Введение к работе
Актуальность проблему. В настоящее вреия научный и практический интерес к вирусам продолзшет возрастать, так как они занимают значительный удельный вес в инфекционной патологии человека и животїшх. Учёные н практики постоянно сталкиваются с необходимостью роздания надёжных методов долгосрочного хранения' вирусов без изменения их биологических свойств. Широкое проведение в нашей страна ^аиэднопрофилактини и вирусологических исследований ставит воп-; рос не только о наличии в- Государственной коллекции вирусов стандартных шиашоэ - представителей различных групп вирусов, как вта-лонов', но и о создании запасов долгосрочно храншцихся в жизнеспособном состоянии вирусов для целей биотехнологии: производства противовирусных препаратов, антигенов и гипериммунных сывороток / Селоанёва А.Ю., 1979 /.
Сохранение инфекционной активности и других биологических свойств вирусов необходимо в диагностическом материале,- взятом 0 инфицированного биологического объекта е целью выделения и идентификации инфекционного агента. Поскольку вирусы явлз$втея облигатнц-ми.внутриклеточными генетическими паразитами / Букринская А..Г., Мданов B.M.-j 1991 /, возникает настоятельная необходимость изучения влияния криоконсервирования на различные этапы внутриклеточного развития вируса с" целью создания оптимальных способоз его криоконсервирования в патологической материале.
. Шесте с теч, вирусшк) частицн представляют интерес как модельные объекты для изучения, механизмов криоповрекдения и криозащиты биологических систем, так как представляют собой единственные, известные в настоящее время неклеточные форді кизни, паразитирующие на молекулярно-генетическоы аппарате живой клетки.'
Для сохранения вирусов применяют как методи консервирования
- 4 -при положительных температурах / +2-4С / / Никитин Е.Е., Звягин И.Б., 1971 /, так и в замороженном состоянии при умеренно низких температурах / от -20 до -80С / / Харрис Р., 1956 ; %('///" О- Д975/, а также в лиофилизированноы состоянии / Ш*іП -і- ,1963; tuttA- -
, 1970 /. Однако, перечисленные способы консервирования вируса имеют сущаственныэ недостатки, ограничивающие их применение. Продолжительность хранения отдельных групп вирусов даже при температурах близких к нулю /2-4С / исчисляется несколькими днями. По данным литературы / Никитин Е.Е. и соавт., IS7I / ни один из стабилизирующих препаратов но обеспечивает 'надёжного консервирования вирусов на длительный срок пр^-и положительной температуре.
При хранении вирусов в диапазоне температур от -20 до -80С происходит значительное снижение юс инфекционной активности і//Ш-ї 1966; /if/if ' V. , 1975 /. В случае, когда хранение в данном диапазоне температур не приводит к значительному снижению инфекционной активности вирусов, восстановление их биологических свойств обеспечивается лишь после проведения ряда пассажей на животных или на клеточных культурах. Однако, #ги процессы трудоемки, недостаточно технологичны и связаны с опасностью контами-нации вирусов посторонней микрофлорой.
Применение лиофилизации ограничено Несколькими факторами. Прежде всего, замороженные суспензии некоторых' вирусов сохраняются . значительно лучше, чем лиофилизированные, где наблюдается снижение инфекционной активности на 2-3 Ц' I Фадеева Л.Л. и соавт., 1969/. В случае успешной лиофилизации- вируса, ампулы с лиофилизированным материалом с целью увеличения сроков хранения должны храниться при температуре не выше 4с. Кроме того, при использовании метода лиофилизации существует опасность появления мутаций/ VufX /I' , 1975; ftlh'tftHilit/ І98І л
Наиболее совершенным способом консервирования вирусов являет
ся замораживания до -196С и их хранение при згой температуре
/ /11і'1 , 1966; o/inuirtT.f- ГҐ.іЛ', , 1980 /.. Однако,
проблема замораживания вирусов до ультранизких теїяіератур далека от
её окончательного решения. Известные работы по изучению влияния
нрлоионсервирования на биологические свойства вирусов единичны и но
лишены противоречий. В частности, единственным критерием, по кото
рому оценивалась сохранность вирусов, был их инфекционный титр
/ tfrttff М , 1975; &r}h*rfj.M/4- I98Q;
Елесеев А.К., 1990 /. Являются малоизученными вопросы влияния скоростей замораживания на ультраструктуру и биологические свойства вирусов, воздействия ряда физико-химических факторов, сопровождающих процесс низкотемпературного консервирования,на инфекционную активность вирусных суспензий. Кроме того, отсутствуют сведения о влиянии криоконсервирования вируса на биосіштетические процес-- си в сп5еме "вирус-клетка", не изучена возможность криокон-сервирования вируса на разных стадиях его внутриклеточного развития, что имеет важное значение для успешного проведения исследований вирусеодертащего диагностического материала.
Цель работы. Целью работы было изучение криоусгойчивости вируса инфекционного ринотрахеита в зависимости от степени его очистки, продолжительности хранения в условиях гкпотерлии, умеренно-низкой температуры и жидкого азота; исследование характера крио-повреждевдй вируса, определение ведущих факторов криоповрендений, реализуемых на этапах низкотемпературного консервирования; разработка эффективных способов консервирования вируса и виру содержащего материала.
Задачи исследования: Дія выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выяснить возможность хранения вируса инфекционного ринотрахе-_
ита в условиях гипотермии и умеренно-низкой температуры.
2. Исследовать влияние различных: рейтов замораживания вируса
до температури жидкого азота на его ультраструктуру, инфекционную
активность, синтез белка и ДНК в систеые "вирус-клетка", субмикро-'
скопическую организацию клеток, инфицированных нативным к крио-
консервированннм вирусоы.
3. Определить характер влияния основных физико-химических факто
ров низкотемпературного консервирования / гипо- и гипертоническо
го, шока, температурного шока, гиперконцентрации хлорида натрия,
изменения рії среды консервирования / на инфекционную активность
вируса.
4. Изучить возможность криоконсервирования вируса на разных ета
пах его внутриклеточного развития.
Научная новизна. В ходе выполнения поставленных задач в работе впервые показано, что криоусгоЛчивость вируса зависит от его исходного состояния, в частности, от степени очистки вирусных суспензий. 7становлено, что сохранение ультраструктуры и инфекционной активности вируса зависит от применявшихся режимов замораживания. Впервые выявлено, что после криоконсервирования вируса по неоптимальным программам происходят такие изменения его ультраструктуры как: нарушение целостности липопротеидной оболочки, повреждение капсида или же полное разрушение вирусных частиц. На основании результатов изучения динамики цитопатичес-ких изменений в инфицированных клетках, их субмикроскопической организации впервые получены данные о том, что после криоконсервирования вируса как по оптимальным, так и неоптимальним программам, происходит запаздывание процесса, его репродукции, по сравнению с нативным; При атом,запаздывание репродукции криоконсер-вированного по оптимальным программам вируса не сопровождается.
снжхэнием уровня его инйекциошюй активности. Установлено, что заметное влияние на титр инфекционной активности вируса оказывают гиперконцентрации / 3-4 М / хлорида натрия и изменение рН среда ванораяивания в кислую сторону. Разработан способ криоконсерви-рования вируса с помощью оптимальных скоростей замораживания без добавленій криопротекторов, позволяющий сохранять инфекционную активность вируса без изменения в течение длительного времени -двух с половиной лет /срок наблюдения / / Авт. свид. РІ655984/. Впервые показана возможность и разработан способ криоконсервирования вируса на этапах его внутриклеточного развития.
Теоретическая и практическая значимость работе; Теоретическое значение работы состоит в экспериментально установленном факте снижения инфекционной активности вируса, что связано с разрушением вирусных частиц, нарушением целостности их липопротеидной оболочки или капсида в. процессе криоконсервирования по неоптимальним программам. В результате изучения биосинтетических процессов в системах "нативный вирус-клетка", "криоконсервированшй вирус-клетка" показано, что повреждение вирусных частиц имеет место даже в случае применения оптимальных режимов замораживания вируса, но они не столь значительны, чтобы вызвать снижение инфекционной активности.
Практическое значение работы заключается в том, что разработанный способ криоконсервирования вируса инфекционного ринотра-хеита / Авт. свид. Р 1655934 / позволяет использовать его в биотехнологии, медицине и ветеринарии^ с целью долгосрочной стабнли-заціга биологических свойств вирусав. Разработанный метод криоконсервирования вируса в чувствительной клеточной культуре на разных этапах его репродукции может бить использован для длительного сохранения вируссодеркащего диагностического материала.
' Работа выполнена в рамках исследований, проводимых в ИПКиК ЛН Украины, по планам НИ? / номер государственной регистрации 0 187.
0. 065&12, шифр теш 2.28.7.5 /.
Основные положения, выносимые на загдагу.
1. Криоустойчивость вируса инфекционного ринотрэхеита зависит от
его исходного состояния. Неочищенные вируссодержацие суспензии
б основном более стабильны, чем вирус, подвергнутый частичной
очистке.
2. Степень сохранения ультраструктурной организации и инфекционной
активности вируса, состояние биосинтетических процессов в системе
"вирус-клетка" зависит от применявшихся режимов его замораживания,
3. Среди комплекса физико-химических факторов, сопровождающих про
цесс низкотемпературного консервирования вируса существенное значе
ние в возникновении криоповреждений, по-видимому, прішадлежит гипер-'.
концентрации хлорида натрия и снижению рН среды консервирования. і
„Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых ИПКиК АН Украины "Холод в биологии и медицино" /Харьков, 1987, 1988 /; Всесоюзных рабочих совещаниях "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, млеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины" /Киев, 1987, 1990/; Республиканской конференции "Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы" / Харьков, 1990/; Республиканской конференции "Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии" /Кишнёв, 1990/; Международном симпозиуме "Вирусология, иммунология и общество" /Киев, 1991/; Международной конференции "Успехи современной криобиологии" /Харьков, 1992 /.
Публикации. .По результатам исследований опубликовано II научных работ, в том числе 2 авторских свидетельства на изобрете-
- 9 -ния и одна монография.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, б глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, содержащего 207 источников.
