологического вмешательства, безболезненно, легко выполняется пациентом, занимает мало времени, не нуждается в предварительной экстракции в отличие от кортизола в суточной моче (Putigano S, et.al. 2003). Вместе с тем, различия в точке разделения, рекомендуемые для одного и того же метода (от 2,8 нмоль/л до 15,2 нмоль/л) делают интерпретацию результата крайне затруднительной (Alexandraki KI, et.al. 2011). Авторитетные исследователи включили необходимость стандартизации определения свободного кортизола в слюне, наряду с некотороми другими гормонами в число приоритетных задач 21 века (Wartofsky L, et.al., 2011). Всё большую распространённость приобретают электрохемилюминесцентные методы (ЭХЛА), выполняемые на полностью автоматизированных анализаторах, что позволяет добиться быстрого и точного результата. Такие анализаторы обладают достаточной чувствительностью для определения свободного кортизола в слюне. Однако внедрение нового метода требует разработки референтного интервала и точки разделения. Кроме того, оправдано внедрение новых диагностических маркеров, в том числе хорошо знакомых смежным специалистам. В этой связи, оценка диагностических возможностей определения маркера костеобразования - остеокальцина у пациентов без лечения с впервые выявленным остеопорозом может быть актуальной. Имеется потребность в обоснованных рекомендациях по оптимальной последовательности и комбинации тестов, а также кратности выполнения различных диагностических исследований в рамках обследования для исключения ЭГ.

После установления диагноза ЭГ наибольшие сложности возникают при проведении точного дифференциального диагноза АКТГ-зависимого гиперкортицизма. «Золотым

стандартом» для дифференциальной диагностики болезни Иценко-Кушинга (БИК) и АКТГ-эктопированного синдрома признан селективный забор крови из нижних каменистых синусов (НКС) с определением градиента АКТГ центр/периферия до и после введения кортиколиберина (Newell-Price J, 2006). Объективные сложности связаны с отсутствием кортиколиберина в РФ, а также его высокой стоимостью. Внутривенное введение десмопрессина как альтернативого агента возможно всвязи с наличием в кортикотрофах рецепторов к вазопрессину (Machado МС, et.al. 2007), экономически более оправдано, но менее изучено. Ложно-отрицательные результаты селективного забора крови, обусловленные неправильным положением катетера, приводят к отсрочке нейрохирургического вмешательства и дорогостоящему поиску источника АКТГ-эктопии, а в некоторых случаях могут повлечь неоправданное хирургическое вмешательство. Разработка, оценка и внедрение методов, улучшающих чувствительность и специфичность селективного забора крови из НКС, является важной задачей мирового научного сообщества (Неапеу АР, et.al., 2004).

Глюкокортикоидный остеопороз (ГКО) вследствие экзогенного гиперкортицизма -наиболее распространенная причина вторичного остеопороза (Watts, et.al., 2010). По некоторым данным, супрафизиологические дозы глюкокортикоидов (ГК) получает до 1-3% населения (van Staa ТР, et.al. 2000). Негативное влияние ГК на костный обмен в большей степени реализуется через уменьшение количества остеобластов, снижение их функциональной активности и повышение апоптоза остеобластов и остеоцитов (Lekamwasam S, et,al, 2000). Согласно современным представлениям, подавление канонического Wingless/p-catenin сигнального пути (Wnt сигнал) является ключевым механизмом подавления костеобразования при ГКО. В экспериментальных исследованиях на грызунах и культурах клеток ГК в супрафизиологических дозах стимулировали экспрессию генов, кодирующих антагонисты Wnt сигнала, в частности секреторного связывающего белка фризельда 1 (сФРЗІ) (Wang F-S, 2005), диккопфа 1 (Дккі) (Wang F-S, 2008, Yao W, 2008) и склеростина (Yao W, 2008). Результаты экспериментальных исследований позволяют только сформулировать гипотезу и должны быть подтверждены у человека (Lekamwasam S, et,al, 2012). Пациенты с экзогенным гиперкортицизмом получают различные дозы и типы ГК по поводу различных заболеваний, которые сами по себе по-разному негативно влияют на костную ткань. Пациенты с ЭГ чаще заболевают в молодом возрасте на фоне полного здоровья, повышение эндогенного кортизола достаточно выраженное, не зависит от рекомендованной дозы и комплаенса пациента, а также типа ГК. Таким образом, пациенты с ЭГ могут служить лучшей моделью для изучения ГКО и содержания внеклеточных антагонистов Wnt сигнала в условиях гиперкортицизма у человека. Исследование молекул регуляторов остеоклатогенеза: лиганда рецептора активатора ядерного фактора капа-бета (РАНКЛ) и остеопротегерина (ОПТ), как основных молекул, от соотношения

которых зависит привлечение зрелых остеокластов (Silva I, 2012), позволит лучше понимать изменений в остеокластогенезе у пациентов с ЭГ.

Подобные исследования актуальны для выбора наиболее специфичных таргетных молекул для терапевтического вмешательства у человека с ГКО.

Стероидная миопатия и низкотравматичные переломы остаются значимыми клиническими проявлениями и тяжелыми осложнениями у пациентов с ЭГ (Kaltsas G,et.al. 2010). Ввиду редкости ЭГ, опубликованные работы по распространенности низкотравматичных переломов в этой категории пациентов включают не более 80-100 больных (Tauchmanova L, et.al, 2006, Vestergaard Р, et.al, 2002). Еще меньше исследований посвящено анализу предикторов низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ. Между тем, своевременная антиостеопоретическая терапия, назначенная пациентам с высоким риском переломов, могла бы предупредить появление инвалидизирующих осложнений на этапе поиска источника гиперкортицизма или при невозможности полного излечения.

ЦЕЛЬЮ настоящей работы стала оптимизация и внедрение новых методов диагностики и дифференциальной диагностики эндогенного гиперкортицизма; современный анализ патогенеза ГКО, распространенности низкотравматичных переломов, их предикторов у пациентов с эндогенным гиперкортицизмом

В соответствие с установленной целью были поставлены следующие

Проанализировать распространенность жалоб, проявлений и осложнений ЭГ с выбором наиболее характерной комбинации клинических симптомов для проведения скрининга у пациентов с ожирением
Изучить диагностические возможности и разработать точку разделения для определения вечернего кортизола в слюне методом ЭХЛА на автоматическом анализаторе для диагностики ЭГ среди пациентов с ожирением или избыточной массой тела; сравнить его возможности с другими тестами для диагностики ЭГ.
Определить оптимальную последовательность и кратность тестов для диагностики ЭГ, оценить их комбинированные возможности
Изучить возможности исследования остеокальцина в сыворотке крови для диагностики гиперкортицизма среди пациентов с ожирением и сравнить его диагностическую ценность с другими тестами
Исследовать диагностическую ценность остеокальцина для верификации ЭГ среди пациентов с впервые выявленным остеопорозом в постменопаузе

Сравнить диагностические возможности рутинных лабораторных исследований в дифференциальной диагностике АКТГ-зависимогого гиперкортицизма, рассчитав точку разделения для выявленного теста с наибольшей диагностической ценностью
Проанализировать диагностические возможности и безопасность селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимого гиперкортицизма
Изучить возможности по улучшению чувствительности и специфичности селективного забора крови путем определения градиента пролактина и/или расчета АКТГ/пролактин нормализованного соотношения
Исследовать содержание антагонистов Wnt-сигнала (диккопф 1, секреторный связывающий белок фризельда 1, склеростин), а также РАНКЛ, ОПТ в сыворотке крови у пациентов с ЭГ по сравнению со здоровым контролем и соотнести их уровни с маркерами костного обмена
Исследовать распространённость низкотравматичных переломов среди пациентов с ЭГ, наиболее значимые клинические предикторы развития низкотравматичных переломов и их влияние на качество жизни и функциональные возможности пациентов.

Научная новизна:

Впервые в России изучены диагностические возможности автоматизированного электрохемилюминесцентного метода определения кортизола в слюне для верификации ЭГ среди пациентов с ожирением и избыточной массой тела

Впервые проведен прямой сравнительный анализ различных методов первичной диагностики ЭГ

Впервые исследована роль остеокальцина для диагностики ЭГ, в том числе в дифференциальной диагностике постменопаузального остеопороза (ПМО) и ГКО на фоне ЭГ у пациентов старше 45 лет.

Впервые в России исследованы возможности селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимого гиперкортицизма

Впервые в России исследована возможность контроля положения катетера при селективном заборе крови из ИКС по градиенту пролактина

Впервые проанализированы возможности улучшения чувствительности и

специфичности селективного забора крови из ИКС в результате расчета АКТГ/пролактин

нормализованного соотношения, когда в качестве стимуляционного агента используется

десмопрессин

Впервые изучены патогенетические аспекты глюкокортикоидного остеопороза на модели пациентов с ЭГ с определением концентрации белков основных сигнальных путей остеобластогенеза (антагонисты Wnt сигнала) и остеокластогенеза (РАНКЛ/ОПГ)

Впервые описаны изменения концентрации антагониста канонического Wnt-сигнала - склеростина, ключевого ингибитора дифференцировки мезенхимальной стволовой клетки в остеобласт, в сыворотке крови пациентов с ЭГ.

Впервые на достаточно большой выборке пациентов методом многофакторного анализа предложены основные предикторы низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ

Практическая значимость работы:

Выделена наиболее частая комбинация субъективных жалоб и проявлений ЭГ для выбора пациентов, нуждающихся в скрининге на ЭГ

Разработана точка разделения для свободного кортизола в вечерней слюне, измеренного методом ЭХЛА на автоматическом анализаторе, для диагностики ЭГ среди пациентов с ожирением, отработан реферетный интервал для этого метода у здоровых добровольцев.

Предложена оптимальная последовательность тестов для первичной диагностики ЭГ среди пациентов с избыточной массой тела или ожирением с оптимизацией чувствительности, специфичности и удобства для практического здравоохранения, которая объединена в алгоритм диагностики ЭГ.

Рассчитана точка разделения для уровня остеокальцина в сыворотке крови для диагностики ЭГ среди пациентов с ожирением и пациентов с остеопорозом старше 45 лет. Определена роль определения остеокальцина среди других диагностических тестов

Оптимизированы показания и методика интерпретации селективного забора крови из НКС на фоне стимуляции десмопрессином для дифференциальной диагностики АКТГ-зависимого ЭГ.

Разработана точка разделения для градиента пролактина и АКТГ/пролактин нормализованного соотношения в ходе селективного забора крови из НКС, отработаны критерии неверной установки катетера и показания для повторного забора крови из НКС, а также ограничения АКТГ/пролактин нормализованного соотношения при оценке максимального градиента АКТГ после стимуляции десмопрессином

Выделены наиболее значимые предикторы низкотравматичных переломов у пациентов с ЭГ, которыми стали уровни кортизола в суточной моче и вечернего кортизола в крови, т.е. тяжесть гиперкортицизма как таковая. Пациентам высокого риска на этом основании

может быть предложена терапия для профилактики ГКО

Пациенты с ожирением или избыточной массой тела при наличии плохо контролируемых проявлений метаболического синдрома, жалоб на общую и мышечную слабость и/или низкотравматичных переломов нуждаются в обследовании для исключения ЭГ
Состояние функционального гиперкортицизма, в частности, ожирение, завышает оптимальную точку разделения уровня вечернего кортизола в слюне для диагностики ЭГ.
Комбинация однократного исследования уровня кортизола в вечерней слюне методом ЭХЛА и малой пробы с дексаметазоном для диагностики ЭГ позволяет добиться максимальной чувствительности и специфичности для конкордантного результата при оптимальном удобстве для пациента.
Исследование остеокальцина может применяться в качестве дополнительного теста для диагностики ЭГ. Низкий уровень остеокальцина у нелеченных пациентов с низкотравматичными переломами тел позвонков в том числе в постменопаузе является основанием для исключения ГКО на фоне ЭГ
Диффренциальная диагностика АКТГ-зависимого ЭГ в ходе селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином может быть улучшена при определении градиента пролактина и АКТГ/пролактин нормализованного соотношения
Состояние эндогенного гиперкортицизма у человека препятствует физиологическому снижению уровня склеростина. Именно склеростин среди других протестированных молекул (Дккі, сФРЗ, РАНКЛ, 0111) является наиболее многообещающей молекулой для терапевтического вмешательства с целью повышения костеобразования у пациентов с ГКО.
Пациенты с высоким содержанием свободного кортизола в суточной моче (выше 1960 нмоль/24ч) и/или вечернего кортизола в крови (выше 674 нмоль/л) имеют повышенный риск развития низкотравматичных переломов и нуждаются в дополнительном обследовании с решением вопроса о назначении профилактического лечения остеопороза

Апробация работы

Официальная апробация диссертации состоялась 14 ноября 2013 года на расширенном заседании межотделенческой научной конференции ФГБУ ЭНЦ Минздрава России. Основные результаты работы доложены на ученом совете ФГБУ ЭНЦ МЗ РФ 15 ноября 2011 года; в рамках Московского общества эндокринологов в 2009 и 2011 гг; в рамках V Всеросийского конгресса «Современные технологии в эндокринологии» (май

2009); на образовательной конференции с международным участием Pituitary Masterclass в Санкт-Петербурге 14.09.2011; на внутренней конференции повышения квалификации врачей Московского эндокринологического диспансера (07.01.2012); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии" в Санкт-Петербурге (24.05.2013); в рамках IV (сентябрь 2010г) и V (ноябрь 2013) Российского конгресса по остеопорозу; VI Всероссийского конгресса эндокринологов (май 2012); награда за лучший постер присуждена в рамках ENEA Workshop on Cushing's syndrome (декабрь 2009 Италия, Неаполь), постерные доклады выполнены в рамках 14 congress European Neuroendocrine Association (сентябрь, 2010 Бельгия), на 12 European Congress on osteoporosis and osteoarthritis (март 2012 Франция); The Endocrine Society's 94^th Annual Meeting and Expo (июнь 2012 США (Хьюстон)), в рамках American Society of Bone and Mineral Research 2012 Annual Meeting. Minneapolis, Minnesota (октябрь 2012 США). Научная ценность работы была отмечена именным приглашением для участия с тем же докаладом на 16^th European Congress on Osteoporosis and Osteoarthritis (ESCE013-IOF) апрель 2013 Италия; постерный доклад на 15th European Congress of Endocrinology (Дания 2013) и в рамках 50^і European Calcified Tissue Society 2013 (мая 2013 Португалия); устный доклад был представлен на 15^th Congress of the European Neuroendocrine Association 12-15 сентября 2012 Австрия (Вена)

Публикации

По теме диссертации всего опубликовано 40 печатных работ, в том числе в центральных, рецензируемых ВАК Министерства Образования РФ медицинских журналах -17, международные статьи в журналах, индексируемых в PubMed - 3; главы в международных изданиях на английском языке - 1, электронная книга на английском языке - 1, главы в федеральных руководствах - 2, методические рекомендации для врачей, одобренные Минздравом - 1, тезисы, опубликованые зарубежом - 9 и тезисы, опубликованые в сборниках Российских конференций - 6.

Внедрение результатов работы

Результаты работы включены в стандарты высоко-технологической медицинской помощи пациентам с БИК, с синдромом Кушинга, вошли в методические рекомендации, одобренные МЗ, внедрены и активно примененяются для ведения пациентов в ФГБУ ЭНЦ, Московском эндокринологическом диспансере, Московском областном научно-исследовательском институте имени Владимирского, в ведущих медицинских учреждениях Санкт-Петербурга и других городов России.

Объем и структура диссертации

Сороковосьми-часовая проба с дексаметазоном 2 мг в день в сочетании со стимуляцией кортиколиберином

ЭГ традиционно считается редкой патологией. Результаты исследований в Италии, Дании и Испании свидетельствуют о заболеваемости примерно 2-3 случая на миллион населения [28, 208, 322]. Среди спектра нозологии, приводящих к ЭГ, заболеваемость БИК оценивается 1,2 -2,4 случаев на миллион населения; кортизол-секретирующей аденомой надпочечника - 0,6 случая на миллион и карциномой надпочечника 0,2 - на миллион населения [208]. Распространённость БИК соответствует 39,1 случаев на миллион [107]. В 1937 году в институте клинической и экспериментальной эндокринологии, традиции которого наследовал ФГБУ ЭНЦ, была зарегистрирована всего 1 пациентка с болезнью Иценко-Кушинга (БИК) и всего 39 пациентов с БИК находились под наблюдением [11].

Однако, если мы обратимся к официальным данным по редким заболеваниям Национального Института Здоровья США, заболеваемость ЭГ оценивается несколько выше - 10-15 случаев на миллион населения [141, 245]. При активном скрининге пациентов с плохо контролируемыми заболеваниями, которые можно отнести к проявлениям ЭГ, заболевание выявляется значительно чаще [31, 64, 67, 198, 260]. Так, среди больных с плохо контролируемым сахарным диабетом ЭГ обнаруживался в 2-5% [64, 198]. Среди 219 пациентов, направленных по поводу идиопатического остеопороза, гиперкортицизм был выявлен в 11 (4,8% ) случаев [67]. При этом распространённость была еще выше (10,8%)) среди пациентов с переломами позвонков [67]. Скрининг пациентов с артериальной гипертензией подтвердил ЭГ у 4% [260]. Наконец, у 1 из 250 женщин с гирсутизмом при активном поиске была выявлена БИК [241].

При естественном течении ЭГ, пятилетняя выживаемость составляет 50% [275], но значительно улучшается даже при паллиативном лечении -двухсторонней адреналэктомии до 86% [253]. При своевременной диагностике и лечении ремиссии удаётся добиться в 80% случаев, и смертность у пациентов в ремиссии не отличается от популяционной [73, 274].

Ранняя диагностика ЭГ чрезвычайно важна, не только из-за повышения летальности, но и в связи с быстрым развитием и прогрессированием различных осложнений заболевания, последствия которых не всегда обратимы. Симптомы эндогенного гиперкортицизма чрезвычайно разнообразны и неспецифичны [13, 251]. На Рисунке 1 представлена наиболее яркая клиническая картина изменений внешности при гиперкортицизме.

Далеко не всегда пациенты имеют все характерные симптомы и изменения внешности. Можно выделить более специфичные признаки, такие как багровые стрии шириной более 1 см, матронизм (яркий румянец, лунообразное лицо), проксимальная миопатия и лёгкое образование синяков [141, 251]. Общая частота этих симптомов варьирует от 60-80% (хотя бы один из перечисленных симптомов) среди 481 пациента с манифестным гиперкортицизмом, согласно данным из исследования ERCUSYN [343] и Итальянской работы с включением 423 больных ЭГ [49]. В клинической картине чаще лидируют менее специфические симптомы такие, как: прибавка массы тела (80-96%); гипертеизия (60-88%) [49, 251, 343]. Достаточно часто регистрируется гирсутизм и нечистота кожи (37-67%); нарушения менструального цикла (38-69%); снижение полового влечения (50%); депрессия или изменение настроения 29-55%) (нарушения, требующие психиатрической помощи реже); сахарный диабет 20-41% с увеличением до 70%), если включать различные нарушения толерантности к углеводам; остеопороз и переломы от 21-40% [49, 343] до 67%) при более активном поиске [332]. Описано также облысение или выпадение волос (10-31%), отеки (15% ), полидипсия и полиурия (10%)), инфекции, в том числе грибковые (8%) и нефролитиаз [251].

Вместе с тем, исследование в Германии в 2011 году показало, что, несмотря на все симптомы заболевания, ЭГ не диагностируется у врача по месту жительства в среднем 4,8 лет. Смена участкового врача или госпитализация пациента, как правило, становится переломным моментом для установления диагноза [280]. По-видимому, на фоне пандемии ожирения, сахарного диабета, остеопороза, артериальной гипертензии и сочетания некоторых осложнений в рамках метаболического синдрома, врачи не склонны задумываться о более редком заболевании. Кроме того, некоторые исследователи предостерегают от массового скрининга на ЭГ, так как прямые и косвенные затраты на увеличение скрининга, по их мнению, могут превысить пользу [328]. Важно более точно выделять группы пациентов, которые подлежат лабораторной диагностике.

Перед проведением любых лабораторных исследований необходимо исключить экзогенное введение ГК. Согласно глобальным исследованиям 1-3% взрослых людей получают терапию ГК [94, 353]. В некоторых случаях, пациенты не связывают изменение внешности с приемом ГК, и факт применения препаратов выявляется только при активном расспросе.

В дальнейшем лабораторную диагностику ЭГ можно разделить на два этапа: 1. лабораторное подтверждение эндогенной гиперпродукции кортизола; 2. верификация этиологии ЭГ при условии, что ЭГ был подтвержден на первом этапе. Для первоначального скрининга рекомендуются следующие тесты [5, 6, 251]: определение уровня свободного кортизола в суточной моче; определение уровня свободного кортизола в образце слюны, собранной пациентом в вечернее время (в 23.00); малая проба с дексаметазоном.

Другие исследования для диагностики эндогенного гиперкортицизма (длинный тест с дексаметазоном (2 мг в день на 48 часов); исследование уровня кортизола в сыворотке крови в 23.00 у бодрствующего или спящего пациента) не обладают лучшими диагностическими возможностями, но более трудоёмки или требуют госпитализации пациента, поэтому не предлагаются в качестве первых методов скрининга [251], однако могут быть использованы по желанию врача.

Ввиду низкой диагностической информативности не рекомендуется использовать случайное определение уровня кортизола в слюне или сыворотке крови, а также АКТГ, в том числе в утренние часы, исследовать мочу на 17-кетостероиды, проводить тест толерантности к инсулину с определением кортизола, тест с лоперамидом. Не целесообразно для установления факта наличия гиперкортицизма проводить тесты, которые используются для дифференциальной диагностики уже установленного гиперкортицизма (например, ритм АКТГ, большая проба с дексаметазоном (8мг)) [251].

Методы визуализации (магнитнорезонансная томография, компьютерная томография и т.д.) оправданы уже после лабораторного подтверждения ЭГ ввиду высокой распространённости инсиденталом в популяции, а также высокой стоимости [251].

Применение десмопрессина в качестве альтернативного кортиколибернну стимуляционного агента в ходе проведения селективного забора крови из нижних каменистых синусов

Биохимические исследования выполнялись на биохимическом анализаторе Hitachi 912, стандартными наборами фирмы Roche Гормональные исследования кортизол в сыворотке крови (референсные значения утро 123-626 нмоль/л; вечер 46,0-270,0 нмоль/л), АКТГ (референсные значения утро 7,0-66,0 пг/мл; вечер 0,0-30,0 пг/мл), остеокальцин (референсные значения 11,0-43,0 нг/мл), С-концевой телопептид коллагена первого типа (СТх) (референсные значения 0,01-0,69 нг/мл) проводились на электрохемилюминесцентных анализаторах фирмы Roche (Elecsys 2010; Cobas е601) стандартными наборами фирмы F. Hoffmann-La Roche Ltd. Пролактин (референсные значения 60-510 мЕД/л) исследовался иммунохемилюминесцентным методом на автоматизированной системе Vitros (Johnson@Johson). Инсулиноподобный фактор роста (ИРФ1) (референсные значения по возрасту), витамин D измеряли иммунохемилюминесцентным методом на аппарате Liaison.

Исследование свободного кортизола в суточной моче проводилось иммунохемилюминесцентным методом на аппарате Vitros ECi с предварительной экстракцией диэтиловым эфиром; референсные значения: 60-413 нмоль/24 часа.

Свободный кортизол в слюне измерялся на автоматическом анализаторе Cobas е 601 фирмы F. Hoffmann-La Roche Ltd, (диагностический набор Cortisol кат. № 11875116 122) методом электрохемилюминесцентный иммуноанализ (ЭХЛА). Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов слюны на свободный кортизол проводился с помощью DRG Salivary Cortisol ELISA KIT SLV-2930.

Уровень склеростина в сыворотке крови исследовался с помощью коммерчески доступного набора для иммуноферментного анализа (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Со KG, Vienna, Austria rev.no. 100728, референтный интервал, предложенный производителем - 5%-95% персентиль: 11.9 - 47.9 pmol/L; с возможностью перевода 1 пг/мл = 0,044 пмоль/л. Уровень Дккі в сыворотке крови исследовался иммуноферментным методом (Enzo Life Sciences 100 ADI-900-151). Сыворотчный сФРЗІ измерялся методом ИФА с помощью коммерчески доступного Uscn Life Science Inc, E95880Hu.

Содержание РАНКЛ и ОПТ в сыворотке крови было измерено методом ИФА с применением коммерчески доступного набора (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Со KG Vienna, Austria rev.no. 090130 (РАНКЛ) и rev. no. 100131 (ОПТ).

Сбор слюны производился в 23.00 два дня подряд с использованием специальной системы для сбора слюны Salivette Sarstedt. Каждому пациенту на руки выдавалась листовка с правилами использования Salivette и рекомендациями не употреблять спиртные напитки за сутки, не есть, не курить, не чистить зубы и не употреблять напитков, кроме простой воды, в течение 30 минут до сбора слюны (слюна собиралась, как указано на Рисунке 2). После сбора слюны пробирка помещалась в холодильник (не в морозильное отделение). Сбор слюны всегда производился самостоятельно пациентом, не контролировался медицинским персоналом, в том числе и у стационарных больных. Пробирки центрифугировались в течение 2-Зх минут 1000 оборотов в минуту. Затем образцы слюны в порядке поступления направлялись для проведения ЭХЛА и эти же образцы были заморожены при температуре -70 градусов по Цельсию для одномоментного проведения ИФА.

Заборы крови из периферической вены выполнялись утром натощак 8-10.00 утра, за исключением вечернего кортизола и АКТГ. Образцы крови центрифугировались и направлялись для соответствующих рутинных биохимических и лабораторных исследований в порядке поступления. Образцы сывороток для исследования РАНКЛ, ОПТ, Дккі, сФЗД 1 и склеростина были заморожены для одномоментного проведения исследования в группе пациентов и в контрольной группе. Все образцы (контроль и пациенты) были запущены одновременно в соответствие с рекомендациями производителя.

Забор вечерних образцов крови для определения кортизола и АКТГ проводился у бодрствующих стационарных пациентов в 21-23 часа.

Сбор суточной мочи проводился пациентом за 24 часа в единую емкость. После измерения общего объема и перемешивания, образец мочи не менее 50 мл доставлялся в лабораторию. Пациенту было рекомендовано соблюдать обычный питьевой режим, избегать стрессовых ситуаций, исключались препараты, влияющие на содержание кортизола в суточном образце мочи.

Методики проведения фармакологических проб Малая проба с дексаметазоном проводилась по стандартному протоколу: в 23.00 (после последнего сбора слюны и после сбора мочи) пациент принимал дексаметазон 1 мг, затем утром между 8-9.00 часами проводился забор крови на кортизол. Современными клиническими рекомендациями для выявления эндогенного гиперкортицизма рекомендована точка разделения выше 50 нмоль/л после МДП [251], и этот критерий был принят нами в работе.

Большая проба с дексаметазоном проводилась только у пациентов с подтверждённым эндогенным гиперкортицизмом по стандартному протоколу: уровень кортизола исследовался исходно утром натощак, затем в 23.00 пациент принимал дексаметазон 8 мг, на следующее утро между 8-9.00 часами проводился забор крови на кортизол в сыворотке крови. Рассчитывался процент снижения уровня кортизола. Снижение кортизола на 60% расценивалось как БИК, менее 60%, как свидетельство в пользу АКТГ-эктопированного синдрома.

Методики забора биологического материала и проведения фармакологических проб

Внедрение АКТГ/пролактин нормализованного соотношения может расширить показания для определения пролактина. Впервые данный индекс был предложен для повышения чувствительности метода селективного забора крови у трёх пациентов с подтвержденной БИК, но ложно-отрицательным результатом забора крови. У этих же пациентов АКТГ/пролактин нормализованное соотношение было больше, чем 1,2, в то время как у пациентов с АКТГ-эктопией АКТГ/пролактин нормализованное соотношение было меньше 1,2 [114]. Так предложенная методика и точка разделения начали активно исследоваться. Среди 29 пациентов (17 БИК и 8 АКТГ-эктопий) АКТГ/пролактин нормализованное соотношение в интервале 0,7-1,3 не было признано диагностическим, так как все пациенты с БИК имели нормализованное отношение больше 1,3, а у пациентов с АКТГ-этопией этот показатель был меньше 0,7 [312]. Grant Р, и коллеги, провели ретроспективный анализ данных среди 83 пациентов, которым проводился селективный забор крови с рутинным определением уровня пролактина [135]. Среди этих больных у 67 пациентов был подтвержден диагноз БИК, а в 16 случаях забор крови показал отрицательный результат. Перерасчет АКТГ/пролактин нормализованного соотношения у этой когорты больных, когда уровень АКТГ/пролактин нормализованного соотношения 0.8 был признан позитивным в отношении БИК, так как было выявлено еще 6 случаев БИК, и результат был подтвержден гистологически в 5 случаях [135].

Впервые в рамках настоящего исследования максимальное отношение АКТГ для расчетного индекса получено на фоне стимуляции десмопрессином. Проспективный дизайн исследования с включением достаточного количества пациентов позволил рассчитать точку разделения на основании анализа кривой операционной характеристики с целью максимизировать чувствительнось и специфичность, что также было сделано впервые. Точка, полученная в данной работе -1,18 ближе к двум более ранним работам, т.е. к предложенным точкам разделение 1,2 [114] и 1,3 [312] для АКТГ/пролактин нормализованного соотношеня. Вместе с тем, в настоящем исследовании АКТГ/пролактин нормализованное соотношение имело некоторое преимущество в отношении специфичности и, напротив, меньшую чувствительность по сравнению с традиционной оценкой градиента АКТГ. В целом, применение традиционного анализа результатов по градиенту АКТГ не отличалось от оценки АКТГ/пролактин нормализованного отношения (анализ площадей под кривыми операционных характеристик). Возможно, такой результат обусловлен характером стимуляционного агента, так как максимальный градиент АКТГ после введения десмопрессина был парадоксально ниже градиента АКТГ до введения стимуляционного агента, и это стало причиной большого количества ложно-отрицательных результатов. В работах, которые описывают повышение именно чувствительности метода, использовали кортиколиберин [114, 135,312]. Кроме того, согласно результатам настоящего исследования, с осторожностью нужно интерпретировать АКТГ/пролактин нормализованное соотношение, если градиент базального пролактина оказался очень высоким. Однако, при сравнении диагностических возможностей обычного селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином, который был проведен у первых 47 пациентов и последующей когорты пациентов с контролем положения катетера по градиенту пролактина и с расчетом АКТГ/пролактин нормализованного соотношения продемонстрировал общее преимущество последнего.

В ходе проведения 120 селективных заборов крови из НКС были зарегистрированы нежелательные явления Серьезные нежелательные явления

В двух случаях было зарегистрировано падение артериального давления и тахикардия уже после процедуры, в одном из этих случаев потребовалась интенсивная терапия. У двоих пациентов были зарегистрированы отсроченные (2-5 дней) забрюшинные кровотечения, однако связь с процедурой не является абсолютно доказанной, так как кровотечения развивались на фоне инъекций прямых антикоагулянтов. В одном случае после вмешательства наблюдалась лихорадка и обострение инфекции.

К легким нежелательным явлениям были отнесены: два случая аллергической реакции (сыпь) наиболее вероятно на контрастное вещество. У троих пациентов гематомы в местах пункции бедренных вен потребовали специального лечения. Остальные нежелательные явления были транзиторными, наблюдались во время процедуры и бесследно проходили после окончания забора крови: двое пациентов жаловались на чувство слабости во время процедуры, 5 больных активно говорили о головной боли и в 1 случае боль локализовалась в височных областях. Другие жалобы пациентов были связаны с неприятными ощущениями в ушах: 1 случай заложенности ушей, 11 пациентов жаловались на шум в ушах и 6 пациентов испытывали боль в ушах.

Таким образом, до 30% больных испытывали лёгкие нежелательные явления, которые чаще всего выявлялись только при активном расспросе и бесследно проходили после завершения манипуляции или после минимальных лечебных мероприятий (лечение гематом в месте прокола бедренной вены или аллергической сыпи). В ходе проведенных заборов крови не было зарегистрировано тромбозов и тромбоэмболии, а также серьёзных неврологических осложнений.

Среди серьезных нежелательных явлений, при проведении селективного забора крови в мировой литературе описаны единичные случаи тромбоза глубоких вен и тромбоэмболии лёгочной артерии [93, 254], тромбозов кавернозных синусов, в том числе, с летальным исходом [62], повреждение ствола мозга (до 0,2%) [121, 139, 235, 254], транзиторный парез 6 пары черепно-мозговых нервов [235], один случай субарахноидального кровоизлияния и обструктивной гидроцефалии [196], случаи инсульта в зоне мосто-мозжечкового соединения [48, 324]. Среди 120 процедур, выполненных в ЭНЦ, таких серьезных нежелательных явлений не наблюдалось. Возможно, это связано с постоянным техническим усовершенствованием методики, оборудования и программного обеспечения, а также использования современных интродюссеров и катетеров. Современные технологии проведения селективного забора крови из нижних каменистых синусов продемонстрировали высокую безопасность и хорошую переносимость, что позволяет при необходимости проводить процедуру повторно. Однако, учитывая потенциальные риски, забор крови из нижних каменистых синусов должен выполняться только в высокоспециализированных учреждениях и по строгим показаниям.

Двухсторонний селективный забор крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином в дифференциальной диагностике АКТГ-зависимого гиперкортицизма

Отсутствие градиента АКТГ 2 до стимуляции и 3 после стимуляции десмопрессином в сочетание с отрицательной большой пробой с дексаметазоном и отсутствием визуализации аденомы на МРТ позволило с высокой вероятностью предположить АКТГ-эктопированный синдром, как основную причину ЭГ.

Пациентке проводились: мультиспиральная компьютерная томография грудной полости, брюшной полости, забрюшинного пространства, малого таза с контрастным усилением, ультразвуковое исследование брюшной полости, малого таза, щитовидной железы, околощитовидных желёз, эзофагогастродуоденоскопия, колоноскопия, капсульная эндоскопия кишечника, сцинтиграфия с октреотидом, диагностическая лапароскопия, неоднократно повторялось МРТ головного мозга. Новообразования обнаружить не удалось.

Пациентке М. был установлен диагноз: АКТГ-эктопированный синдром с неустановленной локализацией (скрытая опухоль). Вторичная аменорея. Стероидный остеопороз, тяжёлого течения с компресионными переломами тел Th5, Th7, ThlO. Депрессивный эпизод тяжёлой степени. Суицидальные попытки

Сопутствующий диагноз: Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь. Диффузный рефлюкс-гастрит с признаками обострения. Синдром раздраэ/сённой кишки

Было принято решение продолжить поиск новообразования, в ходе которого больной было рекомендовано консервативное лечение:

Кетоконазол 400 - 600 мг в сутки с коррекцией дозы под контролем свободного кортизола в моче. Из-за патологии верхних отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) лечение кетоконазолом приходилось прерывать для курсов блокаторов протонной помпы.

По поводу стероидного остеопороза с множественными низкотравматичными переломами тел позвонков женщине было предложено лечение БФ. Пациентке разъяснили риски и пользу такой терапии, в том числе определенные риски в случае наступления беременности даже после отмены терапии. Больная подписала информированное согласие.

При выборе БФ необходимо было учитывать патологию верхних отделов ЖКТ, поэтому предпочтение отдавалось внутривенным формам введения. На момент наблюдения за пациенткой М. в РФ были доступны два БФ для внутривенного введения: ибандроновая кислота (Бонвива) Змг 1 раз в 3 месяца и золедроновая кислота (Акласта) 5 мг 1 раз в год. Ибандроновая кислота доказала свою эффективность для предупреждения и лечения глюкокортикоидного остеопороза [146, 202, 296]. Однако официальной регистрации показания для лечения глюкокортикоидного остеопороза для ибандроната не проводилось. Тем не менее, у ибандроновой кислоты есть некоторые особенности: более высокая связь с белком (87%), т.е. меньше препарата находится в свободной циркуляции, и более короткий период полужизни в мягких тканях (24 суток) [46]. Эти особенности могут стать преимуществом в случае наступления беременности, а также определяют более быстрое выведение препарата после отмены.

Пациентке М. был рекомендован ибандронат (Бонвива) 3,0 внутривенно 1 раз в 3 месяца. Первая инфузия была сделана 30 октября 2009 года, после чего пациентка регулярно получала лечение ибандронат 3,0 -1 раз в 3 месяца в сочетании с добавками кальция и витамина D (колекальциферол 800МЕ и кальций карбонат 1000 мг).

В течение года пациентке многократно повторялись различные обследования с целью верификации локализации новообразования. Однако опухоль обнаружить не удавалось. За этот период была внедрена методика контроля положения катетера по градиенту пролактина. Было принято решение провести повторный селективный забор крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином с контролем положения катетера по градиенту пролактина. Результаты повторного забора крови из нижних каменистых синусов с контролем положения катетера по градиенту пролактина представлены в Таблице 33.

Результаты повторного селективного забора крови из нижних каменистых синусов на фоне стимуляции десмопрессином с контролем положения катетера по градиенту пролактина у пациентки М.

Таким образом, при условии градиента пролактина 1,5, градиент АКТГ 2 до стимуляции десмопрессином и 3 после стимуляции десмопрессином, что свидетельствует о наличии у пациентки БИК. Дополнительным подтверждением в пользу БИК является АКТГ/пролактин нормализованное соотношение = 7.

Видимо при первом проведении селективного забора крови, забор крови осуществлялся не из нижних каменистых синусов по техническим причинам, которые остались незамеченными для хирурга. Пациентке была проведена трансназальная аденомэктомия с достижением полной ремиссии заболевания (10.06.2010).

В исходе хирургического вмешательства развилась транзиторная надпочечниковая недостаточность. По поводу надпочечниковой недостаточности больной была рекомендована заместительная терапия кортефом. Однако из-за развития аллергической сыпи, кортеф был заменен на преднизолон с суточной потребностью 7,5 мг. Всвязи с наличием трех низкотравматичных переломов тел позвонков в анамнезе, снижением МІЖ, соответствующей выраженной остеопении и приемом преднизолона, было рекомендовано продолжить терапию остеопороза (ибандроновая кислота 3,0 внутривенно 1 раз в 3 месяца). Пациентка была предупреждена о необходимости использовать контрацептивы и продолжила терапию ибандронатом до 28.04. 2011, т.е. в общей сложности продолжительность лечения составила 16 месяцев. За время введения ибандроната, как в активный период ЭГ, так и на фоне приема преднизолона в качестве заместительной терапии не наблюдалось новых низкотравматичных переломов, а также прогрессирования уже зарегистрированных компрессий позвонков. Общая прибавка МПК за время терапии составила +11.9% в поясничных позвонках (L1-L4) и +6.8% в проксимальном отделе бедра. Общая динамика лабораторных показателей на фоне терапии ГКО представлена в Таблице 34.