Введение к работе
А КТУАЛЪНОСТЬ ТЕМЫ. Исследование пространственных
груктур биологических макромолекул методом рентгеноструктурного іализа в настоящее время является одним из важнейших направлений элекулярной биологии. Несмотря на крупные достижения в іструментальном и математическом обеспечении рентгеноструктурных хледований, получение белка в виде достаточно больших и совершенных энокристаллов до сих пор является узким местом белковой металлографии, а преодоление трудностей кристаллизации во многом гределяет успех рентгеноструктурного исследования белка в целом.
Объектами кристаллографического изучения в данной работе были абраны бактериальные белки: Р-глюкозидаза Bacillus circulans var 'kalophilus, эндонуклеаза Serratia marcescens и глутамил-эндопептидаза jcillus intermedins.
р-Глюкозидаза принадлежит к семейству ферментов, участвующих метаболизме углеводов всех живых организмов - от бактерий и низших ибов до млекопитающих. Она относится к классу гидролаз и, являясь [ним из компонентов ферментативного комплекса, превращающего іллюлозу в глюкозу, катализирует последнюю стадию этого процесса. Под йствием р-глюкозидазы целлобиоза, образующаяся при расщеплении ллюлозы, гвдролизуется до глюкозы. р-Глюкозидаза выделена из калофильного штамма бактерий Bacillus circulans var. allealophilus. :лки алкалофильных организмов, обладающие повышенной тойчивостью в щелочной среде, до сих пор мало изучены и представляют обый интерес для структурного исследования.
Эндонуклеазы, действующие на внутренние межнуклеотидные язи в молекулах как ДНК, так и РНК, осуществляют деполимеризацию клеиновых кислот в основном до олигонуклеотидов. Эндонуклеаза rratia marcescens расщепляет РНК, ДНК, а также соответствующие
одно- и двухнитевые гомополимеры с образованием 5ч-фосфорилированных олигонуклеотидов и, согласно последним данным, обладает противоопухолевой и противовирусной активностью, что, в частности, инициировало структурное исследование этого фермента.
Глутамил-эндопептидазы (протеиназы) катализируют гидролиз пептидных связей в полипептидной цепи белка. Протеиназа Bacillus intermedium по механизму действия относится к подклассу сериновых протеиназ. Она избирательно ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Протеиназы, обладающие такой специфичностью, наименее изучены в структурном плане.
Каждый из трех выбранных белков катализирует важный ферментативный процесс. Получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов этих белков и определение пространственных структур позволит понять механизм их функционирования, из чего следует актуальность данного исследования.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - поиск условий кристаллизации трех бактериальных белков - Р-глюкозидазы Bacillus circulans var Alkalophilus, эндонуклеазы Serratia marcescens и глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius, выращивание кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного исследования, и изучение влияния некоторых факторов (значения рН, введения низкомолекулярных добавок) на скорость роста, размер и качество кристаллов. Целью работы бьшо также кристаллофафическое исследование полученных кристаллов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Разработанные методики позволили получить гомогенные высокоочищенные препараты трех белков. В работе впервые найдены условия их кристаллизации и получены пригодные для рентгеновского исследования кристаллы.
Изученное в работе влияние низкомолекулярных добавок и рН белкового раствора на форму и качество кристаллов р-глюкозидазы имеет
щее значение и может быть использовано для улучшения качества тковых кристаллов.
На кристаллах эндонуклеазы проведен комплекс
исталлофафических исследований. Уточнение атомной модели юнуклеазы при разрешении 1.7 А позволило достоверно определить гменты вторичной структуры в молекуле данного белка.
Впервые получены кристаллы глутамил-эндопептидазы, пригодные ї проведения рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.
Предложенные методические разработки позволяют получать сокогомогенные препараты и выращивать крупные кристаллы белков, игодные для рентгеноструктурного исследования.
Полученные в настоящей работе результаты являются основой для ределения пространственной структуры Р-глюкозидазы. Данные такого да позволют понять механизм каталитической активности и объснить вышенную термостабильность и устойчивость в щелочной среде данного рмента.
Эндонуклеаза, обладающая противоопухолевой и противовирусной гивностью, используется при разработке терапевтических препаратов. :рмент представляет также интерес для структурно-функциональных :ледований нуклеиновых кислот и для препаративного получения 5'-клеотидов. Знание пространственной организации эндонуклеазы зволяет начать работы по модификации функционально важных остатков )го фермента методом направленного метагенеза. Появилась возможность ^ения комплексов фермента с различными аналогами субстратов.
Glu, Asp - специфичная протеиназа (глутамил-эндопептидаза) пользуется в пищевой, парфюмерной и медицинской промышленности, в ггаости, для приготавления мазей для заживления ран. Выращенные металлы глутамилэндопептидазы, соответствующие требованиям эуктурных исследований, и полученный набор дифракционных
отражений являются основой для определения структуры данного белі при высоком разрешении.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано б рабе Список публикаций приведен в конце автореферата.
ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, четырех гла выводов, списка цитируемой литературы. Она изложена на 159 страница содержит 25 рисунков и 10 таблиц.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались і Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилисси 1990), на X конгрессе международного Союза Кристаллографов (Бордо 1990), на V VI международных конференциях по росту кристаллов биологическі макромолекул (Сан-Диего 1991, Хиросима 1995), на II советско-испанскс симпозиуме по физике и свойствам кристаллов (Москва 1992), на ) международной конференции по росту кристаллов (Голландия 1995), і конференции по химии протеолитических ферментов (Москва 1997), на съезде Биохимического общества РАН (Москва 1997).
